Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial NDICE GENERAL CAPTULO I Introduccin ........................................................................................ 4 Justificacin ........................................................................................ 6 Objetivos.............................................................................................

9 Factibilidad (econmica, tcnica y operativa) .................................... 10

CAPTULO II Caracterizacin del rea ................................................................... 12 Planteamiento del problema ............................................................. 16 Alcance y limitaciones....................................................................... 18

CAPTULO III Fundamentacin terica ................................................................... 20 Panorama de la floricultura en Mxico........................................... 20 Orqudea.................................................................................... 21 Descripcin general................................................................ 21 Importancia de la orqudea ..................................................... 23 Las orqudeas ms cultivadas.................................................... 29 Cultivo de tejidos. ...................................................................... 36 Metodologa ...................................................................................... 45 Coleccin y almacenamiento de las capsulas ............................... 45 Siembra de las semillas................................................................. 45 Materiales y equipos utilizados en la germinacion ............................ 46 Esterilizacin del material del laboratorio. ..................................... 47 Preparacion de medios ms para orquideas. .................................. 47 Preparacin del medio de cultivo (sin carbono activado para inicial el proceso de germinacin) .............................................. 48 Preparacin de medio de cultivo (con carbono activado para el proceso de germinacin) ........................................................... 49 Proceso de desinfeccin cpsulas verdes ................................. 50 Proceso de corte de la cpsula .................................................. 51 Procedimiento de siembra ......................................................... 52 1

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Mantenimiento de las vitroplantas. ............................................. 54 Consideraciones para el cultivo de orqudeas: ........................... 55

CAPTULO IV Resultado y analisis de datos ........................................................... 60

Conclusiones y recomendaciones..................................................... 67 Anexos ............................................................................................. 67 Glosario ............................................................................................ 68 Referencia ........................................................................................ 77 NDICE DE FIGURAS

Fotografa del laboratorio de biotecnologa e investigacin .................. 12 Organizacin de la institucin ............................................................... 13 Instalaciones ........................................................................................ 15 Estructura de la orqudea Orqudeas - Mara Julia Freuler ................ 21 Orqudea epifita .................................................................................... 22 Orqudea semiterrestres ....................................................................... 22 Orqudea terrestre ................................................................................ 23 Desarrollo de semilla a plntula ............................................................ 43 Agente humectante TWEEN 20............................................................ 51 Agitacin mecnica de las capsulas ..................................................... 51 Proceso del corte de la cpsula............................................................ 52 Cpsula abierta de manera longitudinal ............................................... 52 Apertura de los frascos dentro de la campana ..................................... 54 siembra de las semillas con ayuda de la esptula ................................ 54 Sellado y etiquetado de los frascos ...................................................... 54 Semillas dentro del frasco .................................................................... 54 Anaquel con vitroplantas ...................................................................... 55 Vitroplantas de Guarianthe aurantiaca ................................................. 55 2

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CAPTULO I

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial INTRODUCCIN La familia Orchidaceae contiene entre 17,000 y 35,000 especies (Atwood, 1986; Dressler, 1993; Stewart y Griffiths, 1995), muchas de las cuales pasan desapercibidas por ser muy pequeas, por tener flores poco llamativas o por su ubicacin en las copas de rboles grandes o peascos inaccesibles, se encuentra en varios hbitats, inclusive en potreros y cafetales, todas estas orqudeas tienen una distribucin mundial, Mxico y otras partes de Centro Amrica albergan muchas de estas especies. Son varias las especies de orqudeas con un valor actual o potencial en el mercado de plantas de ornato, sin embargo, se dificulta la reproduccin de las orqudeas por semilla, porque stas son diminutas y en la mayora de los casos, se requiere de la simbiosis con un hongo micorrzico para que la semilla germine (Arditti, 1984, Hadley, 1997); aunque para orqudeas terrestres ha habido avances importantes en cuanto a la germinacin simbitica, los avances para las orqudeas epfitas son pocos. Por otro lado, el trfico y comercio ilegal de flora y fauna silvestre estn considerados como el tercer tipo de negocio ilcito ms lucrativo del mundo, y es un negocio creciente en la actualidad con ganancias superiores a los 20 mil millones de dlares al ao, de acuerdo a la informacin de la interpol (Organizacin Internacional De Polica Criminal) (INTERPOL, 2008), el trfico y comercio ilegal de vida silvestre no es una actividad nueva ni ocurre solo en una regin, se trata de un problema que impacta directamente sobre la calidad y cantidad de especies vivientes, y en el equilibrio de los ecosistemas que los albergan. Tal es el caso de Mxico donde, el comercio ilegal de estas especies la ha puesto en categora de riesgo segn su registro NOM-059-ECOL-2001 181. La germinacin in vitro de semillas es muy importante para la produccin comercial de muchas especies e hbridos de orqudeas (Arditti y Ernst, 1993), siendo la nica manera de 4

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial aprovechar las semillas, la primera propagacin exitosa de orqudeas in vitro mediante la germinacin de semillas en medios de cultivo fue lograda por Knudson (1922) con especies de Cattleya y Laelia en agar,es difcil encontrar antecedentes en la literatura sobre los resultados de intentos previos de propagar cada especie de orqudea en diferentes medios de cultivo; existe informacin sobre pocas especies nada ms, bsicamente de valor comercial. La nica opcin ha sido aplicar mtodos reportados en la literatura para la propagacin de especies de orqudeas del mismo gnero, aun cuando se sabe que las diferencias entre especies puedan ser marcadas. La literatura menciona intentos de propagacin de especies como Encyclia cochleata y Cattleya aurantiaca en el medio de cultivo Knudson. En el caso del gnero Brassavola, no hay reportes al respecto. La aplicacin de las tcnicas de cultivo de tejido vegetal, ofrecen grandes posibilidades para la multiplicacin masiva y rpida en muchos y diferentes tipos de plantas; su aplicacin ha estado encaminada principalmente a especies en peligro de extincin (Mata et al., 2001). El cultivo in vitro se perfila como una serie de tcnicas alternativas para la reproduccin de orqudeas bajo condiciones aspticas controladas. La propagacin masiva in vitro de orqudeas, ya sea por medio de semillas o tejidos, produce altos niveles de multiplicacin en periodos de tiempo cortos, adems de que se asegura la sanidad del material de multiplicacin y se puede conservar en pequeos espacios una gran cantidad de germoplasma todo esto sin mencionar que se obtienen clones de una variedad selecta. El presente trabajo tiene como objetivo establecer un protocolo de germinacin de orqudeas (Brassavola spp. x Cattleya spp., Guarianthe aurantiaca, Cattleya spp. Blanca, Encyclia spp.y Phalaenopsis spp.) mediante procesos in vitro a escala pre comercial.

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial JUSTIFICACIN Las Orqudeas son unas plantas fascinantes. Sus flores poseen formas extrasimas y exticas al tiempo que supone un reto cultivar y hacer florecer ao tras ao a determinadas especies. Actualmente, la recoleccin de orqudeas silvestres est prohibida de la casi totalidad de especies. Muchas de ellas se encuentran en peligro de extincin. Las que se venden son principalmente hbridos cultivados a partir de semillas en invernaderos. Los viveristas continuamente sacan al mercado nuevos hbridos ms adaptados a vivir en los hogares y con flores espectaculares. Tienen fama, en general, de cultivo difcil, especialmente para hacer que vuelvan a florecer, las especies ms destacadas gracias a su nivel de comercializacin son las del gnero Cymbidium, Cattleya, Phalaenopsis y Dendrobium. La familia botnica Orchidaceae (Orqudeas) es la que mayor nmero de especies comprende en el Reino Vegetal. Se estima que debe haber alrededor de 35.000 especies de Orqudeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 Gneros distintos, adems de miles de hbridos (cada ao se registran decenas de hbridos nuevos). La mayora de especies se dan en climas tropicales y subtropicales. En Mxico, todas las regiones situadas al sur del Trpico de Cncer, desde las costas del Pacfico y las del Golfo hasta las regiones que rebasan los 3 500 m sobre el nivel del mar en los estados de Michoacn, Guerrero, Oaxaca, Veracruz y Chiapas albergan la mayor riqueza de orqudeas, aunque todos los estados cuentan por lo menos con una especie. En estos estados son conocidas con nombres populares que aluden ya sea a la poca en que florecen, a festividades religiosas o bien a la 6

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial forma que asemeja la flor, por ejemplo torito, calaverita, flor de mayo, flor de Candelaria, flor de muerto, entre otros. Aunque el nmero de especies mexicanas es menor que el de otros pases Amrica tropical (Colombia, Ecuador, Per, Brasil, etc.), Mxico cuenta con un conocimiento taxonmico ms avanzado de sus especies. En un estudio realizado en 1995, Miguel ngel Soto, investigador dedicado al estudio de las orqudeas, habla de 1 106 especies y subespecies mexicanas descritas, distribuidas en 159 gneros. De stas, seala: "Existen 444 especies o subespecies endmicas, las cuales corresponden a 40% del total registrado en el pas. Esta caracterstica convierte a la orquideoflora mexicana, en una de las ms ricas en endemismos entre los principales pases de Amrica tropical, quizs slo superada por Brasil". Las orqudeas se concentran generalmente en reas muy especficas, que son importantes por la riqueza y diversidad de sus poblaciones o por sus endemismos. Se estima que en Mxico existen seis reas muy diversas, con menos de 100,000 ha cada una, localizadas en diferentes regiones florsticas del pas, las cuales poseen 50% del total de orqudeas registrado y que representan tan solo 0.003% del territorio mexicano. Es muy importante identificar y conocer muy bien dichos centros y enfocar hacia ellos los planes de conservacin". Por otra parte, es necesario impulsar el cultivo y propagacin, especialmente de las especies que por ser de gran inters ornamental en la actualidad cuentan con escasas poblaciones, debido a la colecta inmoderada que han sufrido en el pasado. Las orqudeas producen miles de semillas en cada flor, algunas incluso millones, si bien la reproduccin mediante ellas es complicada, pues se suelen necesitar materiales de laboratorio para asegurar una necesaria asepsia. Por otro lado, las semillas casi no tienen sustancias de reserva, por lo que necesitan de la pronta simbiosis de un hongo para sobrevivir 7

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial (micorrizas con hongos del gnero Rhizoctonia), y normalmente las tcnicas para micorrizar son complejas. Tambin de forma comercial se recurre a tcnicas de reproduccin "in vitro". El cultivo in vitro del fino polvo de las semillas de este especie ornamental, permite obtener un conjunto de vigorosas plantas en un tiempo ms corto a como suele suceder en un ambiente natural. El xito definitivo se alcanza con una adecuada seleccin y esterilizacin de las semillas a sembrar en un medio nutritivo inorgnico y, posteriormente, con el grado de adaptabilidad de las vitroplantas en su medio (a) bitico. Teniendo en consideracin la importancia comercial y el gran valor natural que tiene la orqudea se toman como justificantes los siguientes puntos: El laboratorio de Unidad de Investigacin en Biotecnologa Vegetal (UNIBVE) tiene el potencial para realizar proyectos que involucran la aplicacin de mtodos de cultivo de tejidos. Existe un mercado muy grande econmicamente referido por la produccin y venta de orqudeas a nivel mundial. La ejecucin de este proyecto va a permitir evaluar a escala pre comercial la viabilidad de proyectos de este tipo.

