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MPLETA

ATIZACIN

Roche Diagnostics informa


Octubre 2002

Calidad analtica y practicabilidad del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS en la medicin de las concentraciones plasmticas de hormonas tiroideas y vitam inas. El receptor soluble de la transferrina (sTfR), la ferritina y la protena C reactiva como marcadores en el diagnstico diferencial de anemias. Valoracin del analizador hematolgico Sysmex XE2100 en hemopatas malignas. El laboreatorio de hemostasia. Evaluacin del inmunoanlisis de anfetaminas (AMPSX) con aplicacin sensible a MDMA en el COBAS INTEGRA 400. Aplicacin a la deteccin en
Roche Diagnostics S.L. Lab Diagnostics Coprnico, 60 08006 Barcelona Tel. 93 201 44 11

Valoracin del analizador Sysmex XE2100 en la determinacin de reticulocitos en sangre perifrica.

AYOR

CTIVIDAD

muestras de orina. Diagnstico molecular y monitorizacin de la hep a titis C.

Los laboratorios clnicos y su influencia en la calidad asistencial

Roche Diagnostics informa

Calidad analtica y practicabilidad del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS en la medicin de las concentraciones plasmticas de hormonas tiroideas y vitaminas.

La dcada de los noventa se caracteriza, entre otras cosas, por la implantacin de sistemas de gestin de la calidad en todo tipo de empresas, especialmente en las de servicios. El reconocimiento formal de tal implantacin es la certificacin o la acreditacin, segn cual sea la norma de referencia elegida. Los factores que han contribuido al xito de estos sistemas son mltiples y variados, aunque puede decirse que estn relacionados bsicamente con la necesidad de sobrevivir en una sociedad cada vez ms competitiva, en la que las diferencias tecnolgicas entre las distintas marcas son cada vez menores y el valor aadido adquiere, por tanto, mayor relevancia a la hora de elegir y en la que el cliente es cada vez ms conocedor de sus derechos y, por tanto, ms exigente. Al mismo tiempo, se ha producido una reduccin progresiva de mrgenes comerciales que ha trado consigo la necesidad de gestionar mejor los recursos para conseguir la mxima eficiencia posible. Para ello, las empresas han tenido que implantar sistemas de gestin que abarcasen la gestin de la calidad. Esta tendencia ha llegado tambin como es lgico a los laboratorios clnicos. Los factores que han contribuido a ello son del mismo tipo que los ya comentados. Por un lado, se ha producido un aumento de la demanda clnica, consecuencia del progreso en el conocimiento cientfico. A medida que ste ha ido avanzando, ha aumentado la necesidad de conocer el valor de las variables biolgicas que informan sobre el estado de los pacientes actuales y potenciales. Muchos de estos valores se generan en el laboratorio clnico. Al mismo tiempo, se ha producido un aumento sustancial de la demanda cualitativa de los servicios del laboratorio clnico: se solicitan ms procedimientos de medida, en un tiempo de entrega de resultados cada vez ms corto, etc. y todo ello asociado a una contencin del gasto. Para adaptarse a estos cambios, los laboratorios clnicos han tenido que reaccionar reorganizando sus procesos para hacerlos ms eficientes. La implantacin de los sistemas de la calidad es sin duda de gran ayuda en este tipo de reorganizaciones. Tampoco hay que olvidar que muchos laboratorios clnicos estn sometidos a la gestin del hospital al que pertenecen y todos ellos a las administraciones pblicas que les son oportunas. Por tanto, las tendencias de gestin hospitalaria y la reglamentacin en el rea de sanidad han sido y son tambin un factor estimulante de la implantacin de sistemas de la calidad. La legislacin relativa al funcionamiento de los laboratorios clnicos genera preocupacin entre los profesionales, debido fundamentalmente al carcter de obligatoriedad a ella asociado. Pero por este mismo motivo, no pueden considerarse sistemas de certificacin o acreditacin, ya que estos ltimos son, por definicin, voluntarios. La parte positiva de su aparicin es sin duda que muchos profesionales han utilizado la necesidad de cumplir sus requisitos como punto de partida para introducir en sus laboratorios cambios estructurales y organizativos destinados a prepararse para implantar, en una segunda fase, un sistema de la calidad. As, durante la dcada de los noventa los laboratorios europeos han ido adquiriendo conciencia de la necesidad de implantar sistemas de la calidad, pero sin disponer de un criterio uniforme en cuanto a las normas a seguir. Los pases pioneros (Holanda, Reino Unido) desarrollaron normas propias especficas para los laboratorios de este sector. Las acreditaciones obtenidas mediante su aplicacin han estado siendo reconocidas por las autoridades competentes para los efectos que les fuesen oportunos. En otros pases, Espaa entre ellos, los laboratorios que deseaban obtener un reconocimiento formal de su sistema de la calidad optaron por la va de la certificacin ISO 9000 o, aunque en menor extensin, de la acreditacin de laboratorios de ensayo y calibracin (EN 45000, ISO 25, ISO 17025). La elaboracin de una norma armonizada y especfica del laboratorio clnico fue encargada al ISO/TC 212. El resultado de su trabajo fue presentado en setiembre de1999 como norma prEN ISO 15189 bajo el ttulo de Gestin de la calidad en los laboratorios clnicos. Sin embargo, diversos factores, entre los que cabe destacar la publicacin de la ISO 9000:2000 retras el proceso de aprobacin de esta norma. En enero del presente ao, la secretara de ISO public una segunda versin de la norma prISO 15189 con el ttulo Laboratorios clnicos. Requisitos para particulares para la calidad y la competencia, pendiente de aprobacin definitiva. Queda an por definir si esta norma ser de certificacin o de acreditacin y su xito de implantacin entre los laboratorios clnicos. Lo que s parece obvio es que, puesto que recoge requisitos tanto de aseguramiento de la calidad como de competencia tcnica, aquellos laboratorios que opten por ella estarn en condiciones de afrontar las crecientes expectativas de sus clientes actuales y potenciales. Sea como fuere, el camino est tomado y es irreversible, la gestin de la calidad es y debe seguir siendo un requisito fundamental para la supervivencia de cualquier tipo de empresa.
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Los laboratorios clnicos y su influencia en la calidad asistencial.

