AUTOMATIZACION EN EL AREA DE BACTERIOLOGIA En la medicina actual y con el desarrollo importante de resistencia en cocceas Gram positivas (Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus)

y bacilos Gram negativos(enterobacterias y no fermentadores) resulta difcil para el clnico predecir los patrones de resistencia en las infecciones que afectan a los pacientes crticos. La terapia emprica se inicia generalmente con antimicrobianos de amplio espectro, de alto costo y numerosos efectos adversos. Si el laboratorio de microbiologa no entrega resultados oportunos, esta terapia inicial puede prolongarse por ms tiempo del necesario. Es as importante abreviar los tiempos de respuesta por parte del laboratorio, lo que no es posible con los mtodos convencionales deestudio de susceptibilidad antimicrobiana. Los sistemas automatizados acortan estos tiempos porque mejoran la sensibilidad analtica de los mtodos, es decir, son capaces de detectar el desarrollo bacteriano en una suspensin, con y sin antimicrobianos, antes que el laboratorista pueda detectar turbidez. Este es el fundamento de los sistemas automatizados de estudio de susceptibilidad, por diferentes mtodos (colorimetra, turbidimetra, fluorometra, etc) detectan el desarrollo bacteriano en micropaneles que contienen diluciones seriadas del antimicrobiano, estableciendo la mnima concentracin del antimicrobiano que es capaz de inhibir el desarrollo bacteriano VENTAJAS DE LOS SISTEMAS AUTOMATIZADOS DE ESTUDIOS DE SUCEPTIBILIDAD BACTERIANA

DESVENTAJAS DE LOS SISTEMAS AUTOMATIZADOS DE ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA IDENTIFICACION Y ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD BACTERIANA

Sistema Semiautomatizados y Automatizados en el Per MicroScan Walkaway (Dade) Sistema Vitek (BioMerieux) Sistema Phoenix (Becton Dickinson)

MicroScan Equipos
Los sistemas para microbiologa MicroScan proveen una nueva generacin de pruebas automatizadas para la identificacin bacteriana y las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos junto con la introduccin de su nuevo sistema de manejo de datos LabPro y el nuevo sistema Alertex, la automatizacin es ms inteligente para el manejo de la administracin de la base de datos de sus clientes, control de infecciones y datos epidemiolgicos. LabPro software proporciona un manejo gerencial de la informacin, exclusivo para los sistemas MICROSCAN proporcionando soluciones simples para aerodinamizar el flujo de trabajo; es la parte medular de nuestros sistemas WalkAway 96SI, WalkAway 40SI, AutoScan-4 y Manual LabPro, puede completar sobre el 90% de su flujo de trabajo diario con slo 5 clicks del mouse. El windows NT del sistema operativo es fcil de usar y fcil de aprender con un mnimo de entrenamiento. Los sistemas WalkAway con su avanzada tecnologa nos ofrecen un principio de seguridad en las pruebas de MIC al obtener verdaderos resultados de concentracin mnima inhibitoria, automatiza ms del 90% de su rutina y tiene la capacidad para procesar pneles rpidos y convencionales al mismo tiempo. Disponible en 2 modelos WalkAway 40 y WalkAway 96. El Nuevo sistema WalkAway 96 Plus con la misma fortaleza que sus antecesores, ahora con un sistema de deteccin de nivel de reactivos, conexin opcional de agua, mayor capacidad de reactivos, conectividad remota para diagnstico del instrumento. AutoScan-4 sistema de lectura automatizada de pneles convencionales en slo 5 segundos simplificando las pruebas de identificacin y susceptibilidad a los antimicrobianos y la estandarizacin de resultados.

PNELES MICROSCAN La versatilidad de pneles que MicroScan ofrece se adapta a sus necesidades; se tiene pneles convencionales para gramnegativos y grampositivos con lectura a partir de las 16 horas de incubacin y pneles rpidos para gramnegativos y grampositivos con lectura de ID a 2 horas y susceptibilidad a partir de las 3.5 horas con diferentes configuraciones de antimicrobianos en diferentes formatos: Panel ID. Panel MIC o panel BP. Panel combo ID+AST-MIC. Panel combo ID+AST-BP. Pneles Convencionales con prueba de Confirmacin de ESBL incluida.

