Esther Miriam Zimmer Lederberg Stanford University laboratory

Dec. 18,1922 - Nov. 11, 2006

Estructura del fago

- pstM protena de membrana interna- involucrada en transporte de fosfato

Cambios contrctiles en fago T4

Adsorcin de fagos lambda a la membrana externa de E. coli

Ciclo vital del fago lambda

El fago lambda contiene un DNA lineal de 48.502 pares de bases, con una extensin 5 de cadena simple de 12 bases en ambos extremos; estas extensiones llamadas extremos cohesivos o cos son complementarias entre s. Durante la infeccin, la extensin 5 derecha (cosR), seguida por el genoma entero, entra en la clula hospedadora. Ambos cos son ligados por la DNA ligasa de E. coli, formando un DNA circular covalentemente cerrado, el cual, por accin de la DNA girasa de la bacteria, se convierte en una estructura superenrollada.

El DNA de lambda puede entrar en un estado durmiente (profago) integrndose en el genoma bacteriano en un lugar especfico por recombinacin especfica de sitio, siendo propagado junto con el hospedador en la progenie subsiguiente. Este estado es llamado lisogenia. Diferentes condiciones de estrs (como la irradiacin UV) pueden activar al profago y desencadenar un ciclo ltico. attP (por attachment, unin) es la secuencia del fago que se recombina con la correspondiente secuencia, attB, en el genoma bacteriano.

Placas de lisis formadas por el fago lambda

En el ciclo ltico, el genoma de lambda presenta dos modos de replicacin

Una vez dentro de la bacteria, el DNA del fago se circulariza y es replicado bidireccionalmente (modo theta). Ms tarde, cambia a un modo de crculo rodante (sntesis de DNA concatemrico lineal unido por extremos cos). La molcula lineal es luego empaquetada en la cabeza despus del corte de cada extremo cos por la terminasa (protena A) del fago.

Morfognesis del fago lambda

host ligase

Mapa del genoma del fago lambda

Lysis and lysogeny are controlled by the proteins encoded by cro and cI genes.
The lambda phage will remain in the lysogenic state if cI proteins predominate, but will be transformed into the lytic cycle if Cro proteins predominate cI genes transcription and translation regulate lysis/lysogeny

Morfognesis de lambda

 Para la produccin de fagos viables, el tamao del genoma de lambda debe estar entre un mnimo de 38 kb (78%) y 53 kb (105%).
El tercio central del genoma no es esencial para el crecimiento ltico.

Vectores lambda

Los vectores lambda pueden ser de dos tipos:

Vectores de sustitucin o de reemplazo: en ellos el fragmento central es removido y sustitudo por un fragmento de DNA extrao. Aceptan fragmentos de 9 a 23 kb.

Vectores de insercin: aceptan fragmentos de DNA pequeos (5-11 kb), que son introducidos sin la remocin del fragmento central no esencial.

Clonado en un vector lambda de sustitucin

Los vectores lambda de sustitucin contienen sitios de restriccin flanqueando el fragmento central.

Clonado con un vector lambda de insercin

Vectores de insercin
Contienen sitio nico para clonado de DNA Diseados para ser empaquetados con o sin DNA insertado.

Vector lambda de sustitucin EMBL3A

Digestin del vector
Ligacin selectiva de insertos de DNA digeridos con SalI

Los sitios de mltiple clonado pueden ser separados de los brazos por precipitacin diferencial con isopropanol (son pequeos y permanecen en el sobrenadante).

En este tipo de vectores se puede impedir la religacin del fragmento central y de los brazos digiriendo el fago con dos enzimas de restriccin diferentes en cada uno de los dos sitios de mltiple clonado que flanquean el fragmento central. A su vez, la ligacin de los brazos entre s puede evitarse tratndolos con fosfatasa alcalina.

Digestin parcial de un fragmento de DNA con una endonucleasa de restriccin de tipo II. Las digestiones parciales son realizadas usualmente variando ya sea el tiempo o la cantidad de enzima usada para la digestin. En algunas de las molculas de DNA la enzima ha cortado en todos los sitios (marcados como RE1). En otras molculas ha ocurrido un menor nmero de rupturas. El resultado deseado es una muestra con molculas de DNA de todas las longitudes posibles.

Produccin de fragmentos de restriccin que se solapan mediante digestin parcial de DNA genmico con Sau3A.
El uso de estos fragmentos superpuestos aumenta la probabilidad de que todas las secuencias en el DNA genmico estarn representadas en una biblioteca de lambda.