Valoracin del analizador hematolgico Sysmex XE2100 en hemopatas malignas.

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El laboreatorio de hemostasia.

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Evaluacin del inmunoanlisis de anfetaminas (AMPSX) con aplicacin sensible a MDMA en el COBAS INTEGRA 400. Aplicacin a la deteccin en muestras de orina.

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Valoracin del analizador Sysmex XE2100 en la determinacin de reticulocitos en sangre perifrica.

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Diagnstico molecular y monitorizacin de la hepa titis C.

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El receptor soluble de la transferrina (sTfR), la ferritina y la protena C reactiva como marcadores en el diagnstico diferencial de anemias.

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E D I TA : Ro ch e D i a g n o s t i c s S . L .

Cop r n i co, 6 0

0 8 0 0 6 B a rce l o n a Te l . 9 3 2 0 1 4 4 1 1

Fa x 9 3 2 0 1 9 1 9 2

D I R E CTO R A : Ma i te Pa n a d e ro e.mail: rd.informa@roche.com

C O M IT D E R E DAC C IN: Luis de Cabo, Roser Mas, Ar tur Palet, Jos Luis Salvador, Juan Fernando Daz R EALI ZACIN: Miguel Luis Maier R EVISIN: Rosario Rodrguez Depsito Legal: B-4684-1980

Roche Diagnostics SL no se hace responsable de las opiniones vertidas en los reportajes, artculos e informaciones firmadas contenidas en esta publicacin.