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial OBJETIVOS

Objetivo general Establecer un protocolo de multiplicacin de alta demanda comercial usando mtodos de propagacin in vitro para orqudeas.

Objetivos especficos 1. Realizar investigacin documental y colectar material biolgico el cual ser propagado (Brassavola spp. x Cattleya spp., Guarianthe aurantiaca, Cattleya spp. Blanca, Encyclia spp.y Phalaenopsis spp.) para evaluar tcnicas de produccin en base a los medios enriquecidos por hormonas que beneficien a los productores y que sirvan para un proyecto ms grande. 2. Establecer cultivos axnicos que permitan el establecimiento de cultivos in vitro. 3. Establecer las condiciones ptimas para la multiplicacin de orqudeas, usando las hormonas bencil amino purina y cido naftaln actico. 4. Recopilar y analizar los datos generados para elaborar un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial.

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial FACTIBILIDAD (ECONMICA, TCNICA Y OPERATIVA) Factibilidad Econmica: En el laboratorio se cuenta con el apoyo gubernamental (COSNET CONACYT) para llevar a cabo proyectos. Se cuenta con recursos econmicos para poder adquirir artculos y reactivos, equipos indispensables y as tambin las tcnicas de cultivo in vitro Se cuenta con tcnicas validadas sobre el cultivo de tejido vegetal, as como asesores capacitados para llevar a cabo cada uno de los proyectos y procesos que involucren. La unidad de investigacin en Biotecnologa Vegetal cuenta con servicios de luz, gas, agua, telfono, internet, reactivos, mobiliario y equipos de trabajo.

Factibilidad Tcnica:

Factibilidad Operativa:

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CAPTULO II

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial CARACTERIZACIN DEL REA El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de la Unidad de Biotecnologa Vegetal del Instituto Tecnolgico Superior de Acayucan. Carretera Costera del Golfo Km. 216.4 Col. Agrcola Michapan, Acayucan, Ver. Desviacin a Montegrande. C.P. 96100. Tel (924) 24 57410. Bajo la asesora del doctor Jos Antonio Gonzlez Rodrguez y la Biloga Yolanda Retama Ortiz.

Figura 1. Fotografa del laboratorio de biotecnologa e investigacin

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

Direccin

Subdireccin Academica

Subdireccin Administrativa

Subdireccin de Planeacin Departamento de Servicios Escolares

Departamento de Desarrollo Academico Divicion de Estudios Profecionales Jefatura de Ingenieria en Sistemas Jefatura de Licenciatura en Informatica Jefatura de Ingenieria Bioquimica

Unidad de Investigacin en Biotecnologia Vegetal (UNIBVE)

Figura 2. Organizacin de la institucin

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial La biotecnologa es una ciencia que involucra varias disciplinas y ciencias (Biologa, Bioqumica, Gentica, Virologa, Agronoma, Ingeniera, Qumica, Medicina y Veterinaria entre otras). Junto con los cambios ambientales, el hombre ha transformado y empobrecido la diversidad por el uso que ha hecho de la naturaleza y por como lo ha hecho. La conservacin de la naturaleza se reconoce, como uno de nuestros compromisos inexcusables, desde el plano individual hasta las colectividades y las entidades polticas. Y un instrumento capital para llevar a cabo las acciones derivadas de ese compromiso es la biotecnologa vegetal, como mtodo de conservacin "ex situ" (Dimary Libreros Ferla). Para conseguir la conservacin de determinadas especies nadie pone en duda la conservacin de su hbitat en su estado natural o lo que es lo mismo la llamada conservacin "in situ"; sin embargo, tambin es posible la conservacin "ex situ" de recursos fitogenticos mediante la biotecnologa vegetal, como un conjunto de tcnicas, que tienen por finalidad el mantenimiento de colecciones vegetales fuera de su hbitat natural, ya sea en forma de ejemplares completos o parte de ellos, tales como semillas, polen, etc. Mediante la biotecnologa vegetal se obtienen las colecciones " in vitro", tambin denominados bancos de tejidos, pudiendo conservar plantas sobre medios artificiales y en condiciones aspticas. Estas colecciones pueden ser mantenidas durante periodos ms o menos largos, teniendo como fin ltimo el retorno al medio natural (restitucin) para conseguir restaurar los sistemas suelo-planta manteniendo la biodiversidad y riqueza de esa regin. En esta restauracin es necesario tambin considerar los microorganismos de la rizosfera, entre los que destacan por sus efectos beneficiosos, los hongos simbiontes micorrzico (Caballero et al, 2001).

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Descripcin fsica del laboratorio

Figura 3. Instalaciones

a) b) c) d) e) f)

Aduana Cubculo de investigador N 1 Cubculo de investigador N 2 Cubculo de investigador N 3 Refrigerador Mesa de trabajo (Balanzas y Potencimetros) g) Mesa de trabajo N 1 h) Mesa de trabajo N 2 i) Mesa de trabajo N 3 j) Estante de material de vidrio N 1 k) Lavabos l) Zona de Campanas de Flujo Laminar para Biotecnologa

m) rea de incubacin n) rea de esterilizado o) Zona de Campanas de Flujo Laminar para Biologa molecular p) Cuarto Oscuro q) Cuarto Frio r) Mesa de trabajo N 4 s) Estante de material de vidrio N 2 t) Cubculo de investigador N 4 u) Cubculo de investigador N 5 v) Cubculo de investigador N 6

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Nuestro pas posee una gran diversidad de climas y habitas y tipo de vegetacin, es uno de los pases del mundo con mayor diversidad de plantas. La familia Orchidaceae, es una de las ms diversas, pero tambin de las ms vulnerables por la destruccin de su hbitat y la gran extraccin a la que est sujeta, por el gran inters comercial que ha despertado desde hace muchos aos. En Mxico existen diversos invernaderos especializados en la produccin y venta de orqudeas, sobre todo para la exportacin, ya sea como planta o flor cortada. Pero tristemente, ver en nuestros mercados la venta de diversas especies de recoleccin ilcita, que han sido extradas sin control, muchas veces pone en riesgo su poblacin. Entre las principales razones de practicar una reproduccin artificial se encuentra el delicado y prolongado ciclo de reproduccin en estado natural, adems de que las semillas de orqudeas son muy pequeas y contienen muy poca o ninguna reserva alimenticia para que se pueda llevar a la germinacin, es por ello que dependen de la naturaleza simbitica de un hongo. La produccin de orqudeas bajo condiciones naturales es difcil, principalmente por la baja tasa de fertilizacin de los vulos, ya que las semillas requieren condiciones especiales y muy particulares, y solo entre el 2 y 5% germinan (Arditti y Lawrence, 1964). Sin embargo, con el cultivo in vitro de embriones se tiene control de las condiciones ambientales y de los medios de cultivo, obteniendo plantas orqudea en condiciones controladas (Minea, 2004). Con la propagacin in vitro, se logra conseguir una produccin de orqudea de forma masiva a partir de las semillas. Con esto, se puede mantener una produccin continua. 16

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Para ello es necesario utilizar tcnicas de cultivo in vitro y de micropropagacin debido a que un explante puede producir un infinito nmero de plantas dando como resultado satisfactoriamente plantas libres de patgenos y que garantice una mejor produccin de explantes, dependiendo de la calidad de las semillas y su estado, una capsula podra llegar a producir 5,000 a 50,000 plantas para el mercado.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial ALCANCE Y LIMITACIONES En los ltimos aos las orqudeas han despertado el inters a inversionistas, comerciantes nacionales y extranjeros, sin embargo se ha identificado que en Mxico y otros pases existe un saqueo indiscriminado de especies nativas de orqudeas provocando la explotacin desordenada y el deterioro sistemtico de los ecosistema naturales por ello contribuye a reducir las poblaciones de orqudeas. Con la realizacin del proyecto, se plantea establecer un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial.

Limitaciones La falta de materia prima para la realizacin de las siembras ya que no se cont con los recursos econmicos para solventar gastos. La falta de tiempo necesario para aplicar ms tcnicas de propagacin, analizar si son efectivas y porcentaje de prendimiento en plantas.

Alcances Evaluar tcnicas de produccin en base a los medios enriquecidos por hormonas que beneficien a los productores y que sirvan para un proyecto ms grande. Tener un informe para generar datos que aporten el desarrollo de a nivel comercial de las orqudeas. Disponer de mtodos exitosos.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

CAPTULO III

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial FUNDAMENTACIN TERICA PANORAMA DE LA FLORICULTURA EN MXICO. En el campo de la floricultura Mxico tiene un gran potencial, gracias a las favorables condiciones climticas de algunas regiones para el desarrollo de la actividad y la cercana geogrfica con Estados Unidos, segundo consumidor de flores en el mundo, lo cual le permite enviar su producto va terrestre y mantenerlo en agua, garantizando la calidad de ste, lo que no pueden hacer pases que son grandes productores. Sin embargo, frente a este positivo panorama los productores deben consolidar su organizacin productiva, alcanzar altos grados de tecnificacin, donde se requieren fuertes inversiones, y emplear adecuadas prcticas en el cultivo y manejo poscosecha de flores, por medio de la capacitacin. La posibilidad de crecer en este sector en el mbito local es amplia, y hacia el mercado exportador es complicada, ya que naciones como Holanda y Alemania tienen una tradicin de varios aos que los ha llevado a ocupar los primeros lugares en el mundo.(Chih-Liang et al., 2004) Entre los factores que inciden en el atraso de la floricultura mexicana est el desarrollo econmico del pas y la reciente integracin de Mxico en estados como Veracruz, Puebla, Tabasco, Chiapas, y Yucatn solo por mencionar algunos adems el tamao del tallo; la forma, tamao, color, nmero de hojas de la flor y los ptalos (forma) adems es muy importante la duracin de esta. A pesar de que el sector florcola mexicano no se ha desarrollado mucho en los ltimos aos, este sector representa una gran oportunidad de comercio para Mxico (www.teoraambiental.com).

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial ORQUDEA. La palabra orqudea deriva del griego (orchis = testculo). Tal vocablo hace referencia a la forma de los tubrculos, cuyos tubrculos dobles parecen testculos.

Figura 4. Estructura de la orqudea Orqudeas - Mara Julia Freuler Descripcin general Las Orqudeas pertenecientes a la familia botnica de las Orchidaceae, comprenden aproximadamente 25.000 (algunas fuentes informan de 30.000) especies, y quiz otros 60.000 hbridos y variedades producidas por horticultores, extendidas por todo el mundo, pero 21

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial particularmente abundantes en las regiones tropicales, vulgarmente se llaman orqudeas, debido a su complejidad floral, a sus interacciones con los agentes polinizadores y a sus simbiosis con hongos para formar micorrizas, y por ello estn consideradas como la culminacin de la evolucin floral. Tipos de orqudeas Podemos clasificar orqudeas en: a las

1. Epfitas. 2. Semiterrestres. 3. Terrestres. 4. Las Orqudeas epfitas: constituyen ms del 90% del total de especies. Cuelgan de rboles o de arbustos (Figura 5). Son las ms vistosas y las que encontramos a la venta normalmente. Proceden de las regiones tropicales. No son parsitas. Sus necesidades son escasas y obtienen el agua de la humedad del aire con races areas.

