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PRACTICA 15

RECUENTO DE HONGOS EN ALIMENTO


I.-OBJETIVOS II.-FUNDAMENTO TEORICO Los hongos microscpicos pudren y malogran materias primas y productos manufacturados (incluidos los distintos alimentos), como el empleo de estos organismos en fermentaciones industriales y en el campo de la biotecnologa. Se trata de organismos fngicos que muestran diferencias considerables en su estructura. Pertenecen a grupos taxonmicos muy diversos y, si bien se pueden observar a simple vista, no obstante producen estructuras diminutas, reproductoras y vegetativas, que no es posible estudiar sin la ayuda del microscopio. Comnmente se da el nombre de moho a ciertos hongos multicelulares filamentosos, dotados de un micelio verdadero, microscpicos, y cuyo crecimiento en los alimentos se conoce fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Por esta concepcin, es inseguro establecer el lmite entre los mohos y ciertos microorganismos encuadrados en las especies esporgenas y productoras de micelio de las levaduras. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de clulas independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilndricas. En algunos casos, forman cadenas de clulas alargadas, adheridas de modo suelto, semejantes a un micelio, por lo que se las denomina seudomicelio. Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia ramificado. De acuerdo con lo expuesto, y segn se ha comentado ya, no existe un lmite de separacin definida entre levaduras y otros hongos que forman un micelio tpico. De la amplia dispersin de los hongos en todos los estratos biticos e inertes se desprende su fcil y frecuente aparicin como contaminantes en productos alimentarios, ya que estos, constituidos por sustancias inorgnicas y orgnicas ms o menos complejas, constituyen excelentes medios para la sustentacin y reproduccin de gran nmero de especies fngicas. Adems, como sucede con las bacterias, diversos factores (pH, Eh, aw, Hr, temperatura, elementos nutritivos, estructuras biolgicas, etc.) influyen en la proliferacin fngica sobre los alimentos. El significado de la contaminacin fngica de los alimentos, especialmente por mohos, viene no solo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino tambin del potencial de mucho de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre tiene

susceptibilidad, as como su capacidad para provocar infecciones e, incluso, reacciones alrgicas en personas hipersensibles a los antgenos fngicos. Para averiguar la carga micolgico de un alimento, se emplea la tcnica usual del recuento en placa de agar a partir de la serie de diluciones decimales del producto. III.-MATERIALES Tubos de ensayo de 16 x 160mm. Gradillas Pipetas graduadas estriles de 1 y 10ml Estufa de cultivo Matraces Erlenmeyer de 250ml. Probetas de 100ml MEDIOS DE CULTIVO

Caldo de triptona soja (TSB) Agua de triptona Solucin de ringer Solucin de tween Composicion: Tween 80: Agua destilada: 0,1 ml 1.000ml

Agar extracto de Levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE)

Composicion: Extracto de levadura Dextrosa Bilis de buey desecada Agar Oxitetraciclina Agua destilada 5g. 20g 5g. 15g. 100ml 1.000ml.

IV.-PROCEDIMIENTO Caldo de triptona soja (TSB) COMPOSICION: * Triptona * Soja * Dextrosa * Cloruro sdico * Fosfato dipotsico * Agua destilada 17g 3g 2.50 g 5g 2.50 g 1.000 ml

Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3. Distribuir en matraces de 100 ml a razn de 9ml. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Agar extracto de Levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE) Disolver los ingredientes por calentamiento y agitacin hasta ebullicin, salvo la oxitetraciclina. Ajustar el pH a 6,5 _+ 0,2.

Distribuir en matraces a razn de 200ml.

Esterilizar en autoclave a 115C durante 10 minutos. Luego Atemperar el medio a unos 45C y aadir 20ml de solucin de oxitetraciclina por cada 200ml de medio.

Luego en cada placa con la respectiva muestra, aadir 20ml de solucin de oxitetraciclina por cada 200ml de medio.

TECNICA Preparado de la muestra del alimento:

La mezcla se suspende en la proporcin 1/9 en Caldo de triptona soja (TSB).

Tras mantener la dilucin inicial de la muestra (1:10) durante 2 horas a temperatura ambiente, partiendo de esta dilucin, se realizan diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1.000, 1:10.000, etc.), en agua de triptona, solucin de tween 80 al 0.01 por 100 solucin de Ringer.