Calidad analtica y practicabilidad del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS en la medicin de las concentraciones plasmticas de hormonas tiroideas y vitam inas
OBJETIVO En este estudio hemos evaluado la calidad analtica del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS en la medicin de las concentraciones sricas de tirotropina (TSH), fraccin libre de la tiroxina (T4L), triyodotironina total (T3), folato y cobalaminas. Las caractersticas metrolgicas estudiadas han sido la imprecisin interdiaria, la detectabilidad funcional del procedimiento de medida de la concentracin srica de TSH, el error sistemtico entre las dos clulas de medida del analizador y el error sistemtico respecto los procedimientos de medida del Elecsys 2010. Tambin se ha examinado la practicabilidad, siguiendo los criterios de la Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular (SEQC). INTRODUCCIN El Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS es un nuevo sistema de inmunoanlisis basado en electroquimioluminiscencia, totalmente automatizado y diseado para la medicin de un amplio abanico de magnitudes. La electroquimioluminiscencia, ya utilizada por el analizador Elecsys, permite una gran amplificacin de la seal, lo que se traduce en lmites de deteccin muy bajos. Las principales diferencias analticas entre este analizador y el Elecsys son la utilizacin de dos clulas de medida en vez de una, lo que agiliza notablemente el procesamiento de las muestras, y la incorporacin de un proceso de prelavado para algunos procedimientos de medida, con el fin de eliminar ciertos componentes sricos de la solucin de reaccin antes de la lectura y evitar contaminaciones. MATERIAL Y MTODOS
Calidad analtica

P. Calzada, P. Rosel, P. Ala, M.. Navarro Bioqumica Hormonal y Gnica (Servicio de Bioqumica), Ciutat Sanitaria i Universitaria de Bellvitge. Barcelona.

procesamiento de los mismos materiales de control durante el mismo perodo) mediante la prueba F-Snedecor. Detectabilidad funcional del procedimiento de medida de la concentracin srica de TSH El lmite de deteccin funcional de un procedimiento de medida se puede estimar a partir del mnimo valor de la magnitud cuya medida tiene un coeficiente de variacin no superior al 20% (calculado a partir de los datos de imprecisin interdiaria). En el caso de la tirotropina resulta muy importante disponer de un procedimiento de medida que posea un lmite de deteccin funcional muy pequeo, para obtener resultados fiables a valores muy bajos. Por este particular inters, los mtodos de medida de la concentracin de TSH se han clasificado segn su detectabilidad funcional, y se habla de mtodos de primera generacin, si tienen un lmite de deteccin funcional entre 1 y 2 mUI/L, de segunda generacin, si est comprendido entre 0,1 y 0,2 mUI/L, de tercera generacin, si est entre 0,01 y 0,02 -mUI/L, y de cuarta generacin, si el lmite de deteccin funcional se sita entre los 0,001 y 0,01 mUI/L. Para el estudio de la detectabilidad funcional del procedimiento de medida de la concentracin srica de TSH se utilizaron mezclas de sueros de pacientes con concentraciones muy bajas de la hormona, preparadas realizando diluciones seriadas a partir de una mezcla de mayor concentracin. De cada una de estas diluciones se prepararon alcuotas que se congelaron y se procesaron una vez al da a lo largo de 21 das. Con los datos obtenidos se calcul el coeficiente de variacin. Error sistemtico entre las dos clulas de medida Para estudiar las posibles diferencias entre las dos clulas de medida se tomaron los datos del procesamiento de los materiales de control clulas. Para cada clula se calcul la media de cada uno de los tres materiales de control de diferente concentracin. Las medias para ambas clulas se compararondo utilizando la prueba no paramtrica de U-Mann-Whitney. Error sistemtico respecto a los procedimientos de medida del Elecsys 2010 La comparacin entre el Mdulo E170 del MODULAR ANALYTICS y el Elecsys 2010 se llev a cabo analizando muestras de pacientes por ambos instrumentos. Se emplearon 795 muestras de TSH, 477 de T4L, 243 de T3, 149 de cobalaminas y 418 de folato, con concentraciones representativas de todo el intervalo de medida. Se aplic el mtodo de regresin lineal no paramtrico de Passing y Bablok.
Practicabilidad