Figura 5. Orqudea epifita

Orqudeas Semiterrestres: Las Orqudeas semiterrestres crecen sobre un colchn de hojas en descomposicin en el suelo o sobre piedras recubiertas de musgo.

Figura 6. Orqudea 22

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial semiterrestres

Orqudeas terrestres: Las Orqudeas terrestres tienen sus races en tierra y viven como la mayor parte de las plantas.

Figura 7. Orqudea terrestre

Importancia de la orqudea La orqudea es una de las flores que ms han sufrido la sobreexplotacin, la contaminacin y la industrializacin de la agricultura han sido algunos causantes de la progresiva desaparicin de las orqudeas y, en general de la prdida. Pero la primera causa es la explotan ilegalmente de las orqudeas por eso es importante utilizar herramientas para la germinacin de orqudeas. Mediante la biotecnologa de cultivo de tejido vegetal podemos utilizar tcnica in vitro. Debido a su belleza y al elevado coste que alcanzan las orqudeas actualmente, son motivo de cultivo por particulares e industriales como flor cortada y como planta ornamental, por ello tiene una importancia econmica a nivel mundial. Las orqudeas pertenecen a la familia de las orquidceas es la ms grande del reino vegetal, con cerca de 30.000 especies diferentes y variedades producidas por horticultores. Extendidas por todo el mundo, pero particularmente abundantes en las regiones tropicales pero tambin estn concentradas en selvas tropicales lluviosas y hmedas 23

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial situadas a una altura de entre 914 y 2.740 metros, de hecho la variedad de orqudeas se extiende desde el extremo sur de Sudamrica, frica, Australia y norte de Nueva Zelanda hasta el Circulo rtico y desde las planicies hasta las costas alpinas (Arditii 1977). En tan gran nmero de especies, existen variadsimas formas, condiciones de cultivo, climas, etc., pero todas estn agrupadas en una sola familia, es importante conocer su vida silvestre, sus caractersticas botnicas, sus necesidades fisiolgicas de luz, alimento, humedad, con lo que se logra un adecuado cultivo y las maravillosas posibilidades creativas que se presentan en la reproduccin por semillas, especialmente por hibridacin. En botnica el reino vegetal est dividido en grupos, as la primera gran divisin se denomina Phylum y se refiere a si la planta posee o no flor, todas las plantas que posean flor se agrupan en el Phylum: Fanergamas Las fanergamas pueden presentar la semilla cubierta o descubierta. Si est cubierta se dice que forman el siguiente subgrupo: angiospermas (angio- vaso, sperma- semilla). Muchas son terrestres (enraizadas en la tierra), otras epifitas (que crecen, no de forma parasita, sobre los tallos de otras plantas) y el resto litfitas (que crecen en la superficie de una roca). (Harman Walter I. Mxico 1971) La mayora de las orqudeas siguen uno o dos patrones de crecimiento: simpodial y monopodial. El ms comn es el crecimiento simpodial, que tiene varios tallos o pseudobulbos que brotan de un rizoma trepador, que, a su vez, es un tallo modificado. Las plantas monopodiales tiene un nico tallo principal que no origina otros nuevos desde su base, pero que va aadiendo hojas nuevas hacia arriba. Los tallos florales y las races areas brotan de entre hojas, y el 24

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial tallo de algunas especies se ramifica desde las yemas, en la axila de la hoja. A pesar de la compleja apariencia de muchas de las orqudeas, en realidad su estructura es muy simple. Consiste en tres partes externas llamadas spalos, y tres internas o ptalos. Los dos ptalos superiores son idnticos, mientras que el inferior, el labelo, esta tan modificado que resulta bastante diferente de los otros. El labelo suele tener su propia forma y coloracin, con crestas adornadas, rebordes, flecos, cuernos u otros rasgos. La columna suele definir la caracterstica de una especie constituida por la fusin de las partes reproductoras situadas dentro de la flor. La flor es un rgano muy complejo evolucionado para la reproduccin y la columna posee todos los rganos sexuales fusionados, hecho principal que caracteriza la familia de las orqudeas. Su principal parte femenina es el estigma que se contina con un tubo polnico el cual desemboca en el ovario. El polen, principal parte masculina esta agrupado en polinios en la mayora de las orqudeas y se encuentra en el extremo inferior de la columna protegido por la antera. Una de las especies ms importantes es la Brassavola nodosa (Orqudea dama de noche). Es una especie de orqudeas epifita, a veces litfitas de la subtribu Laeliinae de la familia Orchidaceae del genero Brassavola. Se encuentra en Mxico, Colombia, y Venezuela, donde por las noches llena el aire con las fragancias de su perfume parecido a los ctricos. Y otro pases como Centroamrica, Belice, Guatemala, El Salvador, Honduras, Costa Rica, Panam, , Ecuador, Per, Puerto Rico, Trinidad & Tobago, Guyana y Jamaica. Importancia econmica y distribucin geogrfica 25

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Algunos gneros de la familia de las orqudeas son objeto de cultivos importantes; se trata, no obstante de cultivos muy especializados. Su cultivo es posible en todas partes y est especialmente desarrollado desde la mitad del siglo pasado porque muchos hbridos interespecificos e intergenricos fueron creados y comercializados con xito por sus obtentores. La explotacin comercial para flor cortada y el cultivo en maceta afecta a unos cincuenta gneros cuyo cultivo se practica en muchos pases. Entre los principales pases productores de orqudeas cabe destacar: Brasil, China, Costa Rica, Estados Unidos, Filipinas, Indonesia, Pases Bajos y Tailandia. El aumento de la demanda en los pases industrializados ofrece una oportunidad para el desarrollo de mercados de exportacin en otros pases en desarrollo tanto en Asia Sudoriental como en Sudamrica. Taxonoma y morfologa Las orqudeas son plantas monocotiledneas pertenecientes a la familia Orchidaceae, la ms vasta del reino vegetal, ya que cuenta con 700 gneros con unas 28.000 especies botnicas distribuidas sobre toda la superficie de la Tierra. Si a esto le aadimos la enorme cantidad de hbridos entre especies e incluso entre gneros distintos, nos encontramos en un campo de enormes posibilidades. Esta familia de plantas es la que ofrece las caractersticas ms avanzadas desde el punto de vista evolutivo, motivo por el cual se encuentra en pleno proceso de diversificacin, circunstancia que se ve reflejada en la abundancia y diversidad de especies. Encontramos orqudeas terrestres, litfitas, pero la mayora son epfitas. Las orqudeas no son plantas que crezcan comnmente en Europa, a excepcin de las orqudeas terrestres cuyo sistema radicular se 26

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial encuentra bajo tierra, estas crecen en bosques abiertos, prados, o incluso mrgenes de riachuelos o lagos ricos en humus. La mayora de las orqudeas se concentra en bosques tropicales, donde la densa vegetacin impide el paso a la luz, por este motivo muchas de ellas se han vuelto epfitas y se localizan en zonas de la Tierra lluviosas y hmedas como las grandes selvas de Sudamrica, Australia, Nueva Zelanda, etc. La belleza de las flores contrasta con su simplicidad. La flor de la orqudea es hermafrodita, zigomorfa, trmeras (3 spalos y 3 ptalos) y una columna central que sustenta las anteras y el pistilo llamada ginostemo. Los dos ptalos superiores son idnticos, pero el inferior, el labelo, se ha transformado en la estructura ms llamativa de la flor, con sus propios colores, formas y tamaos que pueden ser muy diferentes en funcin de la especie que se trate. Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencias y son polinizadas por insectos. Las orqudeas tienen unas caractersticas de reproduccin propias y a veces imitan las formas de los insectos polinizadores necesarios para su difusin y supervivencia. Los estambres y pistilos habituales en otras plantas, se han fusionado en una nica estructura llamada columna, localizada en el centro de la flor. La columna tiene una antera portadora de polen y un estigma femenino que segrega un fluido pegajoso hacia el interior de la flor. Los insectos son atrados por ese nctar, y al intentar salir de la flor quedan impregnados con el polen de las anteras. Al visitar la siguiente flor de la misma especie efectan el mismo recorrido y el estigma recibe el polen, efectundose as la polinizacin. Se trata de un mecanismo muy avanzado y que implica una evolucin paralela entre las orqudeas y los insectos que visitan sus flores. El fruto es un cpsula seca con numerosas semillas pequeas, sin endospermo y con embrin no diferenciado. 27

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial La mayora de las orqudeas siguen dos patrones de crecimiento: Crecimiento monopodial: tienen un nico tallo, del que van naciendo nuevas hojas por pice, y de entre ellas nacen el tallo floral y las races areas (Phalaenopsis). Crecimiento simpodial: tienen varios tallos o pseudobulbos que brotan de un rizoma. Los nuevos tallos crecen desde la base del tallo del ao anterior, y generalmente las flores nacen del nuevo tallo (Cymbidium, Cattleya).

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial LAS ORQUDEAS MS CULTIVADAS Gnero Cymbidium Son las orqudeas ms cultivadas de todo el mundo gracias a su fcil cultivo y al gran nmero de hbridos, siendo Holanda y Francia los principales pases productores. Es una orqudea con pseudobulbo (rgano situado en la base de las hojas y constituido por tejidos acuferos y con epidermis desprovista de estomas). Cada pseudobulbo produce de ocho a diez hojas angostas y largas y vigorosas races. Sus hojas son alargadas y las flores estn reunidas en racimos erguidos (20-80 cm y ms), los tallos estn transformados en rizomas ms o menos areos; las races son carnosas, poco ramificadas y juegan un papel muy importante en la alimentacin hdrica: el tejido blanco que les recubre absorbe tanto el agua de escurrimiento como la humedad atmosfrica. Existen dos grupos de hbridos: unos con grandes flores y otros miniaturas. Pudiendo ser en ambos casos las flores de diferentes colores: rosa, rojo, blanco, amarillo, verde, etc. (siendo todos de tonos pastel). Las variedades de Cymbidium se clasifican en funcin de su precocidad, existiendo los tipos tempranos, que comienzan a florecer en noviembre, hasta los tardos que comienzan a florecer en febreromarzo. Origen: Es originario de Asia. Crecen en hbitats soleados de altura, desde la India hasta Japn y Australia. Multiplicacin: 29