PNELES CROMOGNICOS rpidos para identificacin de levaduras, anaerobios y microorganismos difciles (Neisseria, Haemophilus, Gardnerella, Moraxella) en slo 4 horas. VENTAJAS DE LA LNEA MICROSCAN: Dentro de las fortalezas de los pneles MICROSCAN est la versatilidad de lectura visual, evitando la repeticin innecesaria de las pruebas. Vienen en empaques individuales. Los pneles convencionales se mantienen a temperatura ambiente. Los pneles rpidos y pneles cromognicos se mantienen en refrigeracin. Estandarizacin en la prueba al utilizar un panel tipo combo Mismo programa para la validacin de la prueba si se trabaja de forma manual, con lectura automatizada o totalmente automatizado. Diferentes mtodos de preparacin del inculo dependiendo del tipo de microorganismo. Programa de control de calidad en lnea. Control de calidad integrado por panel. Reglas de la CLSI integradas al programa. MIC real. Diferentes formatos de panel. Calibracin automtica de los sistemas MICROSCAN. Mnimo mantenimiento diario. Actualizaciones del nuevo software LabPro sin costo. Personalizacin de reglas, anlisis y reporte de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio. Con capacidad de exportar datos a excel para obtener grficos de los reportes epidemiolgicos.

Microscan AutoScan 4 Semiautomatizado Sistema de Lectura automatizada de paneles convencionales en solo 5 segundos simplificando las prueba ID/AST y la estandarizacin de resultados

MicroScan WalkAway 96 plus Completamente automatizado

MANUAL DE PROCEDIMIENTO

DISEO DE USO

Para utilizar con paneles CIM/Combo de MicroScan para gram negativos deshidratados y paneles combo de punto de corte para gram negativos deshidratados. Los paneles MicroScan estn diseados para determinar la sensibilidad a agentes microbianos y/o a nivel de especie de bacilos gram negativos aerobios y anaerobios facultativos

RESUMEN Y BASES DE PROCEDIMIENTOS

Despus de la inoculacin e rehidratacin con suspensin estandarizada del microorganismo e incubacin a 35C por un mnimo de 16 horas, la concentracin inhibitoria mnima para el microorganismo de pruebas se determina observando la concentracin ms baja de antimicrobiano que muestra la inhibicin de crecimiento. Para la identificacin de bacilos gram negativos fermentadores y no fermentadores se utiliza las pruebas convencionales y cromogenicas modificadas. La identificacin se basa en la deteccin de cambios de PH, utilizacin de sustratos y crecimiento en la presencia de agentes antimicrobianos al cabo de 16 a 42 horas de incubacin a 35C.

PRECAUCIONES

1- Exclusivamente para uso diagnstico de in vitro 2- En todos los procedimientos, debe utilizarse tcnicas de asepsiay las precauciones establecidas para evitar riesgos microbiolgicos teniendo especial cuidado en el caso de los paneles inoculados que tienen microorganismos especialmente patgenos 3- Este material contiene agentes infecciosos y deben desecharse conforme a las normas para la eliminacin de residuos en peligro biolgico 4- Los resultados de esta prueba debern interpretarse siempre de acuerdo a la historia clnica del paciente, la sintomatologa clnica y otras observaciones.

CONSERVACIN Los paneles gram negativo deshidratados deben almacenarse de 2 a 25C

RECOGIDA Y PREPARACION DE MUESTRAS

Las muestras apropiadas deben recogerse, trasportarse y colocarse en medio de aislamientos primarios, siguiendo los procedimientos recomendados en el manual de microbiologa bacteriana

PROCEDIMIENTOS Materiales proporcionados Consulte la etiqueta del producto para ver el contenido especfico. DESCRIPCIN DEL PROCEDIMIENTO

a) PREPARACIN DEL PANEL 1. Extraigo los paneles que se van a utilizar del lugar en el que se conservan en refrigeracin. No los utilices si el envase est daado 2. Abra la bolsa y extraiga el panel. Si se almacena en el frigorfico, extraiga el panel inmediatamente de la bolsa del papel aluminio. 3. Los paneles no deben utilizarse si se da una de las siguientes circunstancias: a) El secante no est presente o est daado b) Los pocillos del panel estn descoloridos 4. Deje que los paneles se equilibren a temperatura ambiente antes de hidratarlos. Los paneles se pueden apilar, colocando una tapa limpia en la parte superior. Una vez abiertos, los paneles deben utilizarse en le mismo da o desecharse

