Protocole dextraction dADN de Pseudomonas aeruginosa La qualit de lADN obtenu permet deffectuer des PCRs et la technique de RFLP

A partir de colonies sur bote de milieu glos Prlever une anse pleine de colonies sur une bote et les transfrer dans un tube (plastique vis de 15ml) contenant 3 ml de tampon ADN TE (Tris 10mM, EDTA 1mM pH8). Vortexer pour resuspendre les bactries. Ajouter 3ml de tampon de lyse 2X (1% de SDS, 20mM NaCl, 20mM Tris pH8, 20mM EDTA) pour lyser les bactries. Ajouter la protinase K une concentration finale de 100g/ml (solution stock de 10mg/ml conserve 20C) et incuber toute la nuit 37C. Le lysat peut ensuite tre conserv 4C. Dans certains cas, il peut tre utilis pour une PCR aprs dilution au 1/50 dans de leau.

Extraction au phnol/chloroforme
Traitement au CTAB

Pour des bactries contenant dimportantes quantits dalginates, il est ncessaire de traiter le lysat aprs laction de la protinase K avec du CTAB. Diluer le lysat si ncessaire avec du tampon ADN TE pour diminuer la viscosit. Dans des tubes eppendorf de 2ml mettre 600l de lysat SDS/protinase K. Ajouter ensuite 100l de solution de Nacl 5M (0,7M final) dans chacun des tubes puis agiter. Ajouter 40l dune solution de CTAB/Nacl (10% CTAB dans 0,7M Nacl) dans chacun des tubes puis laisser incuber 10 minutes 65C. Remarque : La solution de CTAB/Nacl tant trs paisse il est plus pratique de couper les pointes des cones pour aspirer plus facilement cette solution. Les tapes suivantes se feront sous la hotte chimie (sauf les centrifugations) : Ajouter 750l de chloroforme dans chaque tube puis agiter pour homogniser la solution. Centrifuger 13000g 15C pendant 15 minutes. On rcupre la phase suprieure sans aspirer linterphase (voir schma en fin de paragraphe) et on la transfre dans un nouveau tube de 2ml.

Ajouter 750l de phnol satur pH 7,5 puis agiter pendant une minute pour bien homogniser. Centrifuger 13000g 15C pendant 15 minutes. On rcupre la phase suprieure et on la transfre dans un nouveau tube de 2ml. Ajouter 750l de chloroforme dans chaque tube puis agiter pour homogniser la solution. Cette 2me extraction au chloroforme sert liminer le phnol qui na pas t limin ltape prcdente. Centrifugation 13000g 15C pendant 15 minutes. On rcupre la fraction suprieure et on la transfre dans un nouveau tube de 2ml.

Interphase ne pas toucher

Surnageant rcuprer Solution liminer

Pour les tapes suivantes on ne travaille plus sous hotte : Ajout de 2 volumes dthanol pur. On retourne plusieurs fois le tube et on peut voir apparatre un filament blanc ou un amas correspondant lADN extrait. Centrifuger 13000g 15C pendant 15 minutes. On retourne le tube afin dliminer lthanol et de rcuprer seulement le culot dADN qui reste coll au fond du tube. Attention lADN peut se dtacher du fond du tube et tre limin avec lthanol, on utilise alors la pipette afin dliminer lthanol sans le culot. Ajouter 500l dthanol 80%. Centrifuger 13000g 15C pendant 10 minutes. On retourne le tube afin dliminer lthanol puis on laisse scher les culots obtenus en laissant les bouchons des tubes ouverts.

Aprs une nuit de schage des culots temprature ambiante, on ajoute 200l de tampon ADN TE et on laisse le culot dADN se rhydrater pendant 2 3 heures. Ensuite on ralise une lecture de densit optique (DO) pour connatre la concentration dADN dans chacun des tubes.

Lecture de densit optique (DO) par spectromtrie Cette lecture est ralise laide du spectrophotomtre Nano Drop ND-1000 spectrophotometer (Labtech International) Il est possible dobtenir les valeurs de DO ainsi que les spectres de 220 280nm.