Construccin de una biblioteca genmica usando un vector lambda de sustitucin y digestin parcial con EcoRI

Construccin de una biblioteca genmica usando un vector lambda de sustitucin y digestin parcial con Sau3A

Empaquetamiento in vitro

El empaquetamiento in vitro en la cpside del fago lambda puede realizarse usando una mezcla de lisados de dos lisgenos mutantes. Ninguno de los lisgenos aislados es capaz de empaquetar el DNA del fago. La protena E es el componente principal de la cabeza del fago, y en su ausencia todos los componentes de la cpside se acumulan. La protena D est involucrada en dos procesos acoplados: insercin del DNA en la precabeza precursora y en la subsiguiente maduracin de la cabeza. Cuando los extractos se mezclan, partculas de fago maduras son producidas por complementacin.

Otro mtodo de empaquetamiento in vitro

El fago lisgeno del extracto 1 presenta una mutacin en el gen E. Este extracto contiene colas y la protena A. Para formar cabezas, le falta E.

El fago lisgeno del extracto 2 tiene una mutacin en el gen A. Este extracto contiene cabezas vacas (no pueden ser llenadas en ausencia de A).

Seleccin de fagos recombinantes

En el caso de los vectores de sustitucin, los dos brazos purificados no pueden ser empaquetados aunque se liguen entre s (estn por debajo de la longitud mnima para el empaquetamiento). Esto provee una seleccin positiva de los recombinantes. Si no se purifican previamente los brazos, se debe emplear un mtodo que seleccione slo los fagos recombinantes, eliminando los fagos no recombinantes (salvajes) reconstitudos (por ejemplo, infeccin de una cepa de E. coli lisognica para el bacterifago P2). Otro mtodo de seleccin: gen lacZ en el fragmento central (seleccin azul-blanco).

En los vectores de insercin, para la distincin entre fagos recombinantes y no recombinantes generalmente se explota la inactivacin insercional de alguna funcin biolgica (gen cI del represor de lambda, gen lacZ, etc.)

Un mtodo de seleccin de fagos recombinantes

El reemplazo del fragmento central de relleno conteniendo los genes red (formacin de multmero) y gam (switch de replicacin bidireccional a crculo rodante) en el vector de sustitucin lambda EMBL3 con insertos que tengan extremos BamHI compatibles de ~10-20 kb permite el crecimiento ltico de los fagos recombinantes en cepas de E. coli lisognicas para el bacterifago P2 (fenotipo Spi , not sensitive to P2 inhibition). Para empaquetamiento necesitan bacteria recA+ y sitios chi en el vector.

Seleccin por clonado insercional en el gen cI del vector de clonado lambda-gt10

Este vector de insercin puede aceptar insertos de DNA de ~1-5 kb. Los fagos recombinantes pueden ser seleccionados en cepas mutantes hfl (high frequency of lysogeny) de E. coli. En mutantes hflA, la expresin del gen cII de lambda es elevada, lo que resulta en la induccin transcripcional del gen cI para el represor, promoviendo la va lisognica. La interrupcin de la secuencia codificante de cI por insercin de DNA en el sitio EcoRI nico del vector bloquea el camino lisognico, lo que lleva a lisis celular y formacin de placas.

a) Inactivacin por insercin del gen Lac Z Agar + x-gal + IPTG Placas claras = recombinantes Placas azules = no recombinantes

b) Seleccin usando el fenotipo Spi Profago P2 Solo los fago recombinante puede infectar fago no recombinante no

Physical Mapping Systems

Yeast Artificial Chromosomes (YACs) 200-2000 kb

Bacteriophage P1 90 kb

Cosmids 40 kb

Bacteriophage 9-23 kb

C l o n a c i n d e l D N A

Csmido

Clonado en csmidos

El csmido es cortado en el sitio BglII cercano al sitio cos. El DNA genmico donante es cortado usando Sau3A, lo cual da extremos cohesivos compatibles con BglII. La mezcla de DNA vector y donante resulta en concatmeros.

Clonado en csmidos (continuacin)

Luego de un empaquetamiento in vitro e infeccin con los fagos resultantes, los csmidos se recircularizan dentro de la clula bacteriana y se comportan como plsmidos.

