Introduo

As enzimas so protenas que catalisam reaes qumicas, nos seres vivos e possuem um centro ativo, onde se processam as reaes com determinados substratos. O emprego de reaes enzimticas em qumica analtica tem sido amplamente explorado devido a seu alto poder cataltica e alta seletividade A enzima urease, selecionada para o desenvolvimento desta prtica, foi extrado de sementes de soja (outras fontes poderiam ser utilizadas como sementes de melancia). A urease a enzima responsvel pela hidrolise da uria em amnia e dioxo de carbono. Anlises da formao dos produtos da reao catalisada pela urase, seram o ponto de partida a evidenciarmos a caracterizao e propriedades das enzimas.

1 - Objetivo

O principal objetivo dessa prtica evidenciar a influncia da temperatura e do pH na atividade enzimtica, constatar a grande especificidade enzimtica e a ao de inibidores na atividade enzimtica.

2 - Materiais Utilizados

Tubos de ensaio de 10ml; Refrigerador ajustado para 0oC; Forno para banho maria ajusta para 37 e 100oC; Pera; Pipeta 3ml.

3 - Solues Utilizadas

Soluo de Urease (extrada da soja); Soluo tampo 0,1 M pH 7,0 contendo 1% de Tiouria; Soluo tampo 0,1 M pH 7,0 contendo 1% de Uria; Soluo tampo 0,1 M pH 4,0 contendo 1% de Uria; Soluo tampo 0,1 M pH 5,0 contendo 1% de Uria; Soluo tampo 0,1 M pH 6,0 contendo 1% de Uria; Soluo tampo 0,1 M pH 7,0; Soluo de Vermelho de Fenol ( 0,1g de vermelho de fenol dissolvido em 250ml de agua destilada alcalinizada com 2,82ml de NaOH 0,1N) Soluo de Cloreto de Mercrio a 0,01%; Soluo de Uria a 1%.

4 - Procedimentos Realizados e Variaes Fsicas Observadas

Os procedimentos realizados foram divididos em cinco experimentos independentes. Sendo que as solues utilizadas (descritas no item 3), foram previamente preparadas por outra equipe. Primeiro experimento; determinao da atividade enzimtica. Foram preparados dois tubos de ensaio, o primeiro com 3ml da soluo tampo pH 7 com 1% de ureia, 3 gotas da soluo de urase e 3 gotas da soluo do indicador cido-base, vermelho fenol. Inicialmente ambos os tubos apresentaram uma colorao alaranjada, aps aproximadamente uma hora observou-se a mudana de colorao no tubo um para um tom de vermelho, conforme a figura 1.

Segundo experimento: Influncia da temperatura sobre a atividade enzimtica. Foram preparados trs tubos, inicialmente adicionou-se em cada tubo 5 gotas de urase e 3ml da soluo tampo pH 7 sem ureia, o rotulado como dois foi colocado no refrigerador a 0oC, o rotulado como trs, em banho maria a 37oC e o como um em banho maria a 100oC, todos por um perodo de 20mim, em seguida foram adicionados em cada um deles 0,3ml da soluo de ureia a 1% e trs gotas da soluo de vermelho fenol, aps cinco minutos observou-se as coloraes conforme mostradas na figura 2, para cada tubo.

 Terceiro experimento: Inibio da atividade por sais de Mercrio. Em um tubo de ensaio adicionou-se 2ml de gua destilada, duas gotas de soluo de urase e uma gota da soluo do Cloreto de Mercrio a 0,01%, aps agitao adicionou-se 3ml da soluo tampo pH 7 contendo ureia a 1% e uma gota da soluo de vermelho fenol. Um segundo tubo foi preparado, porm sem a soluo de cloreto de mercrio, aps cinco minutos observou-se as coloraes conforme a figura 3.

 Quarto experimento: Teste de especificidade enzimtica. Foram preparados dois tubos de ensaio, ambos com duas gostas da soluo de urase e trs gotas da soluo de vermelho fenol, porm o tubo que especificamos como tubo um, foi adicionado 3ml da soluo tampo pH7 com 1% de ureia, enquanto que o especificado como tubo dois, foi adicionado 3ml da soluo tampo pH7 com 1% de tiureia. Agitou-se as misturas e aps cinco minutos observou-se as coloraes conforme mostradas na figura 4.

Quinto experimento: preparou-se quatro tubos de ensaio, cada um deles com trs gotas da soluo de vermelho fenol, trs gotas da soluo de urase, e 3ml da soluo tampo com 1% de uria, porm a soluo tampo usada no tubo que foi identificado como tudo um, era de pH7, o tubo identificado como dois, era de pH4, o identificado como trs, era de pH 5 e o identificado como tubo quatro era de pH 6. Aps cinco minutos as misturas apresentaram as coloraes mostradas na figura 5.

5 - Fundamentaes Tericas e Discusses dos Resultados

Para que possamos compreender os resultados obtidos experimentalmente necessrio que tenhamos algumas fundamentaes tericas, como; a composio qumica do substrato e produtos da catalise enzimtica, noes gerais sobre a variao da atividade enzimtica em funo da variao de temperatura e pH, especificidade das enzimas, ao de inibidores e as caractersticas do indicador cido-base vermelho fenol.