La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa, depositante 1ml de cada una de las diluciones decimales en placas de Petri estriles que midan 90mm de dimetro, adicionar seguidamente el medio de recuento (OGYE), atemperado a 45 C, en cantidad aproximada de 20ml por placa. Es importante dispersar homogneamente la muestra en el medio de recuento para obtener valores correctos. Dejar solidificar horizontalmente a temperatura ambiente.

Incubar en estufa de cultivo a 25C durante 5-7dis. Pasado este tiempo, se procede al recuento de las colonias crecidas, si bien la lectura se comienza al tercer da para observar la formacin de micelios areos invasores. El recuento se establece a partir del numero de colonias aparecidas en una sola dilucin, concretamente la dilucin que proporcione que proporcione un valor medio de colonias fngicas entre 0 y 30 (0 a 50).

El nmero de colonias contadas se multiplica por el factor de dilucin de la placa y se obtiene as el recuento total de unidades formadores de colonia de mohos y/o levaduras por gramo o mililitro de alimento. ufc/ ml = ufc/placa x factor de dilucin x alicuota (si hubiera)

Contador de colonias

Seleccin de las placas y recuento de las colonias:


a) Despus del periodo de incubacin, seleccionar aquellas que presentan de 30 a 300 colonias no difusas. b) Contar las colonias con ayuda de amplificacin, preferiblemente con un contador de colonias tipo Qubec de campo oscuro, provisto de una placa gua marcada en centmetros cuadrados. Deben contarse las colonias incluyendo las puntiformes, que no deben confundirse con partculas de medio no disueltas o sustancias precipitadas. c) Multiplicar el numero total de colonias por l reciproco de la dilucin correspondiente, haciendo la aproximacin hasta el segundo digito que se sigue de tantos ceros como sean necesarios para indicar la dilucin correcta. Por ejemplo, s el conteo de una placa cuya dilucin es de 10 -3 muestra el desarrollo de 128 colonias, el resultado se expresara Recuento estndar en placas por mL = 130.000. No deben expresarse los resultados como numero de bacterias por mL. d) Cuando se preparan placas de la misma dilucin en duplicado, se debe tomar el promedio de los recuentos obtenidos. Si solo una de las placas presenta 30-300 colonias, debe promediarse ese resultado con el otro aunque se salga de dichos valores.

e) Cuando se observa ausencia de placas con 30-300 colonias, se debe contar aquella cuyo recuento se aproximan ms a 300 colonias. f) Si l nmero de colonias observado es excesivamente alto y por lo tanto difcil de contar, se puede calcular contando solamente 13 cuadros (centmetros cuadrados) representativos diferentes y multiplicando el resultado por el factor 5. Si l nmero de colonias por centmetros cuadrados es mayor de 10, se pueden contar solamente las colonias presentes en 5 cuadros y multiplicar el resultado por 13. g) Cuando ninguna placa presenta mas de 30 colonias, se debe contar aquellas de menor dilucin sealndose como menos de 30 veces la dilucin correspondiente; as, en el caso de la dilucin 10-2, el resultado se expresar Recuento estndar en placas = menos de 3.000. h) Si se observan colonias difusas, el recuento total puede estimarse contando reas representativas bien distribuidas pero libres de dichas colonias. Sin embargo esto solo puede hacerse cuando el rea cubierta por esas colonias no es superior a la mitad de la placa.

Equipo para conteo de colonias

Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamao del objeto. Tambin existe un contador electrnico de colonias en el cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se presiona la varilla de cuenta y el nmero exacto de colonias se proyecta instantneamente en una pantalla digital.
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3_4_3recuento.h tm

V.-DISCUSIN a).-Empleando un medio de cultivo de revivificacin: El caldo triptona de soja (TSB) es un medio lquido idneo para la revivificacin de propgulos, posiblemente estresados por las condiciones de los productos analizados. Este paso de revivificacin antes del recuento es necesario, para que todas las unidades formadoras de las colonias existentes en el alimento se encuentren en condiciones de originar una colonia de crecimiento, y as conseguir un recuento fiable. b).- Utilizando medios de recuento

VI.-BIBLIOGRAFIA 1.- MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA metodologa analtitca para alimentos y bebidas, M.a del rosario Pascual Anderson y Vicente Calderon y Pascual, 2000 2.VII.-ANEXOS

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