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Tradicional: siembras simbiticas y siembras asimbiticas in vitro. Cultivo de meristemos: permite controlar el estado sanitario de las plantas (virosis) y la obtencin de una descendencia homognea con una floracin en un tiempo ms corto (normalmente despus de tres aos de cultivo). Divisin de plantas: se utiliza en el cultivo en maceta. Se dividen las plantas que han estado varios aos en cultivo para flor cortada, cuando es preciso renovar la plantacin o cambiar de variedad. Se cogen de 3 a 5 pseudobulbos y se colocan en macetas de 14-16 cm. Requerimientos Edafoclimticos: Se distinguen dos fases en su ciclo anual de vegetacin: Periodo estival: aplicar una temperatura nocturna baja (14C como mximo) para forzar la formacin de las yemas florales. La temperatura diurna mxima ser de 28C con iluminacin normal. La floracin es, por tanto, desencadenada por el fotoperiodo. En ocasiones la temperatura estival es controlada por cooling-system. Periodos otoal e invernal: para la floracin ser necesario tener una temperatura alrededor de 12 a 15C. Si la temperatura no sube excesivamente, la luz debe ser elevada, de 40.000 a 50.000 lux. En el caso de elevarse excesivamente las temperaturas, tendr lugar la cada de las hojas y la floracin se ver afectada. Las caractersticas del sustrato ideal para el cultivo de las orqudeas son: buen drenaje, buena retencin de agua y facilidad de penetracin 30

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial de las races, al ser stas carnosas y fasciculadas. Se recomienda un pH de 5 a 6. Los Cymbidium son de las pocas orqudeas de hbito terrestre, no epfita. Por tanto, se adapta relativamente bien a un buen nmero de sustratos. Ejemplo de sustrato para Cymbidium: Corteza de conferas: 60%. Turbia rubia: 20% Polyestireno granulado: 20% en una capa de 1-2 cm colocado como drenaje en el fondo de la maceta. Abonado: En periodo estival (despus de la floracin): 1 g/l de 18-12-18 cada diez das. Una vez cada 6 semanas deben incorporarse microelementos. Riego: Se darn riegos regulares, de forma que se mantenga siempre hmedo el sustrato, evitando los encharcamientos. Se recomienda pulverizar las hojas diariamente en verano. El cultivo en umbrculo funciona muy bien en la mayora de las zonas costeras protegidas. Floracin: Se proceder al entutorado de las ramas florales, ya que las varas florales son ms altas que el follaje. Segn los hbridos y cultivares la recoleccin de las flores se efecta de noviembre a mayo.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Gnero Cattleya Gnero designado en honor a W. Cattley de Barnet, uno de los primeros amateurs que cre una coleccin privada de orqudeas. Bajo esta denominacin se encuentran los hbridos intergenricos: Laeliocattleya. Brassocattleya. Brassolaeliocattleya. Son orqudeas epfitas con pseudobulbos (proporcionan una defensa contra la sequa peridica), hojas oblongas gruesas con nervadura central hundida, tallos delgados, flores elegantes agrupadas en dos, tres o ms con diferentes colores: malva, rosa, rojo, blanco, amarillo y bicolores. Las races son gruesas, carnosas y de desarrollo superficial. Los spalos libres e iguales entre s, generalmente extendidos; ptalos ms anchos o iguales a los spalos. Origen: Bosques hmedos de Amrica del Sur y Amrica Central, donde viven como epfitas. Requerimientos edafoclimticos: Al tratarse de una planta epfita de las regiones tropicales o ecuatoriales exige condiciones climticas de invernadero con calefaccin (17-18C durante la noche y 28C durante el da, con una humedad relativa del 80%), siendo preciso una buena aireacin en verano. La floracin est determinada por el fotoperiodo en algunos hbridos. Se trata de plantas de das cortos y es posible adelantar o retrasar la floracin. El tratamiento fotoperidico consta de 8 a 10 semanas de das cortos (3-6 horas/noche) con temperatura prxima a los 15C. 32

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Ejemplo de sustrato empleado en Cattleya: Corteza de conferas (70%). Turba (20%). Poliestireno o perlita (10%). Conviene un sustrato poroso, de fcil escurrimiento del agua de riego, donde las races encuentren suficiente circulacin de aire. El pH debe oscilar entre 5 y 6. Abonado: Se aportarn abonados solubles a bajas concentraciones (0.5-1o/oo de 14-10-14 cada 15 das). Riego: Se darn riegos abundantes, sobre todo despus de aplicar los abonos solubles, para evitar los excesos de salinidad. Trasplantes: Si el cultivo se realiza en macetas pequeas, pueden trasplantarse a macetas del 12 o incluso del 16. Floracin: De noviembre a marzo.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Gnero Phalaenopsis Las Phalaenopsis cultivadas son hbridos derivados de una veintena de especies. Son orqudeas sin pseudobulbo, tienen races largas y carnosas, con hojas parecidas a la Cattleya. Al carecer de pseudobulbos los brotes emergen del rizoma central monopodial y las hojas tienen cierta capacidad de retencin de agua. Las hojas son de color verde oscuro, moteado o con manchas azul grisceo. Las flores estn agrupadas en racimos, que nacen en la axila de las hojas. Pueden ser de color: blanco, rosa, malva y amarillo (las flores pueden ser rayadas o manchadas). Ocasionalmente si se daa el meristemo apical, ya sea por pudricin o por efectos mecnicos, la planta puede producir brotes laterales para reanudar el crecimiento; algunas especies tienen ms predisposicin a este comportamiento que otras. Origen: Zonas tropicales y ecuatoriales del Sudeste de Asia y Australia. Generalmente crecen a baja altitud, de forma epfita, situadas en la parte baja de rboles con pocas hojas y en general cerca de cursos de agua. Algunas especies crecen de forma litoftica sobre rocas cubiertas de musgo. Requerimientos edafoclimticos: Son plantas ms exigentes en temperatura que Cymbidium. La temperatura ptima de crecimiento es de 20-25C, una vez transcurridas 3-4 semanas a 10-12C se induce la floracin. La luz idnea est entre los 15.000 y 20.000 lux. Es necesaria una humedad ambiental alrededor del 60%. Si el ambiente es ms seco, la planta sufre desecacin y puede provocar la cada de la flor; en cambio, 34

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial si el ambiente es demasiado hmedo, pueden aparecer enfermedades fngicas. El sustrato a base de turba y cortezas de pino es el ms apropiado. En el caso del cultivo en maceta el tamao de esta es muy importante. En una maceta pequea la planta est bien compactada dentro del contenedor y crece mucho mejor en su interior que en una maceta ms grande. El uso de macetas transparentes se ha extendido mucho entre los productores de orqudeas, ya que por un lado favorece a la planta, pues sus races son areas y estn acostumbradas a la incidencia de luz y por otro lado permite al productor poder observar en cualquier momento el estado de las races y poder hacer un diagnostico de su estado de salud. Riego: Se darn riegos abundantes. Pulverizar las races expuestas, as como las plantas en verano. Multiplicacin: in vitro: es preciso un laboratorio especializado. Se puede tratar la planta una vez que ha florecido con benziladenina a 3.000-5.000 ppm, con el objetivo de inducir brotes en la base de la inflorescencia que pueden ser separados y cultivados (Blanchard, Matthew G; Runkle, Erik S 2006).

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial CULTIVO DE TEJIDOS. El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una tcnica de reproduccin en condiciones totalmente aspticas, en la que a partir de un pequeo segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estmulo por medio de variables fsicas y qumicas controladas en un medio de cultivo (Davies, et al, 1980). El cultivo de tejido est basado en la totpotencia el cual consiste en que toda clula viva, tanto somtica como sexual, dispone de la informacin necesaria para formar un individuo. La tcnica de cultivo de tejido consiste en tomar ciertas secciones de la planta para cultivarla en un medio determinado y bajo condiciones artificiales controladas, sin la intervencin de factores biolgicos (Chih - Liang et al, 2004). Tipo de crecimiento in vitro. 1. Crecimiento organizado Se refiere al tipo de cultivo que se inicia con una parte organizada de la planta (pice, brotes, semillas, hojas etc.) y esa parte u rgano sigue creciendo in vitro manteniendo sus caractersticas estructurales. Se aplica tambin cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido desorganizado (organognesis). 2. Crecimiento desorganizado. Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de tejidos u rganos se produce un tejido sin estructura especfica que contiene un nmero limitado de algn tipo de clulas especializadas encontradas en una planta intacta. Un tejido desorganizado (o callo) puede crecer con subcultivos y puede ser mantenido en medio slido o liquido durante varios meses o aos (Abdelnour et al 1994). 36

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Principales aplicaciones del cultivo de tejido. El cultivo de tejidos puede utilizarse para diversos propsitos como son la micropropagacin, la obtencin de plantas libres de virus y otros patgenos, el mejoramiento gentico y la conservacin de germoplasma. La micropropagacin es una tcnica que ha logrado rpida aceptacin en la industria y se practica tanto en especies hortcolas como en ornamentales y aun en leosas. Esta tcnica presenta importantes ventajas sobre los mtodos tradicionales de propagacin entre los que se puede mencionar: La ventaja es que se necesitan muy poca plantas de donde tomar los explantes que producir miles de explantes. Reduccin del tiempo de multiplicacin. Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos y en un tiempo econmicamente costeable. Mayor control sanitario del material que se propaga. Facilidad de transportar el material in vitro de un pas a otro. Posibilidad de multiplicar rpidamente una variedad de la cual existe pocos individuos. Obtencin de plantas libres de virus. El cultivo de tejido permite en muchos casos producir plantas libres de patgenos y de virus. Esta tcnica consiste en aislar el meristemo de plantas que fueron o no tratadas. Entre ms pequeo sea el meristemo inoculado ms xito tendr en erradicar el virus. Mejoramiento gentico. Algunas de las tcnicas del cultivo de tejido ha podido ayudar a facilitar la creacin de nuevas tcnicas: callognesis, cultivo de clulas y el cultivo de protoplasto. 37

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Conservacin de germoplasma. Esta tcnica se ha considerado de alta prioridad por que se ha dado nfasis a la necesidad de preservar los recursos filogenticos como forma de mantener la biodiversidad. La ventajas que presenta el cultivo de tejidos para la conservacin de germoplasma son: Se puede almacenar un gran nmero de clones en espacios reducidos. El germoplasma se encuentra libre de patgenos, virus o insectos. Los costos de mantenimiento se reducen sensiblemente. Etapas de la propagacin in vitro

Tabla 1. Etapas de la propagacin in vitro Etapa 1 Consiste en la seleccin de las planta madre, que sern utilizadas para iniciar el cultivo in vitro, debido a que todas las plntulas que se obtengan tendrn las caractersticas genotpicas de la progenitora. Es el establecimiento de los cultivos axenicos, que consta de una en la eleccin del explante y la esterilizacin del mismo. Consta en la multiplicacin y proliferacin del tejido. Es la elongacin y enraizamiento. En esta etapa se lleva a cabo la adaptacin al medio externo o aclimatacin.

