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Biotecnologa Vegetal

Marcadores moleculares

Qu son los marcadores genticos?

El concepto de marcador surge con los trabajos de Mendel: utiliz los colores de las flores como marcadores que le permitieron estudiar los patrones de la herencia

Gregor Mendel (Moravian Museum, Brno)

Jardn del monasterio donde Mendel realizaba sus experimentos con las arvejas

Tomado de An Introduction to Genetic Analysis, Griffiths A.J.F y col. (2000). W.H. Freeman, New York.

Qu son los marcadores genticos?

Permiten establecer diferencias (polimorfismos) entre dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la misma especie (o a especies emparentadas) Su herencia suele responder a las leyes de Mendel Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo morfolgico (fenotpicos), por ejemplo, color de la flor. Permiten la confeccin de mapas genticos o de ligamiento Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas

Tipos de marcadores genticos

Los polimorfismos de los genes se detectan a travs de sus productos -Morfolgicos -Bioqumicos: isoenzimas y protenas de reserva Base molecular Mutaciones de distinto tipo (puntuales, deleciones, etc.)

Fenotpicos

Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel de ADN -Restriccin + hibridacin molecular (ej., RFLP) -Amplificacin por PCR (ej., RAPD y microsatlites) -Restriccin + PCR: (ej., AFLP) -Conformacin del DNA (ej., SSCP) -Secuenciacin directa Base molecular Mutaciones puntuales o estructurales: inserciones, deleciones, variaciones en el nmero de motivos repetidos en tndem

Genotpicos o moleculares

Comparacin entre marcadores morfolgicos y moleculares

Marcadores morfolgicos

Marcadores moleculares

Influencia del ambiente Bajo nmero Baja cobertura del genoma Bajo nivel de polimorfismo Menos informativos (dominantes o recesivos) Caracteres de madurez Entrenamiento y subjetividad

Sin influencia ambiental y neutros Cantidad ilimitada Amplia cobertura del genoma Alto nivel de polimorfismo Ms informativos (en general codominantes) Anlisis en fases tempranas Sencillos, rpidos y objetivos

Marcadores bioqumicos: Isoenzimas y Protenas de reserva

Marcadores bioqumicos: Isoenzimas

Isoenzimas
Grupo de mltiples formas moleculares de una misma enzima presente en una misma especie, como resultado de la presencia de uno o ms genes que codifican cada una de estas formas.

Las que son relevantes como marcadores genticos son las aloenzimas (o alozimas) que son variantes allicas del mismo gen (o locus) y que presentan una migracin electrofortica diferencial.

Etapas para la deteccin de isoenzimas

Extraccin
- Mtodos no agresivos. Sin desnaturalizacin. - Procesos sencillos, rpidos y poco limpios.

Electroforesis
- Se detectan diferencias en la carga neta de las isoenzimas en geles de almidn o acrilamida. Duracin del ensayo de 4 a 8 horas Tincin: Se realiza una reaccin enzimtica que permite obtener un producto visualizable por empleo de un cromgeno (banda visualizable en el gel).

Interpretacin de los patrones isoenzimticos


- Puede ser delicada porque los patrones de bandas pueden ser complejos.

Deteccin de isoenzimas: Interpretacin de resultados

La interpretacin de los geles puede ser difcil porque los patrones de bandas suelen ser complejos

Adaptado de Ferreira M.E. & Grattapaglia D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica (1995)

La enzima puede ser multimrica: sus subunidades pueden tener un control gentico complejo. Puede ser a travs de alelos del mismo locus (alozimas) o estar situados en diferentes loci (isozimas). Expresin codominante.

Ventajas de la utilizacin de isoenzimas

El mtodo es reproducible. La herencia es mendeliana y codominante. Los patrones estn poco influenciados por el ambiente, aunque muestran especificidad tisular. El procedimiento es rpido y simple. El costo es bajo.

Desventajas de la utilizacin de isoenzimas

El nmero de isoenzimas disponible es limitado (<30 loci). Baja cobertura del genoma. El material hereditario no se analiza directamente. Slo se pueden detectar las mutaciones que se traducen en cambios en la secuencia de aminocidos. Estos cambios modifican la carga neta (movilidad electrofortica) de las isoenzimas. Se analizan nicamente genes estructurales que codifican protenas solubles con actividad enzimtica (no es una muestra representativa de todo el genoma). La actividad enzimtica est influida por las condiciones ambientales, los estados del desarrollo, y las modificaciones postraduccionales. La interpretacin de los patrones es dificultosa.

Deteccin de protenas de reserva

Se extraen mediante procedimientos sencillos a partir de las semillas. Se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes) No se requiere detectar actividad enzimtica. Se visualizan por tincin con Azul de Coomassie.