Imprecisin interdiaria Para el estudio de la imprecisin interdiaria se utilizaron materiales de control Lyphocheck (Bio Rad Laboratories) de tres concentraciones diferentes,, que se procesaron en las dos clulas una vez al da durante un perodo de 20 das. A partir de los datos se obtuvieron los coeficientes de variacin (CV) para los procedimientos de medida de las concentraciones sricas de TSH, T4L, T3, folato y cobalaminas. Se compararon estos CV con los CV correspondientes al Elecsys 2010 (obtenidos por el

La practicabilidad del analizador se examin siguiendo el protocolo que propone la SEQC, en el que se exponen una serie

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80 70 60 1400 1200

de criterios subjetivos que elusuario debe valorar segn las caractersticas de su laboratorio, y que se agrupan en seis temas (el entorno, la versatilidad-flexibilidad, la organizacin del trabajo, los controles de seguridad, la formacin de personal y el mantenimiento).

Con el Mdulo E170 se han obtenido imprecisiones significativamente inferiores que con el Elecsys 2010 en el caso de cobalaminas y folato (F- Snedecor, p<0,05). Para TSH, T4L y T3 no se obtuvieron diferencias estadsticamente significativas. Detectabilidad funcional del procedimiento de medida de la concentracin srica de TSH

1000

50

E 170 - Y

40 30

E 170 - Y

800

600

400 20 200 10 y = 1,0409x + 0,287 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 500 1000 1500 y = 0,955x - 59,692

RESULTADOS
Calidad analtica

Los coeficientes de variacin obtenidos para las diversas concentraciones de TSH se muestran en la figura 1.

E2010 - X
Figura 2. Recta de regresin obtenida por el mtodo de Passing y Bablok para T4L.

E 2010 - X
Figura 5. Recta de regresin obtenida por el mtodo de Passing y Bablok para cobalaminas.

Imprecisin interdiaria
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Los resultados de los CV del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS y los del Elecsys 2010 se muestran en la tabla I.
Tabla I. Imprecisin interserial de los diversos procedimientos de medida del Mdulo E170 y del Elecsys. El asterisco (*) indica diferencias significativas.

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19,7 100 90 45 40 35 30

CV(%)

15 10,7

10

80 5,5 2,5 2,8 2,2 2,6 2,6 70 60 50 40 30 20 10 y = 1,0988x - 0,0174

Mdulo E170
NIVELES DE CONTROL MEDIA CV(%)

Elecsys
MEDIA CV (%)

TSH 1 2 3 T4L 1 2 3 T3 1 2 3 Cobalaminas 1 2 3 Folato 1 2 3

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0,55

0,6

0,65

E 170 - Y

E 170 - Y

25 20 15 10 5 0 y = 0,9759x + 1,714

0,408 3,895 23,502 10,02 20,44 71,26 1,254 3,214 4,989 290,3 584,9 825,0

1,8 1,6 1,6 4,3 4,2 6,6 5,6 3,8 3,0 2,8* 2,8 2,5

0,386 3,508 20,729 10,742 21,526 1,484 3,666 5,531 347,9 643,5 880,14 3,44 7,78 13,37

2,0 1,7 2,0 5,3 4,3 5,8 4,2 4,3 7,8 3,9 3,2 25,8 14,7 8,1

TSH (mU/L)
Figura 1. Detectabilidad funcional de la TSH. Representacin de los CV para las diferentes concentraciones de TSH evaluadas.

0 0 20 40 60 80

10

20

30

40

Hemos estimado el lmite de deteccin funcional en 0,010 mUI/L (CV de 19,7%), un valor inferior al del Elecsys 2010, establecido en 0,020 mUI/L. Error sistemtico entre las dos clulas de medida

E2010 - X
Figura 3. Recta de regresin obtenida por el mtodo de Passing y Bablok para TSH.

