AKTIVASI JALUR KOMPLEMEN KOMPLEMEN ALTERNATIF DENGAN MELANIN JAMUR Melanin adalah pigmen biologi kompleks yang dibentuk

dengan polimerasisasi oksidatif dan/atau kandungan indolic. Pigmen ini telah diimplikasikan dalam pathogenesis beberapa infeksi mikroba, keganasana, gangguan degenerasi, dan penyakit autoimun. Penelitian saat ini telah menunjukkan bahwa melanin mempunyai sifat antigenic dan anti inflamasi. Temuan ini menyebabkan peneliti melakukan eksplorasi selanjutnya terhadap interaksi melanin dengan system imun. Partikel melanin (ghosts) diisolasi dari sel neoformans Cryptococcus dan Aspergillus niger conidia dan selanjutnya diinkubasi dalam serum normal yang mengandung komplemen C3
125

I yang dilabel. Hasil menunjukkan bahwa

deposisi fragmen C3 ke dalam ghost melanin terjadi dalam 1 menit setelah inkubasi, dengan deposisi maksimum terjadi setelah 12 menit untuk C.neoformans yang diperoleh dari ghost melanin dan setelah 25 menit untuk ghost melanin A. niger. Pemblokan aktivasi jalur klasik tidak mempengaruhi kinetic deposisi total C3 ke dalam ghost melanin, mengindikasikan bahwa melanin mengaktivasi komplemen melalui jalur alternative. Analisis immunofluoresensi paru-paru dari mencit galur BALB/c yang diinjeksi secara intratekal dengan C.neoformans yang mengandung ghost melanin menunjukkan deposisi fragmen C3 ke dalam ghosts. Granuloma kecil juga diamati di sekeliling ghosts. Akan tetapi, melanisasi sel C.neoformans tidak mengubah konetik atau deposisi total fragmen C3 ke dalam sel jamur. Temuan bahwa permukaan melanin dapat mengaktivasi system komplemen memperkirakan mekanisme potensial dalam pathogenesis beberapa proses degenerasi atau proses autoimun yang meliputi sel melanisasi sama seperti peranan potensial melanin lain dalam virulensi melanin yang diproduksi oleh miroorganisme.

Melanin merupakan pigmen muatan negative dengan permukaan hydrophobic yang dibentuk dari polimerisasi oksidatif kandungan phenolic dan atau indolic (5,44). Pigmen ini disintesis oleh mikroorganisme yang mewakili semua kingdom biologi dan diimplikasikan dalam proses fisiologi dan patologi yang luas, termasuk pathogenesis beberapa infeksi mikroba (5,44), melanoma malignan (14, 34), penyakit Parkinson (9, 12, 45), uveitis ruang anterior traumatic (3, 4, 18), dan vitiligo (22, 43). Melanin adalah imunologi aktif, karena mereka dapat menginduksi

sel T bebas antibody kuat yang berespon pada mencit (27) dan mempunyai sifat anti inflamasi (1, 25). Cryptococcus neoformans adalah suatu hifa yang tidak berkapsul seperti jamur yang dikenal sebagai pathogen pada individu yang mengalami penurunan system imun, termasuk 68% pasien dengan AIDS (24). Terdapat bukti yang nyata bahwa C.neoformans mensintesis melanin selama infeksi (28, 29, 36). Eksperimen in vitro menunjukkan bahwa melanin adalah dilokalisasi dalam dinding sel cryptococcal (39) dan dapat menyumbangkan virulensi dalam bagian tersebut karena kemampuannya untuk mengikat dan menetralisasi oksidan (11, 15-17, 32, 42), peptide mikrobicidal (10), dan obat-obatn anti jamur (41). Melanisasi juga meningkatkan muatan negative C.neoformans (26), yang menyebabkan pengurangan kepekaan sel melanin terhadap fagositosis oleh sel efektor host (2, 39). Komponen system komplemen memegang peranan penting dalam resistensi infeksi cryptococcal, karena deposisi komplemen fragmen C3 ke dalam kapsul polisakarida sel C.neoformans adalah penting untuk fagositosis optimal dan kejelasan jamur (6-8, 19). Walaupun, sifat imunologi melanin, interaksi pigmen ini dengan system komplemen belum diteliti. Tujuan penelitian ini adalah menentukan (i) apakah melanin alami dapat berinteraksi dengan system komplemen dan (ii) apakah melanisasi C.neoformans mempengaruhi aktivasi kompelemen melalui sel jamur. Penelitian kami menunjukkan bahwa melanin dapat mengaktivasi jalur komplemen alternative; akan tetapi, melanisasi tidak mempengaruhi kinetic deposisi total fragmen C3 ke dalam sel neoformans.