b) PREPARACIN DEL INOCULO El usuario debe prestar especial atencin a la preparacin del inocul, especialmente con los mtodos manuales que son tcnico-dependiente como el sistema Prompt o inculos preparados sin la ayuda de algn instrumento fotomtrico. Nota no se admite las tcnicas de fase logartmica y estacionaria con los productos MicroScan. 1. Tcnicas del estndar de turbidez: mtodo de inoculacin primaria La tcnica del estndar de turbidez se recomienda para la inoculacin para la inoculacin directa de todos los bacilos gram negativos aerobios a) Con un aplicador,asa o bastoncilloestril,tocar la superficie de 4-5 colonias grandes o 5-10 colonias pequeas bien aisladas o morfolgicamente similares, de un cultivo de 18-24 horas en placa de agar no inhibitorio b) Emulsione en 3 ml de agua para el inoculo (agua desionizadaesterilizada en autoclave). La turbidez final debera ser equivalente a la del estndar de la turbidez de 0.5 de McFarland.

Puede conseguir una turbidez equivalente utilizando un Turbidimetro MicroScan con un intervalo de 0.08+- 0.02. tape bien c) Agite la suspensin en el Vortex de 2 a 3 segundos d) Pipetee 0.1 ml (100ul) de la suspensin estandarizada en 25 ml de agua con PLURONIC. Tape bien. Invierta de seis a ocho veces para mesclar REHIDRATACIN E INOCULACIN DEL PANEL La rehidratacin e inoculacin se utiliza usando el sistema RENOK con inoculadores D. si se utiliza un sistema alternativo rehidrate con 115ul +-10 ul de agua de inoculo (PLURONIC). Debe lograrse una concentracin final en pocillo de 3-7x 105 CFU/ml Para asegurar la viabilidad y pureza del microorganismo analizado debe de prepararse una placa de pureza extendiendo el inoculo en una placa de agar apropiada e incubando en las condiciones adecuadas. Si la placa de pureza presenta 2 o ms tipos de colonias vuelva a aislar las colonias y repita la prueba. c) CUBIERTAS BIOQUMICAS PARA POCILLOS 1. usando un cuenta gotas, recubra los LYS,ARG,ORN,DCB con 3 gotas de aceite mineral pocillosGLU,URE,H2S,

2. el medio de los pocillos debe cubrirse completamente con aceite mineral pero el aceite no debe rebasar los pocillos en s. . d) INCUBACIN 1. para asegurar una distribucin homognea durante la incubacin, apile los paneles en grupos de 3 a 5 2. coloque una tapa limpia en la parte superior de cada grupo de paneles para evitar la evaporacin. Las tapas pueden volverse a utilizar. No descontamine las tapas con alcohol, lo pude hacer con agua y jabn. Aclare bien y djelas secar al aire. 3. incube los paneles durante 16 horas a 35C en un incubador sin CO2

e) LECTURA DE LOS PANELES Pueden leerse manualmente utilizando el visualizador de microdilucion de MicroScan y los resultados se registran en la hoja del panel manual o en la instrumentacin MicroScan. 1. Al cabo de 16 horas de incubacin, extraiga los paneles del incubador. 2. Limpie la parte inferior del panel con un pao sin pelusas para eliminar la condensacin o los desechos que pueda haber. 3. Lea los paneles solo si el pocillo de crecimiento esta turbio o si no hay crecimiento en el pocillo de crecimiento. El crecimiento en los pocillos antimicrobianos aparece en forma de turbidez a modo de neblina blanca en todo el pocillo, un botn blanco en el centro del mismo o un crecimiento granular fino en todo el pocillo. el crecimiento inapropiado se caracteriza por una ligera neblina en el pocillo o transparencia del caldo 4. Si los resultados se leen manualmente, regstrelos en la hoja apropiada. 5. Lectura de las sensibilidades antimicrobianas a. Lea todos los antimicrobianos el pocillo CET frente a un fondo negro(iluminado directamente) b. Registre los resultados de sensibilidad/punto de corte de la siguiente forma: 1. Resultados de la CIM a. Tras 16 a 20 horas de incubacin , registre la CIM como la concentracin antimicrobiana ms baja que muestra inhibicin de crecimiento b. Cuando hay crecimiento en todas las concentraciones hay un antimicrobiano, la VIM se registra como superior a (>) la concentracin mxima c. Cuando no hay concentracin en ninguna de las concentraciones de antimicrobianos, la CIM se registra como inferior o igual a la concentracin ms baja. d. Un pocillo transparente en una serie de pocilloscon crecimiento(ej. Crecimiento de 1,2 y 8 ug/ml, pero no a 4 ug/ml) se denomina pocillo salteadoy no se debe de tener en cuenta. 2. Resultado de punto de corte a. Al cabo de 16 a 20 horas de incubacin,si no hay crecimiento en el antimicrobiano, se registra como S (sensible) b. Si hay crecimiento en la menor concentracin de antimicrobiano y no hay crecimiento en la mayor concentracin, se registra como I (intermedio)