E 2010 - X
Figura 6. Recta de regresin obtenida por el mtodo de Passing y Bablok para folato.

Se encontraron diferencias significativas (U Mann-Whitney, p<0,05) para T4L (niveles de control 2, 3), cobalaminas (niveles 2, 3) y folato (niveles 1, 2, 3). No se obtuvieron diferencias significativas para TSH y T3.
E 170 - Y

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10

5,26 10,6* 11,05 4,6* 17,75 4,3*

Error sistemtico respecto a los procedimientos de medida del Elecsys 2010 Para todas las magnitudes estudiadas se ha observado un error sistemtico entre los procedimientos de medida del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS y los del Elecsys 2010. Las ecuaciones obtenidas con el mtodo de Passing y Bablok se muestran en las figuras 2 a 6. Para TSH, T3 y cobalaminas existen errores sistemticos y proporcionales entre ambos procedimientos; para T4L, slo un error proporcional (la ordenada en el origen no difiere significativamente de 0); y para folato, slo error sistemtico (la pendiente no difiere significativamente de 1).

y = 0,932x - 0,095

E 2010 - X
Figura 4. Recta de regresin obtenida por el mtodo de Passing y Bablok para T3.

Calidad analtica y practicabilidad del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS

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Practicabilidad

En el estudio de la practicabilidad, los aspectos ms relevantes son los siguientes: Gran capacidad de carga de muestras y elevada velocidad de procesamiento de las mismas, debido a la presencia de dos clulas de lectura. Software completo, grfico e intuitivo, que permite ver en pantalla la situacin de las muestras y en el que destaca el tratamiento de los controles de la calidad (con valores acumulados y grficos). Ausencia de averas o problemas tcnicos durante la evaluacin. CONCLUSIONES Las caractersticas metrolgicas ms destacadas de este estudio se resumen en las siguientes: El Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS mejora notablemente la detectabilidad funcional del procedimiento de medida de TSH respecto la del Elecsys 2010, aproximndose a los procedimientos llamados de cuarta generacin. Los procedimientos de medida de las concentraciones sricas de folato y cobalaminas tienen imprecisiones inferiores a las del Elecsys 2010, probablemente por el prelavado que incorporan los procedimientos de medida de stas magnitudes en el nuevo analizador. Aunque se obtienen diferencias estadsticamente significativas entre las mediciones de una clula y la otra, stas pueden no tener relevancia clnica. De todos modos, este inconveniente siempre puede resolverse fijando la medicin de la magnitud que interese slo por una de las dos clulas.

A. Palet Departamento de Marketing. Roche Diagnostics. Barcelona.

Las necesidades asistenciales demandan una mejora en la eficiencia de los servicios sanitarios, el objetivo es aumentar la eficacia del sistema y contener los costes del mismo. Como servicios intermedios o de soporte, los laboratorios de anlisis clnicos constituyen una de las piezas clave para asegurar la fluidez y la efectividad del proceso (1). Segn este punto de vista los laboratorios deberan adecuarse a las necesidades asistenciales

REFERENCIAS 1. Spencer C. Clinical utility and cost-effectiveness of sensitive thyrotropin assays in ambulatory and hospitalized patients. Mayo Clin Proc 1988;63:1214-22. 2. Stockmann W, Bablok W, Luppa P. Analytical performance of Elecsys 2010: a multicentre evaluation. Wien Klin Wochenschr Suppl 1998;310-21. 3. Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular. Comit Cientfico. Comisin de Instrumentacin. Seleccin y evaluacin de sistemas analticos. Barcelona;1995.

