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susceptibilidad, as como su capacidad para provocar infecciones e, incluso, reacciones alrgicas en personas hipersensibles a los antgenos fngicos. Para averiguar la carga micolgico de un alimento, se emplea la tcnica usual del recuento en placa de agar a partir de la serie de diluciones decimales del producto. III.-MATERIALES Tubos de ensayo de 16 x 160mm. Gradillas Pipetas graduadas estriles de 1 y 10ml Estufa de cultivo Matraces Erlenmeyer de 250ml. Probetas de 100ml MEDIOS DE CULTIVO
Caldo de triptona soja (TSB) Agua de triptona Solucin de ringer Solucin de tween Composicion: Tween 80: Agua destilada: 0,1 ml 1.000ml
Composicion: Extracto de levadura Dextrosa Bilis de buey desecada Agar Oxitetraciclina Agua destilada 5g. 20g 5g. 15g. 100ml 1.000ml.
IV.-PROCEDIMIENTO Caldo de triptona soja (TSB) COMPOSICION: * Triptona * Soja * Dextrosa * Cloruro sdico * Fosfato dipotsico * Agua destilada 17g 3g 2.50 g 5g 2.50 g 1.000 ml
Disolver por calentamiento. Ajustar el pH a 7,3. Distribuir en matraces de 100 ml a razn de 9ml. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Agar extracto de Levadura-glucosa-oxitetraciclina (OGYE) Disolver los ingredientes por calentamiento y agitacin hasta ebullicin, salvo la oxitetraciclina. Ajustar el pH a 6,5 _+ 0,2.
Esterilizar en autoclave a 115C durante 10 minutos. Luego Atemperar el medio a unos 45C y aadir 20ml de solucin de oxitetraciclina por cada 200ml de medio.
Luego en cada placa con la respectiva muestra, aadir 20ml de solucin de oxitetraciclina por cada 200ml de medio.
Tras mantener la dilucin inicial de la muestra (1:10) durante 2 horas a temperatura ambiente, partiendo de esta dilucin, se realizan diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1.000, 1:10.000, etc.), en agua de triptona, solucin de tween 80 al 0.01 por 100 solucin de Ringer.
La siembra de las placas de recuento se lleva a cabo en masa, depositante 1ml de cada una de las diluciones decimales en placas de Petri estriles que midan 90mm de dimetro, adicionar seguidamente el medio de recuento (OGYE), atemperado a 45 C, en cantidad aproximada de 20ml por placa. Es importante dispersar homogneamente la muestra en el medio de recuento para obtener valores correctos. Dejar solidificar horizontalmente a temperatura ambiente.
Incubar en estufa de cultivo a 25C durante 5-7dis. Pasado este tiempo, se procede al recuento de las colonias crecidas, si bien la lectura se comienza al tercer da para observar la formacin de micelios areos invasores. El recuento se establece a partir del numero de colonias aparecidas en una sola dilucin, concretamente la dilucin que proporcione que proporcione un valor medio de colonias fngicas entre 0 y 30 (0 a 50).
El nmero de colonias contadas se multiplica por el factor de dilucin de la placa y se obtiene as el recuento total de unidades formadores de colonia de mohos y/o levaduras por gramo o mililitro de alimento. ufc/ ml = ufc/placa x factor de dilucin x alicuota (si hubiera)
Contador de colonias
e) Cuando se observa ausencia de placas con 30-300 colonias, se debe contar aquella cuyo recuento se aproximan ms a 300 colonias. f) Si l nmero de colonias observado es excesivamente alto y por lo tanto difcil de contar, se puede calcular contando solamente 13 cuadros (centmetros cuadrados) representativos diferentes y multiplicando el resultado por el factor 5. Si l nmero de colonias por centmetros cuadrados es mayor de 10, se pueden contar solamente las colonias presentes en 5 cuadros y multiplicar el resultado por 13. g) Cuando ninguna placa presenta mas de 30 colonias, se debe contar aquellas de menor dilucin sealndose como menos de 30 veces la dilucin correspondiente; as, en el caso de la dilucin 10-2, el resultado se expresar Recuento estndar en placas = menos de 3.000. h) Si se observan colonias difusas, el recuento total puede estimarse contando reas representativas bien distribuidas pero libres de dichas colonias. Sin embargo esto solo puede hacerse cuando el rea cubierta por esas colonias no es superior a la mitad de la placa.
Para el recuento de colonias se emplean equipos que consiste en una pantalla iluminada la cual posee una gran lente de aumento; pueden ser: contadores de colonias en los cuales la caja de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1.5 veces el tamao del objeto. Tambin existe un contador electrnico de colonias en el cual la caja de Petri se ubica en una platina iluminada, luego se presiona la varilla de cuenta y el nmero exacto de colonias se proyecta instantneamente en una pantalla digital.
http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3_4_3recuento.h tm
V.-DISCUSIN a).-Empleando un medio de cultivo de revivificacin: El caldo triptona de soja (TSB) es un medio lquido idneo para la revivificacin de propgulos, posiblemente estresados por las condiciones de los productos analizados. Este paso de revivificacin antes del recuento es necesario, para que todas las unidades formadoras de las colonias existentes en el alimento se encuentren en condiciones de originar una colonia de crecimiento, y as conseguir un recuento fiable. b).- Utilizando medios de recuento
VI.-BIBLIOGRAFIA 1.- MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA metodologa analtitca para alimentos y bebidas, M.a del rosario Pascual Anderson y Vicente Calderon y Pascual, 2000 2.VII.-ANEXOS