Etapa 2

Etapa 3 Etapa 4 Etapa 5

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial FACTORES TEJIDOS El inculo o explante. Es el rgano, tejido o fragmento de tejido, clula, etc. escindido del material parental para iniciar el cultivo in vtro. La eleccin del explante adecuado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, este variar al objetivo perseguido. En general, factores como el genotipo, edad de la planta y estado fisiolgico son importantes de considerar. Factores fsicos. El grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y especfico para cada tipo de planta, al igual que ocurre en el suelo, por lo que se hace necesario ajustarlo a los requerimientos de la especie en estudio. Intercambio Gaseoso: Los gases mas corrientes son O2 (oxigeno), CO2 (dixido de carbono) y C2H4 (etileno). La humedad: En condiciones in vtro la humedad dentro de los recipientes es casi 100 %. Por eso la planta in vitro en general no desarrolla adecuados sistemas de regulacin hdrica tales como ceras, estomas, cutcula, etc. La luz: En condiciones in vitro clsica, la intensidad y calidad de la luz es muy bajo (10 W/m2 en comparacin de condiciones naturales donde la luz puede representar hasta 900 W/m2). La calidad de la luz tambin es muy baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una misma sala para tener diferentes longitudes de onda. El espectro til para los vegetales es de 400 a 700 nanmetros. Dos fenmenos importantes dependientes de la luz son: Fotosntesis y fotomorfognesis. 39 QUE INTERVIENE EN EL CULTIVO DE

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Factores qumicos El medio de cultivo: Consiste de una mezcla de determinadas sustancias sobre o dentro del cual crecen los explantes (inculos). Para su uso, el medio de cultivo se esteriliza ya sea en autoclaves o por filtracin a travs de filtro de papel mili porosos. El medio de cultivo. Para mantener la viabilidad de un cultivo de tejido, estimular su diferenciacin y guiar su crecimiento, este requerir de una dieta balanceada de nutrientes y hormonas. Los ingredientes de un medio de cultivo vegetal pueden clasificarse en: Sales inorgnicas. Los elementos mayores esenciales que todas las plantas requieren y que estn presentes en los fertilizantes comunes, tambin forman parte de los medios de cultivos: Nitrgeno (N), Fsforo (P), Potasio (K), Azufre (S), Calcio (Ca), Magnesio (Mg), y Hierro (Fe). Adems de los elementos, que tambin son esenciales pero que se requiere en cantidades extremamente pequeas: Boro (B), Molibdeno (Mo), Manganeso (Mn), Cobalto (Co), Zinc (Zn), Cobre (Cu), Cloro (Cl) y Yodo (I). Una de las mezclas de sales ms usadas es la descrita por Murashige y Skoog. Es la conocida como frmula MS. En esta categora se encuentran sustancias como carbohidratos, hormonas o reguladores de crecimiento, vitaminas y algunos otros compuestos beneficiosos para el cultivo de tejidos: aminocidos, amidas, purinas, pirimidinas y cidos orgnicos. Los carbohidratos: Son sustancias orgnicas como los azucares que proveen 3 de los elementos mayores esenciales: Hidrogeno (H), carbono (C) y oxigeno (O). Los azucares son productos de la fotosntesis, 40

Compuestos orgnicos.

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial proceso por medio del cual la planta convierte el dixido de carbono y agua en carbohidratos con ayuda de la clorofila y la luz. Sin embargo la planta que crece n vtro, debido a la baja intensidad lumnica, no pueden fabricar todo el azcar que requiere, por lo que se adiciona altas concentraciones de sacarosa al medio de cultivo Las sustancias hormonales crticas en el cultivo de tejido son las auxinas y las citquininas. Estas intervienen en la elongacin y divisin celular, formacin de brotes y races y en la germinacin de la semillas. Entre las auxinas ms utilizadas en el cultivo de tejido se encuentra: cido indolactico (A l.A), cido naftalenacetico (ANA), 2,4 - D, picloran. Entre las citquininas se encuentran bencilaminopurina (BAP), la cintina y zeatina. Las giberelinas y el acido abcisico son tambin utilizadas en algunos casos. La vitamina ms importante en el cultivo de tejido es la tiamina. Sin embargo, otras han sido utilizadas con frecuencia para procesos especficos: biotina, Acido nicotinico, piridoxina, pantolenato, riboflavina. Entre los aminocidos y amidas que se han demostrado con beneficios esta L-arginina, L-Acido asprtico, L-glutamina, L-Acido glutmico, L-tirosina. Otros compuestos orgnicos comnmente empleados son el inositol, adenina, sulfato de adenina, el cido ctrico y el cido ascrbico (Para evitar la oxidacin de los tejidos). III. Preparaciones naturales complejas. Una gran variedad de sustancias de composicin indefinidas han sido utilizadas par enriquecer los medios de cultivos. Entre ellas se menciona: extracto de malta, agua de coco, extracto de levadura, pulpa de banano, casena hidrolizada y jugo de naranja y 41

Hormonas:

Vitamina:

Aminocidos:

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial tomate. Geles hmedos que actan como agentes de soporte: agar, gelrite, fitogel. En bajas concentraciones contrarresta efectos negativos que producen algunas sustancias liberadas al medio por el cultivo (fenoles).

Materiales inertes: Carbn activado:

MTODO DE MULTIPLICACIN DE ORQUDEAS. El mtodo de multiplicacin depender de los objetivos que se desean alcanzar. Se logra a travs del cultivo de tejidos utilizando el meristemo como explante inicial. La ventaja que presenta este sistema es que las plantas son idnticas a los progenitores. Con este mtodo se obtiene gran cantidad de plantas, las cuales tendrn variacin con respecto a sus progenitores. Se utilizan las yemas de varas florecidas, y las plntulas resultantes tienen las mismas caractersticas genticas que su progenitor.

Multiplicacin vegetativa:

Multiplicacin por semilla: Multiplicacin por pednculos florales:

Como ya se mencion anteriormente existen 3 mtodos de multiplicacin de orqudeas en este trabajo se llevo a cabo la multiplicacin por semillas mediante la tcnica de cultivo in vitro. LA BIOLOGA ORQUDEAS DE LA GERMINACIN DE SEMILLAS DE

Las semillas de orqudeas son conocidas usualmente como semillas de polvo porque son minsculas y contienen pocas reservas de alimento. Usualmente estas semillas no germinan en el medio natural a menos 42

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial que sean infectadas por un hongo micorriza, el mismo que abastece a las plantas jvenes con azcares y nutrientes que necesitan hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento. Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de clulas llamada protocormo. Manteniendo las condiciones normales, el protocormo continuar su crecimiento por varias semanas, meses o incluso aos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir races y hojas. En el caso de orqudeas terrestres, es de vital importancia que la relacin orqudea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por s mismo. Por otro lado, los protocormos de las orqudeas epfitas son comnmente verdes, lo que les posibilita producir parte de su alimento (www.hayf/biblionet/orquideas.com 1997).

Figura 8. Desarrollo de semilla a plntula Fundamentos de la germinacin in vitro Germinacin simbitica y no simbitica de semillas Mediante la germinacin in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o plstico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y 43

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial crezcan. Hay dos tipos bsicos de germinacin in vitro: simbitica y no simbitica. En la germinacin simbitica, las semillas se siembran con una pequea porcin del hongo micorriza apropiada. El hongo crece en el medio, coloniza a las semillas en proceso de germinacin y se origina una relacin simbitica que se espera alimente al protocormo hasta que ste produzca hojas y se vuelva autotrfico. Esta tcnica es ampliamente usada para la propagacin de orqudeas terrestres en zonas templadas. Tiene la ventaja de usar un medio simple (uno de los ms comnmente usados consiste en avena en polvo con una pequea cantidad de extracto de levadura), y como resultado las plantas micorrizales suelen ser ms fuertes y resistentes a infecciones que sus contrapartes cultivadas asimbiticamente. Sin embargo, la desventaja es que se necesita seleccionar el tipo de hongo micorriza adecuada para que se origine la simbiosis y prevenir parasitismo y la consecuente muerte de las semillas. Se ha realizado poca investigacin sobre la relacin del hongo micorriza con las orqudeas tropicales, y por lo tanto no se dispone del hongo micorriza apropiado. La germinacin asimbitica es usualmente usada en la propagacin de orqudeas tropicales, las mismas que tienden a crecer fcilmente en comparacin con sus parientes en zonas templadas. El medio usado para la germinacin asimbitica es ms complejo que para la germinacin simbitica, ya que todos los nutrientes orgnicos e inorgnicos y los azcares deben estar disponibles para la orqudea en una forma apropiada puesto que ya no existe la intermediacin del hongo. La germinacin asimbitica es un mtodo que se emple actualmente en este proyecto de germinacin in vitro de orqudeas y se utilizaron medios MS. En caso de disponer del hongo a partir de siembras in situ, habra la posibilidad de usar tcnicas simbiticas en el futuro (Dra. Sheena McKendrick 2000).

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial METODOLOGA COLECCIN Y ALMACENAMIENTO DE LAS CAPSULAS Las semillas de orqudeas fueron colectadas a partir de cpsulas verdes o cpsulas maduras. Las cpsulas fueron almacenadas por 5 das en papel de estraza y si se coloco en un lugar con bastante aireacin. Una vez que la capsula esta madura de preferencia, ya estn listas para almacenarse por muchos meses en frascos cerrados dentro del rea de incubacin (25 C). Siembra de las semillas Cpsulas verdes vs. Semillas secas Se puede sembrar semillas a partir de cpsulas verdes o a partir de semillas secas. A continuacin se describen las ventajas y desventajas de ambos mtodos: 1. Siembra a partir de cpsulas verdes. El interior de las cpsulas de orqudeas se mantiene estril si las cpsulas estn intactas. Entonces, si se desinfecta la parte exterior de las mismas, donde hongos y bacterias pueden desarrollarse, y se abre las cpsulas bajo condiciones de esterilizacin las semillas podrn mantenerse desinfectadas. La ventaja de este mtodo es que no se requiere de la esterilizacin de las semillas, lo que podra provocar su deterioro. Adems, algunas semillas tomadas de cpsulas casi maduras podran germinar ms rpido. La desventaja de este mtodo es que al abrir la cpsula todas las semillas en ella deben ser utilizadas. Tambin se debe considerar que las semillas sembradas a partir de cpsulas que no han madurado lo suficiente podran germinar lentamente o simplemente no germinar. 45

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial 2. Siembra a partir de semillas secas. Una vez que la cpsula es abierta, las semillas dejan de ser estriles y requieren de un proceso de esterilizacin. Comnmente, se utiliza una solucin de hipoclorito (cloro) de sodio, hipoclorito de calcio o perxido de hidrgeno. Las semillas se agitan dentro de la solucin que adems contiene una gota de detergente para "humedecerlas", luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado. La ventaja de este mtodo es que las semillas pueden ser colectadas, secadas al aire, almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizadas cuando sea necesario. Se debe considerar que lo que se siembra est determinado por la disposicin de cualquiera de las dos formas de encontrar las semillas de acuerdo a la poca en que se colectan. MATERIALES Y EQUIPOS UTILIZADOS EN LA GERMINACION Descripcin de los equipos utilizados en las actividades. En un laboratorio de cultivo in vitro de tejidos se requiere diferentes tipos de materiales instrumental, cristalera y equipo. Balanza analtica Potencimetro Autoclave Parrilla con agitador magntico Horno de microondas Refrigerador Micropipetas Mechero bunsen Campana de flujo laminar