Material dan Bahan Sel jamur. C. Neoformans serotype strain D 3501 dan 24067 dan strain Aspergillus niger J9901 diambil dari koleksi kultur jenis Amerika. Melanisasi sel jamur. C. neoformans 3501 ditumbuhkan dalam medium minimal (15 mM glukosa, 10 mM MgSO4, 29,4 mM KH2PO4, 13 mM glycine, 3 UM vitamin B, pH 5,5) dengan atau tanpa 1 mM L-3,4 didydroxyphenylananine (L-DOPA) selama 8 hari pada suhu 30

C dalam rotatory putaran 150 rpm. Hanya sel yang tumbuh dengan L-DOPA menjadi melanin. C.neoformans 24067 ditumbuhkan selama 15 hari dengan medium minimal L-DOPA. A. niger ditumbuhkan pada agar dekstrose Sabaroud (pH 5,6) selama 5 bulan suhu 30 C agar melanisasi mempunyai conidia. Isolasi melanin jamur. Melanin diekstraksi dari melanin C.neoformans 24067 dan A.niger conidia dengan perlakuan dengan enzim proteolytic dan glycolytic, dengan denaturasi oleh ekstraksi kloroform, dan dengan pencampuran HCL seperti yang telah dijelaskan sebelumnya (34). Partikel melanin juga dikenal sebagai ghost melanin (40) dikumpulkan dari sentrifugasi, dicuci, dan dialysis dalam air suling selama 10 hari. Ghost melanin dicuci dan disuspensikan dalam larutan asam posfat (PH 7,4). Walaupun kemurnian ghost melanin tidak dapat dibuat secara ekuivokal karena kurangnya pengetahuan mengenai struktur melanin. Serum dan protein serum. Darah dikumpulkan dari sedikitnya 10 donor. Sel diisolasi, disimpan pada suhu 85 C. C3 diisolasi dari plasma beku dan dilabel dengan Iodogen. Analisis kinetic ikatan C3 in vitro. Aktivasi kinetic dan ikatan fragmen C3 terhadap ghost melanin atau sel C.neoformans 3501 (melanisasi atau non melanisasi) dinilai dalam campuran yang mengandung (i) 40% serum normal manusia (ii) GVB mengandung gelatin , 0,15 mM CaCl2 dan 1 mM MgCL2 (iii)
125 125

I menggunakan

I-label C3 untuk menyediakan aktivitas spesifik 50.000

cpm/ug. (iv) 6,0 x 105 ghost melanin atau sel cryptococcal yang dipanaskan. Tube mengandung semua reagen kecuali sel ghost melanin yang dipanaskan selama 5 menit suhu 37 C dan reaksi diinisiasi dengan penambahan sel ghosts. Duplikasi sebanyak 30 uJ sampel diinkubasi selama interval 1,2,4,6,8,10,16,20, dan 25 menit dan ditempatkan dalam 150 uJ larutan dengan 0,1% sodium dodecyl sulfat dan 20 mM EDTA. Immunofluoresensi (IF) analisis ikatan C3 terhadap melanin. C.neoformans yang mengandung ghost melanin (4x105) diinkubasi dalam 40% NHS selama 2,4,8,16 menit.
125

I-C3

tidak ditambahkan dalam reaksi campuran. Setelah reaksi dihentikan, ghost melanin dicuci 3 kali dengan PBS, resuspensi dalam 100 uJ 1.25 dilusi fluorescin isothyocyanate (FITC).-antiserum konjugasi C3. Dalam PBS mengandung 1% serum albumin sapi diinkubasi selama 1 jam suhu 0 C.