Deteccin de protenas de reserva

Perfiles electroforticos de protenas de reserva de una poblacin de avena.

Ventajes y desventajas de la deteccin de protenas de reserva

Ventajas:
- Presentan las mismas ventajas generales que las isoenzimas. - Permiten evaluar varios loci en forma simultnea en el mismo gel. - Presentan altos niveles de polimorfismo. - El procedimiento es rpido y simple. - El costo del ensayo es bajo.

Desventajas:
- Proveen baja cobertura del genoma. - Debido a que muchos de los genes codificantes estn estrechamente ligados (familias multignicas), no se puede asumir independencia entre los loci.

Algunas aplicaciones de los Marcadores bioqumicos

Identificacin de individuos/cultivares Estudios de gentica de poblaciones Construccin de mapas genticos Programas de mejoramiento Establecimiento de filogenias

Marcadores genotpicos o moleculares basados en la restriccin enzimtica del ADN

Marcadores genotpicos o moleculares basados en la restriccin enzimtica del ADN

Marcadores moleculares RFLP


Restriction Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin)

RFLP

Perfiles de RFLPs de Solanum commersonii empleando bulk Segregant analysis (BSA)

Anlisis mediante RFLP de los bulks resistente (R) y susceptble (S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas de restriccin HinfI, DdeI, HindIII, DraI, EcoRI, XbaI y StyI (1 al 7). Autoradiografa de los perfiles de RFLP obtenidos con la sonda s1+A/as1+T(584) marcada radiactivamente. Gentileza M.C.Martnez.

Origen del Polimorfismo de los RFLPs

Mutaciones puntuales: Ocurren en sitios de restriccin. Mutaciones estructurales: Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.

Ventajas de los RFLPs

Comprenden un nmero potencialmente ilimitado de loci (alta cobertura genmica). Son codominantes, por lo tanto ms informativos. Permiten una mayor cobertura del genoma que las isoenzimas. Son altamente reproducibles intra- e interlaboratorios. Permiten homologar mapas de ligamiento diferentes. Se pueden usar las mismas sondas en especies relacionadas (sondas heterlogas). Al igual que todos los marcadores moleculares, tienen mayor grado de polimorfismo que las isoenzimas, no son influidos por el ambiente y son selectivamente neutros.

Desventajas de los RFLPs


Algunas especies presentan bajo nivel de polimorfismo (en comparacin con otros marcadores moleculares). Se requiere disponer de sondas especficas para la especie en estudio. La utilizacin de radiactividad introduce altos costos y problemas de bioseguridad. Requieren alta cantidad de DNA. El procedimiento es laborioso y lento.

Aplicaciones de los RFLPs


Mapeo comparativo. Construccin de mapas genticos. Anlisis filogentico.

Marcadores moleculares basados en la amplificacin arbitraria (o semi arbitraria) del ADN

Marcadores moleculares basados en la amplificacin Arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

Marcadores moleculares RAPD


Random Amplified Polymorphic DNAs (polimorfismo de ADN amplificado al azar)

Procedimiento bsico para la obtencin de RAPD

Obtener el material vegetal. Extraer y purificar el DNA. PCR + electroforesis (agarosa o poliacrilamida). Mtodos de separacin/deteccin:
- Agarosa / bromuro de etidio o SYBR green II - Poliacrilamida / nitrato de plata o fluorescencia

Visualizacin de resultados. Interpretar los resultados.

RAPD A B

A B
Se genera producto de amplificacin No se genera producto de amplificacin

Caractersticas del anlisis de RAPDs

Consiste en la amplificacin mediante PCR de ADN annimo, utilizando para ello un nico iniciador de secuencia arbitraria. Los oligonucletidos iniciadores (primers) se disean sin tener en cuenta informacin de la secuencia genmica de la especie a analizar. Normalmente se usa un slo iniciador, de 10 nucletidos de longitud (ms corto que el de una PCR comn) y con un contenido alto en G+C. -Ejemplo: OP-A01

CAGGCCTC

RAPD
Correspondencia entre los fragmentos amplificados y las bandas de un gel

Los RAPDs son marcadores genticos dominantes


No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante

Origen del Polimorfismo de los RAPD

Puede deberse a: inserciones (2), deleciones (3), mutaciones de punto: que impiden la unin del iniciador (4) o crean un nuevo sitio de unin del iniciador (5).

Ejemplo: RAPD en Solanum commersonii empleando bulk segregant analysis (BSA)

Perfiles de RAPD obtenidos con 12 primers (N01 a N12) y los bulks B2R (R) y B2S (S) de una poblacin segregante para resistencia a PVX MS de Solanum commersonii. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5%, TBE 1x) teido con bromuro de etidio. Gentileza Lic. M.C. Martnez.