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Esterilizacin del material del laboratorio. Inicia con el lavado de todo el instrumento a utilizar en las actividades consecutivas, despus se coloca en un escurridor para luego cubrirlas con papel aluminio y sellado con cinta testigo para poder asegurar que el material se esterilizo. Despus se coloca en una olla de aluminio y se acomoda correctamente cada instrumento, para despus colocarlo en la autoclave por 20 min. A partir de que alcanzo una temperatura de 125 0 C y una atmsfera de presin constante se disminuye la flama en este preciso momento se empieza a contar los 20-30 min. Al transcurrir el tiempo ya mencionado se apaga la perilla y se espera hasta que baje la presin para poder abrir la autoclave y sacar el material ya esterilizado. El material esterilizo se coloca en los anaqueles en el espacio destinado para cada uno de ellos. Para el material de plstico solo se cubre con papel estraza y no se esteriliza. PREPARACION DE MEDIOS MS PARA ORQUIDEAS. El medio que puede ser preparado ya sea utilizando ingredientes bsicos. En este caso el medio utilizado fue Murashige-Skoog Basal (medio de vitaminas Phytotechnology Inc., USA). Cuando se inicia el proceso de crecimiento de una nueva especie es aconsejable probar con medios a una concentracin total y parcial para determinar cual es el mejor medio para dicha especie. El nivel de pH es tambin importante. La mayora de las orqudeas crece en un medio de pH 5.7, sin embargo. Al experimentar con un pH igual a 5.7 se debe considerar que el pH del medio ser mas alto luego de aadir el agar que antes de hacerlo. (Murashige & Skoog 1962). Los medios MS han sido los principales 47

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial medios utilizados para el experimento y realizar la comparacin de los dos tipos de medio para el crecimiento de las tres especies de orqudeas. El mtodo general para la preparacin de los medios es el que se detalla a continuacin. Preparacin del medio de cultivo (sin carbono activado Para inicial el proceso de germinacin) Por ser un proyecto de carcter comercial se opta por usar medios de vitaminas y medios de micropropagacin comercial, en el anexo 1 se muestra una lista ms detallada de los reactivos y materiales utilizados. Reactivos: Murashige-Skoog Basal (medio de vitaminas Phytotechnology Inc., USA) Agar, Plant TC (Micropropagation Grod-Gelidium Phytotechnology Inc., USA) Sacarosa 1. Pesar: 4.43 gr Medio MS con Vitaminas 7.00 gr Agar, Plant TC 30.0 gr Sacarosa 2. En 800 ml de H2O desionizada se disuelven 30.0 gr de sacarosa y se agregan 4.43 gr de medio MS con vitaminas 3. Se mide el pH de la solucin esta debe de estar en un pH 5.7 0.1 (se puede ajustar el pH con HCl o KOH a 1 N). Posterior al estandarizado se afora a 1000 ml.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial 4. Se disuelven 7.00 gr Agar, Plant TC, en la solucin anterior y se lleva al microondas durante 6 minutos, cada 2 min. Se saca y con una cucharilla o varilla de metal se agita para evitar que se sedimente y para cuidar que no hierva y se tire. Preparacin de medio de cultivo (con carbono activado Para el proceso de germinacin) Reactivos: Murashige-Skoog Basal (medio de vitaminas) Agar, Plant TC (Micropropagation Grod-Gelidium) Sacarosa Carbono Activado 1. Pesar: 4.43 gr Medio Vitaminico MS 7.00 gr Agar, Plant TC 30.0 gr Sacarosa 1.00 gr Carbono Activado 2. En 800 ml de H2O des ionizada se disuelven 30.0 gr de sacarosa y se agrega 4.43 gr de medio vitaminico MS, cuando esto este completamente disuelto se agrega 1.00 gr de Charcoal Activate. 3. Se mide el pH de la solucin esta debe de estar en un pH 5.7 0.1 (se puede estandarizar con HCl o KOH a 1 N). Posterior al estandarizado se afora a 1000 ml. 4. Se disuelven 7.00 gr Agar, Plant TC, en la solucin anterior y se lleva al microondas durante 6 minutos, cada 2 min. Se saca y con una cucharilla o varilla de 49

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial metal se agita para evitar que se sedimente y para cuidar que no hierva y se tire. Proceso de desinfeccin cpsulas verdes La esterilizacin superficial de los tejidos vegetales se realiza bsicamente mediante el empleo de compuestos qumicos capaces de eliminar a los microorganismos (Prez et al, .1999). Sin embargo, el hecho de que cualquier agente qumico que mate microorganismos tambin causar dao al tejido vegetal, limita a los sistemas de propagacin in vitro. Por lo tanto lo que se busca es encontrar un sistema que elimine a la mayora de microrganismos causando el menor dao posible al tejido vegetal. En el caso particular de nuestra especie en estudio, la desinfeccin de la cpsula se realiz de forma superficial o externa, esto se hizo para eliminar los microorganismos (bacterias, hongos) que se encuentran presentes en la testa de la cpsula. El proceso de desinfeccin se inicia lavando la cpsula con una solucin jabonosa y enjuagando con agua corriente, inmediatamente la cpsula se sumerge en la solucin de cloro comercial al 5% y unas gatos del agente humectante Tween 20 (con una concentracin al 6% con respecto al cloro puro) manteniendo en constante agitacin durante 20 minutos, posteriormente se retira la cpsula de la solucin de hipoclorito de sodio e inmediatamente se sumerge la cpsula en alcohol al 70% durante 2 minutos, finalmente se flamea la cpsula sobre el mechero . Todo esto se realiza en condiciones aspticas en el interior de la campana de flujo laminar.

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Figura 9. Agente humectante TWEEN 20

Figura 10. Agitacin mecnica de las capsulas

Proceso de corte de la cpsula Bajo condiciones aspticas en la campana de flujo laminar, la cpsula de orqudea recin desinfectada se transfiere a una caja petri y con la ayuda de un bistur se remueve cuidadosamente el peciolo, inmediatamente se corta en posicin longitudinal la cpsula. Posteriormente, se procede a la siembra de las semillas distribuyndolas de forma homognea sobre los medios. En este trabajo, se sometieron a germinar semillas de Brassavola x Cattleya, Guarianthe Aurantiaca, Cattleya Blanca, Cattleya Lila y Phanaelopsis. Los medios de cultivo fueron sellados con cinta plstica y etiquetados indicando la fecha de siembra, medio que se utiliz y quien realiz la siembra. Finalmente los medios de cultivo se mantienen en un rea con ambiente controlado a temperatura de (25 C) con fotoperiodo de 16/8 (Luz/Oscuridad) . Luego de cortar y abrir los frutos con una cuchilla estril se proceder a realizar la siembra, se sacar las semillas con ayuda de una esptula, se colocar cantidades convenientes en cada envase de cultivo y se distribuir uniformemente el material sobre la superficie del medio, finalmente los envases sern sellados, etiquetados y llevados a incubar. 51

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

Figura 11. Proceso del corte de la cpsula

Figura 12. Cpsula abierta de manera longitudinal

Procedimiento de siembra 1. Colocar la cpsula desinfectada dentro de una placa petri y seccionar la cpsula en trozos con la ayuda de una pinza o una cuchilla. 2. Colocar la tapa a la placa petri con las porciones de cpsula dentro mientras se manipulan otros materiales para evitar el contacto con cualquier posible contaminante. 3. Tomar el trozo de cpsula con el que se va a trabajar con la ayuda de otra 4. Destapar un frasco con medio 5. Retirar la tapa a la placa petri con el trozo de cpsula dentro. 6. Tomar y situar el trozo de cpsula sobre el frasco abierto con la ayuda de una pinza. 7. Colocar cantidades convenientes de semillas en el medio con la ayuda de una esptula. 52

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial 8. Tapar el frasco con medio sobre el que se coloc la semilla. 9. Colocar la porcin de cpsula que se est utilizando sobre la placa petri. 10. Colocar la tapa a la placa petri con el trozo de cpsula dentro. 11. Sellar, etiquetar y llevar a incubar los frascos. Se recomienda seleccionar a las plntulas con caractersticas ms apropiadas para iniciar un programa de micropropagacin, ya que la descendencia que se obtiene a partir de la reproduccin por semillas presenta una alta variabilidad.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

Figura 13. Apertura de los frascos dentro de la campana

Figura 14. siembra de las semillas con ayuda de la esptula

Figura 15. Sellado y etiquetado de los frascos

Figura 16. Semillas dentro del frasco

Mantenimiento de las vitroplantas. Transcurrido aproximadamente de 2 a 5 meses, ocurre la germinacin, las plntulas presentan una altura de (.5 y .7 mm aproximadamente) y sus hojas miden entre 0.1 y 0.4 mm. Bajo condiciones aspticas en la 54

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial campana de flujo laminar, las plntulas recin germinadas se trasplantan a nuevos medios modificados (Medio con hormonas) sembrando 20 plntulas en promedio por frasco gerber. La variable a evaluar es el efecto de las sales MS modificadas con medios enriquecidos de hormonas BAP, ANA y el uso del carbn activado. Se pretende que las plntulas adquieran mayor rea foliar, mejor desarrollo de las plntulas y races. Los medios de cultivo fueron sellados con cinta plstica y etiquetados indicando la fecha de siembra, medio que se utiliz y quien realiz la siembra y finalmente los medios de cultivo se mantienen en un rea con ambiente controlado a temperatura de (25 C) con fotoperodo de 16/8.