5.1 - Reao Catalisada pela Urase

A urase uma enzima que catalisa a hidrlise da uria em dixido de carbono e amnia conforme equao abaixo;

+ H2O CO2 + 2NH3

A hidrlise da uria promove a elevao do pH, em funo da insero de amnia no meio. Essa ser a caracterstica chave para evidenciarmos a ocorrncia da catalise e a sua intensidade, mesmo que de forma qualitativa. Em meio aquoso ocorre a reao da amnia com a gua formando hidrxido de amnio, e a reao da gua com dixido de carbono formando o cido carbnico, formando assim o carbonato de amnio (que e uma sal de carter bsico, a atividade enzimtica e verificada pela formao de carbonato de amnio), conforme reaes abaixo;

2 NH3 + 2 H2O 2 NH4OH

CO2 + H2O H2CO3

H2CO3 + 2 NH4OH (NH4) 2CO3 + 2H2O

5.2 - Variantes da Atividade Enzimtica

Fatores como pH e temperatura atuam no mecanismo cintico das reaes enzimticas, podendo aumentar ou diminuir a velocidade reacional pela modificao na estrutura do sitio ativo, alterando assim a atividade cataltica. A grande sensibilidade da reao cataltica em funo da temperatura e pH, os fazem fatores limitantes em relao a atividade enzimtica. Para cada enzima existe valores ideais de pH e temperatura, no que diz respeito a performance da sua atividade enzimtica. Estudos da atividade enzimtica da urase em funo da temperatura e pH so resumidos nos grficos abaixo;
1

1 - trabalho experimental realizado por Amaral, K.C.O.G (UFRN), publicado no endereo eletrnico; http://www.abq.org.br/cbq/2008/trabalhos/4/4-3714759.htm

5.3 Vermelho de fenol

O vermelho fenol um cristal vermelho, cuja formula estrutural apresentada na figura 6.

A soluo de vermelho de fenol usada como indicador de pH, apresentando uma gradual transio do amarelo ao vermelho entre o pH 6,6 e 8, acima do pH 8,1 apresenta uma colorao rosa conforme figuara 7,

5.4 - Interpretaes dos Resultados

Para interpretarmos os resultados adequadamente necessrio que esteja consolidada a idia de que a elevao do pH no meio est relacionado com a atividade enzimtica, que injeta amnia e dixido e carbono no meio promovendo a formao do sal carbonato de amnio (bsico), e que as variaes de colorao das misturas, promovidas pelo indicador cido-base, vermelho fenol, representa essa formao, que por sua vez representa atividade enzimtica. Primeiro experimento: relacionando as coloraes observadas em ambos os tubos de ensaio, os colocamos em diferentes pontos na escala de pH, conforme caractersticas do indicador vermelho fenol, verificando um pH mais elevado no tubo um, caracterizando a atividade enzimtica, figura 8.

Segundo experimento: nesse experimento ao tentarmos posicionar de forma relativa os trs tubos na escala de pH, encontramos muita dificuldade em funo da proximidade de suas cores, entretanto observamos um tom mais avermelhado no tubo um (100oC), provavelmente por ter ocorrido hidrlise da uria em funo da temperatura, j que nessa temperatura esperada a desnaturao da urase pelo calor, no havendo assim atividade enzimtica, j o tubo dois( 0oC) apresenta um tom mais avermelhado que o tudo trs (37oC), o que no est de acordo com estudos anteriores publicados e fontes confiveis, que diz que a atividade enzimtica da urase maior na temperatura 37oC do que em 0oC. Os resultados demonstram que ocorreram falhas na execuo do experimento, figura 9.

Terceiro experimento: posicionando de forma relativa os dois tubos na escala de pH, observamos que o tubo dois muito mais bsico que o tubo um (figura 10) o que evidencia a atuao do cloreto de Mercrio como agente inibidor da catlise enzimtica da urase.

Quarto experimento: observamos um tom amarelado no tudo dois, j no tubo um observamos um tom de vermelho (figura 11), o que caracteriza a atividade enzimtica no tubo um e a no atividade no tubo dois, evidenciando assim a especificidade da urase em relao a ureia. Vale ressaltar a grande similaridade da uria em relao a tiuria (figura 12)

Quinto experimento: fundamentando-se nas mudanas de colorao proporcionada pelo vermelho fenol, posicionamos os quatro tubos em funo do pH, tendo o tubo um (tampo pH7) o maior pH, sequencialmente o tubo quatro, trs, e dois (figura 13) o que demonstra maior atividade enzimtica no

tubo um, reduzindo a atividade com a reduo do pH da soluo tampo com ureia utilizada, evidenciando assim a influncia do pH na atividade enzimtica. No tudo dois (tampo 4), no h nenhum indicio de atividade enzimtica em funo da acentuada colorao amarela.

Concluso

Falhas operacionais ocorreram, porm nada que comprometa os objetivos esperados. Nessa prtica trabalhamos com propriedades das enzimas de carter limitante; restries funcionais, fragilidade, vulnerabilidade a ao de agentes inibidores, o que no reduz a grandiosidade do universo das enzimas, sem dvida est entre as obras mais fascinantes da engenharia qumica da vida.

Referencias Bibliogrficas LEHNINGER, Albert Lester Princpios de Bioqumica 2 ed. Editora Sarvier, SP, 839p. 1993. http://www.abq.org.br/cbq/2008/trabalhos/4/4-371-4759.htm, acessado em 10/05/2012