Analisis Immunohistokimia ikatan C3 melanin. 5 mencit galur BALB/c (umur 6-8 minggu) diinjeksi secara intratekal dengan 107 C. Neoformans yang mengandung ghosts. Mencit kemudian dibunuh setelah 7 hari injeksi., dan paru-parunya dikumpulkan untuk dianalisis. Jaringan setebal 4 um diparafin dalam xylene dan direhidrasi dengan inkubasi serial dalam larutan dengan pengurangan konsentrasi ethanol.

Hasil Aktivasi komplemen dengan melanin in vitro. Ghosts melanin diisolasi dari sel C.neoformans melanin in vitro 24067 dan A.niger 19901 conidia kemudian diinkubasi dalam NHS 40% ke dalam ghost melanin yang terjadi di awal setelah 5 menit inkubasi. Mencapai deposisi maksimum kira-kira 1,9 x 106 fragmen C3 per C. neoformans yang mengandung ghost melanin setelah 12 menit dan 1,3 x 106 fragmen C3 per A. niger yang mengandung ghosts melanin setelah 25 menit (gambar 1). Perlakuan NHS dengan EGTA dapat mencegah aktivasi jalur klasik CA2+ (13,31), tidak mempengaruhi kinetic atau deposisi total fragmen C3 ke dalam ghost melanin (data tidak ditunjukkan) mengindikasikan bahwa komplemen aktivasi dengan melanin terjadi melalui jalur alternative. Perbedaan antara jalur klasik dan alternative sulit untuk dibuat, akan tetapi karena konsentrasi 10 fold MgCl2 lebih tinggi digunakan dalam reaksi pencampuran aktivasi perubahan komplemen, yang menyediakan stabilisitas lebih baik dalam pencampuran. Konsentrasi MgCl2 meningkat untuk menghitung EGTA. Jika analisis C.neoformans yang mengandung melanin ghosts dalam NHS menyebabkan deposisi inisial fragmen C3 yang terjadi pada sisi fokal diskret. Jumlah sisi fokal diskret meningkat dengan meningkatnya waktu inkubasi, tetapi distribusi C3 tidak pernah mencapai konfluens (gambar 2). Peneliti tidak menggunakan melanin sintetik dalam penelitian ini, karena melanin sintetik biasanya dibuat oleh inkubasi precursor (seperti L-DOPA) dengan oksidan kimia, seperti H2O2 untuk meningkatkan tingkat polimerisasi ke dalam melanin. Akan tetapi, selama formasi sintetik melanin, oksidan ini menginduksi model polimerisasi lain (33) sebagai degradasi beberapa informasi penting dalam jalur melanogenic alami (37); oleh karena itu, produk akhir mungkin mengandung campuran beragam struktu polimerisasi. Oleh Karena itu, jika oksidan kimia tidak digunakan, banyak reaksi pencampuran atau inkubasi dalam jangka panjang yang dibutuhkan untuk mendapatkan melanin yang cukup.

Komplemen aktivasi melanin in vivo. Diperkirakan 107 C.neoformans yang mengandung ghost melanin diinjeksikan intratekal ke dalam BALB/c mencit untuk menentukan apakah ghost melanin dapat mengaktifkan komplemen dalam jaringan. Komplemen Kinetik aktivasi dengan melanin atau non melanin C.neoformans in vitro. Melanin dan non melanin C.neoformans sel 3501 diinkubasi dalam 40% NHS yang mengandung
125

I-label C3 untuk menentukan apakah melanin dapat mempengaruhi aktivasi komplemen

dengan sel cryptococcal. Untuk kedua melanin dan non melanin C.neoformans, deposisi jumlah fragmen C3 yang dapat diukur ke dalam sel terjadi hanya setelah 4 menit, mencapai maksimum fragmen per sel 1,5 x 107 C3 setelah 16 menit inkubasi (gambar 4). Tidak ada perbedaan tepat dalam jumlah ikatan fragmen C3 antara sel melanin dan non melanin yang diamati pada waktu tertentu setelah data dikorelasikan untuk menghitung perbedaan dalam ukuran kapsul antara sel melanin dan non melanin.