Figura 17. Anaquel con vitroplantas

Figura 18. Vitroplantas de Guarianthe aurantiaca

Consideraciones para el cultivo de orqudeas: La orqudea puede cultivarse con buen xito si uno le da el cuidado apropiado. Existen muchas clases de orqudeas y cada una requiere condiciones diferentes de luz y temperaturas. Para el cultivo de las orqudeas se debe tener en cuenta dos reglas generales:

55

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial En primer lugar se debe escoger la planta que se adapte al clima existente en el rea. Segundo se debe escoger o ajustar el clima del rea para que coincida con las necesidades de cultivo de sus plantas, un ejemplo de este caso son las orqudeas de sombra como las Phalaenopsis a las cuales debern proporcionarles sombra artificial la mayor parte del ao. En el cultivo de las orqudeas se deben tener en cuenta muchas variaciones que afectan directamente su desarrollo, siendo los cinco principales problemas del cultivo de las orqudeas : luz, temperatura, humedad, aire, y medio de fijacin. 1. Luz. Una orqudea necesita la mayor cantidad de luz posible sin lesionar la planta. La luz es necesaria para que las orqudeas, puedan crecer y desenvolverse bien. La cantidad de luz que las diferentes especies toleran sin lesionarse, vara mucho. Una Cattleya, prospera en luz intensa, que no tolerara un Phalaenopsis. La cantidad de luz puede originar una decoloracin de las hojas y en el caso de Phalaenopsis o Clanttleya se ponen amarillentas. Por el contrario, la poca luz produce un tono verde oscuro en la hoja, impidiendo el desarrollo y reduciendo o anulando la floracin. 2. Temperatura. Las orqudeas requieren temperatura diurna de 55 a 90 F (13 a 32 C) temperatura de 50 a 70 F (10 a 21 C), dependiendo de sus necesidades particulares de cultivo. Las orqudeas se pueden dividir en tres categoras: de clima fro, intermedio y clido, dependiendo de su estado natural. Las orqudeas de clima fro como las Cymbidium Odontoglossums y algunos Paphiopedilums se desarrolla en forma optima con una temperatura diurna de 56

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial 60 a 70 F (16 a 21C) o si es posible an mas baja, y con una temperatura nocturna de alrededor de 50 F ( 10C).Las orqudeas de clima intermedio, como las Cattleyas, algunos Oncidiums y una gran variedad de otras especies, crecen mejor si la temperatura diurna flucta entre 65 y 75 F (18 y 24 C ) y la nocturna se mantiene entre 55 y 60 F (13 y 16 C). La orqudeas de tierras clidas, como las vandas y Phalaenopsis, prosperan a temperaturas de 70 a 85 F (21 a 30 C) de da y de 65 a 70 F (18 y 21C ) de noche. Se observa dos particularidades en esta categora. Primero la gama de temperaturas citadas se superponen parcialmente, lo cual significa que con algunos ajustes se puede, cultivar Phalaenopsis junto con Cattleyas. Segundo lo mas importante es que exista descenso de temperatura de 10 a 15 grados en el da y la noche diferencia a la que estn acostumbradas las orqudeas en la naturaleza. 3. Humedad. Las orqudeas requieren una atmsfera hmeda. Este es el aspecto mas difcil de dominar, pues aunque necesitan una atmsfera hmeda, no prosperan en un ambiente excesivamente hmedo y sofocante. En la naturaleza las orqudeas se refrescan peridicamente con las lluvias y se secan con las brisas. El aire se mueve, flota en rededor. Debe tratarse de reproducir estas condiciones. El objetivo debe ser conseguir una humedad relativa del 50 % para todas las orqudeas, pero recordando que algunos la requieren mas alta y otras mas baja para desarrollarse al mximo. Es recomendable aumentar un poco la humedad al incrementar la luz y la temperatura. La humedad ambiental correcta ayuda a las plantas a mantener su nivel de humedad sin necesidad de riego excesivo, lo que aumenta el peligro de que las races se pudran.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial 4. Ventilacin. Las orqudeas requieren movimiento constante del aire a su alrededor. E n la naturaleza, las brisa refrescan a las orqudeas continuamente. Esto amortigua el calor intenso del sol , reduce la posibilidad de enfermedades fungosas, que comienzan con el aire estancado y hmedo, a la vez que proporciona un nuevo abastecimiento del bixido de carbono que las plantas utilizan en su proceso de fotosntesis. El invernadero debe proporcionar a las orqudeas movimiento de aire, preferiblemente el aire debe ser hmedo y estar a la temperatura de ptimo crecimiento de las orqudeas, no se permitir que una corriente de aire fro envuelva a las Cattleyas. Hay que proteger a las plantas contra vientos clidos y secos. El aire fresco y vigorizante que se levanta despus de un aguacero es lo ideal para la mayora de las orqudeas. 5. Medio de fijacin. Las orqudeas requieren un medio de sustento o apoyo que les suministre agua y nutricin sin daar las races. Se deben tener claros los trminos epifitas y terrestres, pues al cultivar las orqudeas las condiciones deben ser semejantes a la de su habitad natural. Es importante considerar que al sembrar una planta epifita de orqudea en un pote o maceta, sus raices no estn expuestas al aire como en la naturaleza. En consecuencia se debe emplear un medio de siembra en pote que forme cavidades o bolsas de aire de manera de proporcionar ventilacin a las races y buen drenaje, a fin de evitar la pudricin de las races.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

CAPTULO IV

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial RESULTADO Y ANALISIS DE DATOS El objetivo principal que se planteo en el presente trabajo fue establecer un protocolo de produccin de alta demanda comercial usando mtodos de propagacin in vitro, en los experimentos realizados se puede constar las condiciones mas favorables para la germinacin de la orqudea, la cual se detalla. Porcentaje de contaminacin en diferentes concentraciones de cloro en 20 minutos
120 % de Contaminacion 100 80 60 40 20 0 Brassavola spp. x Cattleya spp. 90 10 0

G. aurantiaca 96 4 0

Cattleya spp. Blanca 92 8 0

Encyclia spp. 92 8 0

Phalaenopsi s spp. 96 4 0

3% 5% 10%

En este grafico se expresa el uso de cloro comercial en diferentes concentraciones, como muestra el grafico de contaminacin, en las 5 especies con una concentracin de 3% la contaminacin es muy alta, mientras que en 5% las contaminaciones se mantuvieron por debajo del 10% por otro lado con una concentracin de 10% en cloro no se tiene contaminacin. 60

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Como resultado se opta por usar una concentracin de 5% de cloro, ya que una concentracin mayor en este caso un 10% provoca un maltrato sobre la capsula de la orqudea y penetra hasta las semillas de la misma impidiendo que esta sea capaz de germinar. Porcentaje de contaminacin en diferentes tiempos con una concentracin de cloro del 5%
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Tiempo en Min.

Brassavola spp. x Cattleya spp. 10 0 0

G. aurantiaca 14 0 0

Cattleya spp. Blanca 13 0 0

Encyclia spp. 18 0 0

Phalaenops is spp. 11 2 0

10 Min 20 Min 30 Min

En la grafica se muestra una comparacin de diferentes tiempos vs una concentracin fija del 5% de cloro; esto para encontrar un punto de equilibrio entre la concentracin y el tiempo adecuado para una perfecta desinfeccin de la capsula, podemos observar que 10 Min no son suficientes ya que el porcentaje de contaminacin es alto, sobretodo en la Encyclia spp. Cuyas paredes de la capsula es mas rugosa y consta de una capa mas gruesa que el resto de las especies del experimento. Mientras un tiempo de 30 Min. No presenta contaminacin, muestra maltrato sobre la capsula y las semillas de su interior ya que penetra y 61

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial lastima el contenido dejndolo incapacitado para un proceso de germinacin, un tiempo de 20 min. Con una concentracin de 5% de cloro comercial es mas que suficiente para obtener un buen manejo de desinfeccin superficial de la capsula y no logra daar el contenido interior. Porcentaje de germinacin con carbono activado
120 % de Germinacion 100 80 60 40 20

Brassavola spp. x Cattleya spp. 100 5

G. aurantiaca 80 20

Cattleya spp. Blanca 90 10

Encyclia spp. 100 5

Phalaenop sis spp. 100 10

Con C.A. Sin C.A.

En el grafico se puede observar de manera clara que por encima del 80% de la germinacin en trminos generales de estas especies son favorecidas por el carbono activado presente en el medio, mientras que un 20% logra germinar de manera mas lenta y con presencia de fenolizacin sin la ayuda de este agente. El carbono activado posee la capacidad de retener sustancias de alto volumen molecular que impiden el desarrollo de la germinacin adems de mantener un estado de equilibrio inico que favorece el desarrollo de las semillas en el medio de cultivo. 62

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Porcentaje de germinacin con carbono activado en presencia de hormonas
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

% de Germinacion

Brassavola spp. x Cattleya spp. 90 10 50

G. aurantiaca 60 30 35

Cattleya spp. Blanca 60 30 40

Encyclia spp. 60 30 50

Phalaenop sis spp. 60 30 45

BAP ANA BAP/ANA

Como se puede notar en el grafico, se utilizaron dos tipos de hormonas, benziladenina (BAP) y cido naftalenactico (ANA) y una mezcla de ambas para analizar el potencial de ambas hormonas en una sola dosis para logar analizar los porcentajes de germinacion. Se puede observar que en trminos generales en presencia de la hormona BAP se logra un mayor ndice de germinacin de las especies en cuestin, sobre todo en el hibrido Brassavola spp. x Cattleya spp. mientras que el resto muestra los mismos ndices de comportamiento, la presencia de la hormona ANA tiende a ser homognea con el resto de las especies pero de nuevo en el hibrido Brassavola spp. x Cattleya spp se puede notar una gran diferencia ya que solo el 10% logro germinar en tiempo paralelo al de las semillas en presencia de la hormona BAP.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial De la combinacin de BAP/ANA se puede decir que si no es el mejor estimulante para la germinacin, tiene mejores resultados que el uso aislado de la hormona ANA en un 18% pero es inferior a los resultados obtenidos en el aislamiento de la hormona BAP en 22%. Crecimiento de las plntulas (Tallo) con carbono activado en presencia de hormonas
Tamao del tallo (Milimetros) 25 20 15 10 5 0 Brassavola spp. x Cattleya spp. 7 10 8

G. aurantiaca 11 18 14

Cattleya spp. Blanca 8 15 12

Encyclia spp. 6 13 10

Phalaenop sis spp. 11 22 15

BAP ANA BAP/ANA

En esta grafica se muestra el crecimiento promediado del tallo en las cinco especies de orqudeas, se utilizaron dos tipos de hormonas, benziladenina (BAP) y cido naftalenactico (ANA) y una mezcla de ambas para analizar el potencial de ambas hormonas en una sola dosis. El tamao de los callos radican desde los seis milmetros hasta los 22 milmetros pero es en presencia de la hormona ANA donde se registraron los mayores ndice de crecimiento de los tallos y hojas en las plntulas; en presencia de la hormona BAP la coloracin de las hojas es de un tono verde oscuro, la combinacin de las hormonas logro buenos 64

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial resultados, por debajo de los registrados en el aislado de la hormona ANA, teniendo un promedio de 12 milmetros, mientras la hormona BAP es de 8 milmetros. En trminos muy generales, la presencia de la hormona ANA es la mas favorable para el crecimiento del tallo. Crecimiento de las plntulas (raz) con carbono activado en presencia de hormonas
Tamao de la Raiz (milimetros) 25 20 15 10 5 0 Brassavola spp. x Cattleya spp. 12 8 12

G. aurantiaca 18 13 18

Cattleya spp. Blanca 16 11 14

Encyclia spp. 14 10 12

Phalaenop sis spp. 20 14 17

BAP ANA BAP/ANA

Para esta grafica se utilizaron dos tipos de hormonas, benziladenina (BAP) y cido naftalenactico (ANA) y una mezcla de ambas para analizar el potencial de ambas hormonas en una sola dosis con el fin de cuantificar el crecimiento de las rices en las especies de muestra. La combinacin de hormonas BAP/ANA tiene buenos resultados en el desarrollo del enraizamiento pero es sin duda alguna el aislado de la hormona BAP la mejor opcin para el enraizamiento in vitro de las orqudeas sobretodo para la Phalaenopsis spp. ya que en presencia de esta hormona se logro un promedio de 20 milmetros como promedio en 65

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial las plntulas, mientras que en presencia de la hormona ANA la mxima longitud obtenida esta sobre los 14 milmetros, esto da como resultado que la presencia de la hormona BAP es la mejor para lograr un enraizamiento a pesar de experimentar con combinaciones BAP/ANA.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El proyecto realizado tiene como finalidad el establecimiento de un protocolo de produccin de alta demanda comercial usando mtodos de propagacin in vitro, mediante la experimentacin en cultivos in vitro de diferentes tipos de orqudeas se pudo obtener los siguientes resultados: Para lograr una perfecta desinfeccin de las capsulas, se puede usar cloro comercial a una concentracin de 5%, durante un periodo mximo de 20 minutos, ya que una prolongacin superior a este tiempo daa la capsula y logra penetrar daando las semillas e impidiendo que estas logren germinar; la presencia de sales y vitaminas de Murashige & Skoog adicionadas con carbono activado en los cultivos in vitro es de gran ayuda para la germinacin y desarrollo de las semillas y plntulas, ya que este por sus propiedades fsicas tiende a adsorber las sustancias toxicas que se generan durante la incubacin que pueden llegar a impedir y/o retrasar el proceso del desarrollo del producto in vitro; El carbono activo en combinacin con las hormonas BAP y ANA, produce mejores efectos que en pruebas donde se aislaron estos compuestos, de manera particular se obtuvieron resultados que permiten asegurar que la hormona ANA en las orqudeas es quien induce y permite el crecimiento y desarrollo del tallo en las plntulas, mientras que la hormona BAP es quien permite el mayor numero de germinacin de las semillas adems de que es quien estimula el mayor desarrollo de races en las plntulas, lo cual permite un mayor ndice de probabilidad de adaptacin y desarrollo en un medio Ex vitro, como es el medio ambiente en invernaderos de produccin comercial.