Clonado en csmidos

Concatmero de csmidos no recombinantes Segmentos de DNA extrao ligados entre s Concatmero de csmidos recombinantes

Vectores BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

Derivados del factor F, un plsmido monocopia de E. coli de alrededor de 100 kb. En el vector se conservaron slo los genes que controlan el nmero de copias (parA y parB), y la replicacin (oriS y repE). Se agregaron un gen de resistencia a antibitico (para seleccionar las bacterias que reciben BAC), y un gen lacZ con un sitio de clonado en su interior. Esto permite una seleccin azul-blanco (los plsmidos recombinantes son blancos en placas con X-Gal. Los BAC pueden aceptar insertos de hasta 300 kb y se introducen en las bacterias por electroporacin.

Clonado en BAC: los BAC recombinantes pueden ser distinguidos de los vectores ligados entre s o de los fragmentos de DNA extrao ligados entre s (stos no tienen resistencia antibitica y mueren).

El vector derivado del fago P1 permite el clonado de fragmentos de hasta 100 kb. Aqu se esquematiza el plsmido vector Ad10 que incorpora varios elementos del genoma de P1: pac, el sitio de empaquetamiento de P1, y los dos sitios loxP, reconocidos por la recombinasa del fago, producto del gen cre. El vector es digerido y se generan dos brazos, uno corto y otro largo. Fragmentos de DNA extrao, seleccionados por tamao, son ligados. Empaquetamiento in vitro, con extractos conteniendo pacasa (rompe en el pac e inserta el DNA en la cabeza, hasta que sta se llena. Se une la cola. En una cepa de E. coli con el gen cre, el producto de este gen acta en los sitios loxP produciendo un plsmido circular de bajo nmero de copias, pero que puede ser amplificado induciendo el replicn ltico de P1.

Vectores eucariticos

Permite obtener las mximas ventajas de genes eucariotas Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plsmidos + Secuencia replicadora + centrmero de levadura + (telmero levadura) Puede incorporar ms de 500 kb de DNA

Resistencia a antibitico (p.e., ampr)

Origen de replicacin del DNA de levadura (ARS) Regin centromrica (CEN)

Linealizacin (con endonucleasas) y adicin de extremos telomricos

Origen de replicacin bacteriano (ori)

Telmero

ampr

ori

CEN ARS

Telmero

Construccin de un YAC (Yeast Artificial Chromosome)

SUP4

CEN, centrmero; TEL, telmeros; ARS1, secuencia de replicacin autnoma; Amp, gen de resistencia a ampicilina; ori, origen de replicacin que funciona en E. coli. Levadura hospedadora: AB1380, es roja (mutacin en ade-2, metabolismo de adenina, acumulacin pigmento rojo). Vector lleva gen SUP4, supresor ocre, restaura la actividad de Ade-2, dando colonias incoloras. Clula hospedadora tiene adems mutaciones recesivas trp1 y ura3, complementadas por el vector (seleccin clulas con el vector YAC).

Electroforesis de campo pulstil (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoresis)

El principio de la electroforesis de campo pulstil es que los fragmentos grandes de DNA requieren ms tiempo para reorientarse y cambiar de direccin en un campo elctrico que los fragmentos pequeos. Alternando la direccin de la corriente durante la electroforesis es posible resolver fragmentos de 100 a 1000 kb.

Sistema de PFGE que usa una caja hexagonal que altera el ngulo de los campos elctricos relativo al gel de agarosa.

Cromosomas artificiales de Levadura (YAC, Yeast Artificial Chromosome) como vectores

La electroforesis de campo pulsante (PFE) permite separar fragmentos de restriccin de varios cientos de kilobases

La electroforesis de campo pulsante (PFE) puede ser usada para fraccionar por tamao cromosomas enteros. Las bandas representan cromosomas separados de S. cerevisiae. Las flechas sealan YACs con insertos del cromosoma humano 10.

Tamaos de DNA insertado comnmente obtenidos con diferentes vectores de clonado Vector de clonado Vectores plasmdicos de alto nmero de copia Bacterifago l vectores de insercin Bacterifago l vectores de reemplazo Vectores csmidos Bacterifago P1 Vectores PAC (P1 artificial chromosome) Vectores BAC (bacterial artificial chromosome) Vectores YAC (yeast artificial chromosome) Tamao del inserto 0-10 kb 0-10 kb 9- 23 kb 30- 44 kb 70- 100 kb 130- 150 kb up to 300 kb 0.2 2.0 Mb