c. Si hay crecimiento en ambas concentraciones del antimicrobiano o en un solopocillo con dilucin antimicrobiana, se registra como R (resistente) d. Si hay crecimiento en la mayor concentracin de un antimicrobiano, pero no hay crecimiento en la menor concentracin, el pocillopodra estar contaminado y debe repetirse la prueba. 3. El crecimiento punteado en pocillos aislados indican contaminacin y debe repetirse la prueba. 4. El trailing effect o crecimiento residual( arrastre) puede observarse en algunas combinaciones del frmaco/microorganismo como Proteus con cefuroxima (Crm) e imipenem (Imp), Kserratia con antibiticos beta-lactamicos y b.cepacia y b. pseudomallei con ceftazidima (Caz) y piperacilina (Pi) 6. Lectura de sustratos de identificacin a) Lea todos los sustratos de identificacin usando un fondo blanco, excepto la CET y los antimicrobianos usados para la identificacin ( Cl 4, Cl8, P4, k2, Fd64, To4), los cuales deben leerse usando un fondo negro(( luz indirecta) b) Fermentadores de glucosa: si alas 16 a 24 horas de incubacin, se desarrolla un color amarillo muy fuerte en la GLU, el microorganismo es un fermentador de glucosa y deben leerse las 24 pruebas de fermentadores de glucosa.si el color de la reaccin es de color naranja o rojo, el microorganismo es un no fermentador de la glucosa. En algunas especies no fermentadoras podran producir un color dorado, que debe considerarse negativo. Algunas especies de pasteurella no crecen si el pocillo de glucosas est recubierto con aceite mineral, pero fermentaran la sacarosa y/o sorbitol. Siel pocillo de la GLU no muestra crecimiento y SUC o SOR son positivos, deben considerarse un fermentador de glucosa. c) No fermentadores de glucosa: los no fermentadores de glucosa se pueden leer al cabo de 16 a 24 horas de incubacin, si cualquiera de las siguientes combinaciones de prueba son positivas: (1) ARG y OF/G o ARG y CET. (2) LYS u (3) ORN. Si todas estas reacciones son negativas y hay crecimiento en el pocillo de crecimiento, registre las CIM, CET y los antimicrobianos usados para la identificacin, y vuelva a incubar durante 24 horas adicionales antes de hacer la lectura e identificacin final. d) Si despus de la reincubacion el microorganismo continua mostrndose no-reactivo, asegrese de que el microorganismo ha crecido en carbohidratos rojo fenol (particularmente si hay poco o ningn

crecimiento en el control de crecimientoMuler-Hinton). Si no hay crecimiento en el caldo de carbohidratos rojo fenol debera sospecharse la presencia de un microorganismo exigente como especie de vidrio halofitico y de yersenia que crecen mejor a 25C

CONCLUSIONES

Los estudios de susceptibilidad constituyen una herramienta de gran utilidad en la terapia exitosa de un paciente infectado. Los sistemas automatizados de identificacin y estudio de susceptibilidad ofrece como principal ventaja la disminucin del tiempo requerido en la obtencin de los resultados; sin embargo, son de mayor costo que los sistemas manuales convencionales. Los sistemas automatizados presentan adems otras ventajas que facilitan y mejoran la calidad tcnica de los estudios de susceptibilidad; no obstante, se han descrito restricciones tcnicas a su uso para determinados microorganismos antimicrobianos. Es necesario conocer las ventajas y problemas de estos sistemas y considerarlos al momento de decidir la adquisicin de alguno de estos sistemas y que podran justificar el alto costo de equipamiento y en los insumos, aunque tambin es recomendable una evaluacin local del real impacto clnico que estos sistemas pueden presentar