Ejemplo: RAPD en sorgo (parentales, F1 y F2 segregante)

IS B2 F1

F2

Segregacin de un marcador RAPD. DNAs de IS, B2, F1 y 20 individuos F2 amplificados con el primer OP H02. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5 %, TBE 1x) teido con EtBr. Gentileza Dr. D.C. Lijavetzky.

Problemas en la Interpretacin de bandas de RAPDs

Problemas de subjetividad: - qu bandas se incluyen en el anlisis y cules no? Problemas de la co-migracin: - Una banda no contiene necesariamente un nico fragmento de DNA. - Una banda del mismo tamao en dos individuos no representa necesariamente el mismo fragmento de DNA.

Ventajas de los RAPDs


No requieren conocimiento previo del genoma (annimos). El ensayo es rpido, simple y econmico. Se dispone de un nmero ilimitado de marcadores. El polimorfismo es elevado. Proveen una amplia cobertura del genoma. Son ms polimrficos que los RFLPs.

Desventajas de los RAPDs

La herencia es dominante (menor informacin genotpica). Poseen problemas de reproducibilidad. La interpretacin de bandas presenta dificultades. Son difciles de transferir a otros laboratorios. A medida que la distancia filogentica aumenta, tambin aumenta la probabilidad de que 2 fragmentos de ADN diferentes comigren y se cometan errores de cmputo (no son confiables para comparacin entre especies distintas)

Aplicaciones de los RAPDs en especies vegetales

Estudios de diversidad gentica. Estudios taxonmicos (relaciones fenticas). Establecimiento de genealogas (paternidad). Determinacin de pureza hbrida. Elaboracin de mapas genticos saturados. Mapeo de genes. Identificacin de material vegetal.

Marcadores moleculares basados en la amplificacin arbitraria (o semi-arbitraria) del ADN

Marcadores moleculares AFLP


Amplified Fragment Length Polymorphism (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados)

Etapas para la obtencin de marcadores AFLP


digestin con Mse I (4pb) y Eco RI (6pb)
Mse I Mse I Eco RI Eco RI Mse I Eco RI

Eco RI tomate 4.000.000 2.800 200.000

Mse I

ligacin de adaptadores preamplificacin con oligos complementarios deteccin

amplificacin con oligos selectivos


AGC ACT

Procedimiento bsico para la obtencin de AFLP

Ejemplo: AFLP en una poblacin segregante de Solanum commersonii


Individuos S * Individuos R * S R

R R

Anlisis de los segregantes de la poblacin 78 y los bulks B3R(R) y B3S(S) con la combinacin de iniciadores E38M42. La banda de inters se indica con una flecha. R: Individuos resistentes, S: Individuos susceptibles, *: Individuos recombinantes. Perfiles de AFLP resueltos e geles de poliacrilamida, visualizados mediante tincin con nitrato de plata. Gentileza Lic. M.C. Martnez

Origen del Polimorfismo de los AFLPs


Resulta de mutaciones de punto, inversiones, deleciones e inserciones que llevan a: - Prdida o ganancia de un sitio de restriccin. - Alteracin de la secuencia reconocida por los iniciadores. Son marcadores dominantes: no es posible distinguir si una banda en un gel es el resultado de la amplificacin de uno o dos alelos.

Ventajas de los AFLP


Annimos: No requieren conocimiento previo del genoma. Nmero ilimitado de marcadores. Polimorfismo elevado. Analizan todo el genoma. Altamente reproducibles. Verstiles: distintas enzimas e iniciadores selectivos.

Desventajas de los AFLP


Herencia dominante.
- (algunos investigadores hacen lectura cuantitativa por densitometra).

Bajo contenido de informacin gentica por locus. Medianamente laborioso. Costo medio.

Aplicaciones de los AFLP en especies vegetales

Estudios de diversidad gentica. Estudios taxonmicos (relaciones fenticas). Establecimiento de genealogas (paternidad). Determinacin de pureza hbrida. Elaboracin de mapas genticos saturados Mapeo de genes. Identificacin de material vegetal.

Referencias

-Moss, D.W. Isoenzymes. Capman & Hall, London & New York. 1982. -Botstein D., White R.L., Skolnick M. & Davis R. W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32:314-331. 1980. -Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski L.A. & Tingey S.D. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535. 1990. -Welsh J. & McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18:7213-7218. 1990. -Caetano-Anlles G., Bassam B.J. & Gresshoff P.M. High resolution DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide preimers. Bio/Technology 9:553557. 1991. -Caetano-Anlles G., Bassam B.J. & Gresshoff P.M. DNA Amplification Fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 4:294-307. 1991. -Caetano-Anlles G. A versatil and universal tool for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 25:1011-1023. 1994. -Vos P., Hogers M., Bleeker M., Rijans M., Van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. & Zabeau M. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414. 1995.

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