PEMBAHASAN Melanin adalah molekul aktif imunologis (1,25,27). Oleh karena itu, melanin meningkatkan muatan negative sel C.neoformans (26) dan mempengaruhi interaksi mereka dengan sel efektor host (2,37). Observasi ini menyebabkan penulis melakukan eksplorasi dengan sifat aktivasi potensial komplemen melanin dan apakah melanin mempunyai efek dalam aktivasi kompelemen oleh C.neoformans. analisis IF dan kuantitaitf menunjukkan bahwa inkubasi melanin jamur dalam NHS menginduksi deposisi fragmen C3 pada sisi fokal diskret yang gagal menjadi konfluen di permukaan ghost melanin. Ini merupakan perbedaan kualitatif yang penting dari pola deposisi C3 yang diamati dengan sel C. neoformans yang berkapsul dan tidak berkapsul, dimana deposisi C3 menjadi konfluens. Kegagalan deposit konfluens C3 pada melanin ghosts dapat merefleksikan permukaan heterogen dan/atau perbedaan penting antara partikel dalam aksi jalur alternative protein regulasi factor H dan factor I (30). Kira-kira 1,9 x 106 fragmen C3 yang berikatan dengan masing-masing C.neoformans yang mengandung melanin ghost setelah 12 menit inkubasi NHS, dimana diperkirakan 1,3 x 106 fragmen C3 yang berikatan pada masing-masing A.niger yang mengandung melanin setelah 25 menit. Perbedaan ini muncul dalam kapasitas pengikatan yang disebabkan oleh perbedaan dalam

ukuran antara melanin jamur seperti C.neoformans yang mengandung melanin (35) oleh karena itu menyebabkan permukaan deposisi fragmen C3 yang lebih besar. Analisis IF juga menunjukkan deposisi fragmen C3 ke dalam C.neoformans yang mengandung melanin ghosts, mengindikasikan bahwa melanin dapat mengaktifkan system komplemen in vivo. Disamping kemampuan melanin untuk mengaktivasi komplemen, melanisasi

C.neoformans tidak mempengaruhi kinetic atau deposisi total fragmen C3 ke dalam kapsul polisakarida sel cryptococcal. Melanin dalam C.neoformans ditemukan dalam dinding sel (39), dimana lapisan ekstraseluler milieu terbuat dari kapsul polisakarida dan oleh karena itu tidak mampu berinteraksi dengan system komponen dan komplemen. Peningkatan muatan negative dalam sel melanin tidak cukup signifikan dalam mempengaruhi interaksi kapsul polisakarida dengan molekul C3. Walaupun penulis tidak dapat menunjukkan perbedaan dalam tingkat aktivasi kompelemen antara sel melanin dan non melanin, ekstraseluler atau dinding sel yang berikatan dengan melanin dihasilkan dari patohen yang tidak berkapsul yang mempengaruhi aktivasi komplemen melalui permukaan microbial. Interaksi pemaparan melanin microbial dengan system komplemen dapat menyebabkan deplesi kompelemn, yang pada gilirannya menghasilkan pengurangan kepekaan terhadap komplemen yang dimediasi oleh fagositosis oleh sel efektor host. Hal ini dapat menyediakan mekanisme lain untuk melanin dalam virulensi pathogen microbial. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa melanin sintetik dan alami mempunyai sifat antiinflamasi (1,25), yang mungkin disebabkan oleh kemampuan melanin untuk menteralisir radikal bebas dan oksidan (17,23) dan untuk menekan produksi proinflamasi sitokin (1, 25). Hasil dari penelitian kami mengindikasikan bahwa melanin dapat mengaktivasi jalur komplemen alternative, menyebabkan mekanisme yang dapat menginduksi respon inflammasi. Aktivasi komplemen dengan partikel melanin dapat diharapkan untuk menghasilkan komplemen kemotaktik dan proinflamasi komplemen. Dalam penelitian penulis, kami mencatat bahwa injeksi melanin dalam paru-paru memperoleh respon inflamasi yang diindikasikan dengan formasi granuloma kecil. Walaupun temuan ini menyebabkan sifat kontradiksi melanin, sangat mungkin bahwa struktur kompleks pigmen ini terlihat mempunyai peranan yang berlawanan. Hasil penulis menyetakan kemungkinan bahwa melanin alami lainnya, mungkin termasuk melanin manusia, mempunyai potensialisasi untuk mengkatifkan komplemen in vivo.

Kemampuan ini dapat mengindikasikan aktivitas biologi untuk melanin yang dapat menyumbangkan pathogenesis beberapa penyakit autoimun dan penyakit degenerative.