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Anexo 1: Estudio tcnico Estudio de las materias primas e insumos Materias primas Brassavola spp. x Cattleya spp. Guarianthe aurantiaca Cattleya spp. Blanca Encyclia spp. Phalaenopsis spp. Costo de implementacin de un laboratorio de cultivo de tejidos Tabla 2. Costo de Cuarto de crecimiento Articulo Cantidad Valor (US$) Cuarto de crecimiento Iluminacin (red instalada) 1 $ 46 Estantera mecnica 1 97 Lmparas para la estantera 5 77 Mesa (2m) 1 62 Butaca 1 16 Termmetro (mxima y mnima) 1 16 TOTAL $ 268

Tabla 3. Costo de Cuarto de transferencia Cuarto de transferencia Iluminacin (red instalada) Aire acondicionado (14,000 BTU) Cmara de flujo laminar Butaca

1 $ 1 1 1 TOTAL $

46 766 1532 16 2360.00 68

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Tabla 4. Costo de Cuarto de preparacin de medios Cuarto de preparacin de medios Iluminacin (red instalada) Estufa Refrigerador pequeo Balanza Cinta para medir pH Lagadero censillo Vitrina adosada Mesa Butaca Extinguidor pequeo Carro de laboratorio Bandejas plstica Bandejas metlicos

1 $ 1 1 1 20 1 2 1 1 1 1 6 2 TOTAL $

46 31 154 307 16 92 184 62 16 62 123 19 16 1128

Tabla 5. Costo de Cuarto de autoclave Cuarto de autoclave Iluminacin (red instalada) Estantera mecnica Vitrina Extractor Autoclave Destilador

1 $ 46 1 98 1 92 1 153 1 154 1 766 TOTAL $ 1309

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Tabla 6. Costo de Cristalera Cristalera Probeta de 100 ml Probeta de 1000 ml Pipeta graduada de 5 ml Frascos para alimentos ( 7x4 cm) Frascos grandes Placas petri (15x100 mm)

1 $ 1 1 2000 1000 50 TOTAL $

5 17 3 81 54 10 170

Tabla 7. Costo de Reactivos Reactivos NH4NO3 KNO3 KH2PO4 KNO3 MgSO4 H2O H3BO3 MnSO4. 7H2O ZnSO4. 7H2O Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl H2O KI Medio Vitaminico MS Agar, Plant TC Charcoal Activate Sacarosa

1000 $ 25 500 14 500 18 500 500 10 18 500 30 500 25 500 101 500 38 500 25 125 43 1000 12 1000 267 1000 106 5000 5 TOTAL $ 1184

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Tabla 8. Costo de Instrumental Instrumental Mangos para bistur Tijeras pequeas Cuchillas para bistur Pinzas cortas Pinas largas

2 $ 2 2 1pq/50 2 TOTAL $

15 15 12 30 30 102

Tabla 9 Costo de Materiales Materiales Mechero de alcohol Rollo de algodn Gasa Papel aluminio Papel para envolver Papel filtro Cinta Esptula Mascarillas Detergente Cepillos para limpiar tubos Botelln plstico Tarro de basura Bolsas plasticas para basura Marcadores Inversin total

1 $ 5 5 6 1 6 5 15 2 6 1 15 3 37 1 6 1pq/100 6 6 6 1 15 1 15 15 3 6 TOTAL $ 165 TOTAL $ 6686

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

Anexo 2: Medio de cultivo conocido como MS (1962) Nombre del P. M Formula compuesto (grs.) MACRONUTRIENTES Nitrato de potasio KNO3 101.108 Nitrato de amonio NH4NO3 80.04 Cloruro de calcio CaCI2 2H20 147.02 Sulfato de magnesio MgS04H20 246.489 Fosfato de potasio KH2PO4H2O 136.09 monobasico MICRONUTRIENTES Sulfato de MnS04H20 169.01 manganeso Sulfato de zinc Zn S04 7H20 287.54 Acido borico h3 bo3 61.86 Yoduro de potasio Kl 166.01 Sulfato de cobre Cu S04 5H20 249.68 Molibdato de sodio Na2Mo04H20 241.95 Cloruro de cobalto Co Cl2 7H20 237.93 Sulfato ferroso Fe SO47H20 278.028 NaEDTA Ci0Hi4N2Oi0Na22H2O 372.30 Compuesto organicos - Aminoacidos Glicina C2H5NO2 75.07 Vitaminas Myonositol C6HI206 180.2 Tiamina - CI Ci2H17CIN4O SHCI 337.3 Acido nicotinico C6H5NO2 123.1 Piridoxina HCI C8H11NO3HCL 205.6

Murashige & Skoog Cantidades para un litro (mg/l). 1900 1650 440 370 170

16.9 8.6 6.2 0.83 25|jg 250 pg 25 pg 27.8 37.3 2.0 100 0.1 0.5 0.5

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

Anexo 3: Vitaminas MS Murashige & Skoog Nombre del 1 lt 500ml 250ml Formula Compuesto (gr) (gr) (gr) Vitaminas MS Myoinositol C6H12O6 10 5 2.5 Ac. Nicotnico C6H5NO2 0.05 0.025 0.0125 Piridoxina C8H11NO3HCl 0.05 0.025 0.0125 Hidrocloride Tiamina Hidrocloride C8H17N4 OSCl 0.01 0.005 0.0025 HCl

100 ml 50 ml (gr) (gr) 1 0.005 0.005 0.001 0.5 0.0025 0.0025 0.0005

Anexo 4: Auxinas ms usadas en el cultivo de tejidos vegetales

NOMBRE cido Indolactico cido Naftalenactico cido Indolbutrico cido 2-4 Dicloro Fenoxiactico cido tcinmico cido Naftoactico cido Fenilactico NOMBRE COMUN AIA IAA ANA NAA AIB IBA 2,4 D 175 186 203.2 221.0 148.2 NOA PAA 202.2 136.2 PM { } MG/L DE TRABAJO 0.01 - 3.0 0.01 10.0 0.01 10.0 0.01 10.0 0.01 5.0 0.01 10.0 0.01 50.0 SOLVENTE NaOH 1N NaOH 1N NaOH 1N NaOH 1N Etanol NaOH 1N NaOH 1N Etanol

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Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial

cido Fenoxiactico cido 2,4 5 Tricloro Fenixiactico cido Aminotriclo cido Indolpropinico CPA 2,4,5-T PICLORAM IPA 186.6 255.5 241.5 198.2 0.01 10.0 0.01 5.0 0.01 10.0 0.01 10.0 Etanol Etanol DMSO NaOH 1N

GLOSARIO Agar Antena Gelatina vegetal en base a algas. En ciertas orqudeas, cada una de las dos delicadas prolongaciones del ginostemo sensible a un estimulo mecnico, ante el cual la antena lanza los polinios Pedculo que sostiene el polinio. que vive sobre los arboles Libres de grmenes contaminantes. Relativo o situado al eje Aparato que proporciona en su interior un ambiente totalmente estril, s necesario para la manipulacin del material asptico (tejido y medio de cultivo). Fruto de forma especial, dentro de esta clase de frutos estn las orqudeas Pequea porcin del tejido vegetal que funciona como generador de nuevas plantas en el cultivo in vitro. Desarrollo de las flores desde su iniciacin hasta la marchites; sinnimo de florescencia Material hereditario que se transmite a la descendencia por medios de los gametos Cruza entre dos organismos de variedades o especies diferentes 74

Apendicula Arboricola Asptico Axial Camara de flujo

Cpsula Explante

Floracion Germoplasma Hibridacin

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial Hbridos Hormona organismos obtenidos por la hibridacin sustancias producidas en la clula en una parte del cuerpo que difunde o son transportadas por el torrente circulatorio a clulas en otra parte donde se regula y coordina sus resultados In vitro Tcnica de reproduccin artificial en condiciones de trabajo. Inoculo libre de agentes patgenos Labelo Ptalo medio, tan modificado con respecto a lo dos laterales que tiene formas y color completamente distintos. El labelo se divide en tres porciones: epiquilo, mesoquilo e hipoquilo. Lculo Cavidad de un rgano. En las orqudeas generalmente se refiere a la cavidad de la antera. Medio Elemento en el que vive un vegetal. Mesidio Callo muy desarrollado del labelo de ciertas orqudeas. Monocotiledoneo(a): Con un solo cotiledn. Uno de los tres grupos en que se dividi el reino vegetal y al cual pertenecen las orqudeas. Nutrientes Termino genrico para cualquier sustancia que puede utilizarse en los procesos metablicos del organismo. Orquidaceas Familia de monocotiledneas del orden de las microspermas sub - orden de las ginandras, con flores a menudo respingadas. De los seis estambres del androceo suelen abortar todos menos el inferior del ventrculo externo o las dos laterales inferiores del ventrculo interno. El eje floral prolongado, unido a los estambres y al estilo y estigmas constituye el llamado ginostemo. Granos de polen raramente sueltos, por lo regular unidos en polonios, estos tienen un 75

Establecimiento de un protocolo de multiplicacin de orqudeas de alta demanda comercial apndice filiforme, la cuadricula. Logaritmo negativo de la concentracin de iones por virtud de la cual se exprese el grado de acidez o alcalinidad de un lquido. Plantas pequeas en proceso de desarrollo. Polvo contenido en la antera el cual fecunda los vulos a travs del estigma, para producir la semilla. En las orqudeas el polen no se encuentra como polvo suelto si no en unas masas que constituyen los polinios Multiplicar una planta. Cuerpo vegetal que no tiene raz.

pH

Plntula Polen

Propagar Tallo

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