de su entorno, ofreciendo, por lo tanto, los perfiles de pruebas necesarias en cada caso para alcanzar diagnsticos completos y teniendo en cuenta las acciones teraputicas a aplicar. Debera considerarse, adems, el tiempo de respuesta adecuado, dado que ni todas las patologas ni todos los estados del paciente requieren el mismo. La eficacia en el proceso diagnstico resulta esencial para incrementar la eficiencia en el proceso del paciente. El resultado es una mejor estratificacin para permitir a los servicios clnicos decidir con mayor precisin las terapias a aplicar en cada caso. El aumento en la eficiencia teraputica puede redundar en una mayor adecuacin de las estancias hospitalarias y mejorar la gestin del recambio de pacientes (2). Durante los ltimos aos Roche Diagnostics ha desarrollado actividades de asesoramiento en proyectos de organizacin, automatizacin e informatizacin de laboratorios, confeccin de modelos de organizacin flexibles, formacin e intercambio de ideas y experiencias entre profesionales. Esensis supone un punto de inflexin agrupando todas estas actividades e incorporando otras nuevas. Nuestro objetivo es ofrecer soluciones que permitan maximizar la eficiencia en el proceso del paciente. Entendemos que la verdadera calidad de los productos y servicios no es algo que se desprende nicamente de aspectos meramente tcnicos sino que depende, adems, de su adecuacin a las necesidades de cada usuario.

Calidad analtica y practicabilidad del Mdulo E170 para MODULAR ANALYTICS

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Los laboratorios de anlisis y su relacin con el resto de servicios de diagnstico Las nuevas tendencias de gestin se encaminan hacia la optimizacin del proceso del paciente. Son muchos los autores que resaltan la importancia del laboratorio en este contexto (2, 3, 4). Su actividad debe tener en cuenta las necesidades asistenciales de su entorno sanitario, especializndose en dar cobertura diagnstica a los diversos servicios clnicos segn la demanda derivada de las patologas y terapias que deben administrar (figura 1).

correctamente la reorganizacin de las reas de anlisis. En este contexto el laboratorio debe simplificar al mximo el proceso de produccin. Esto se consigue consolidando los distintos grupos de pruebas en sistemas que utilicen distintos principios de medida. Todo el proceso puede as simplificarse considerablemente y queda organizado en reas homogneas segn el tipo de muestra que se utilice: reas de suero, sangre total, plasma y orina. Esta aproximacin permite dimensionar correctamente los equipos a utilizar y racionaliza los costes aadidos al uso de cualquier sistema de automatizacin. Una vez superada esta etapa es relativamente sencillo disear los flujos de muestras ptimos. Aquellos itinerarios que deben seguir los distintos especmenes dentro del laboratorio con el fin de completar todos los anlisis requeridos en el tiempo adecuado (segn procedencia del paciente, servicio peticionario, sospecha diagnstica,). Resulta prcticamente imprescindible el uso de programas informticos de gestin del proceso de las muestras (como por ejemplo el PSM de Roche Diagnostics 5-) para la correcta administracin del rea de produccin. La fase de informacin aadir posteriormente una evaluacin diagnstica completa.

conectividad. Dado que la informacin debe suministrarse a los servicios clnicos es conveniente crear reas de especializacin diagnstica dentro de los laboratorios de anlisis. Estas reas sern las encargadas de establecer conjuntamente con los servicios clnicos todas aquellas recomendaciones y protocolos necesarios para que la labor asistencial se realice de la manera ms efectiva y con la mayor optimizacin de recursos (figura 2). La especializacin diagnstica permite un mejor diseo de los paneles bsicos de pruebas necesarios para los distintos servicios clnicos, facilita la elaboracin de perfiles especficos

global de respuesta requerido y, por lo tanto, las necesidades de priorizacin de muestras que de ello derivan y que debern tenerse en cuenta en el diseo de los flujos de produccin o en la posible implantacin de pruebas cerca del paciente donde fueran requeridas. La disponibilidad de la informacin: historias clnicas, sospecha diagnstica, resultados de otros servicios de diagnstico; es esencial para una correcta evaluacin del estado del paciente a la vez que puede evitar acciones innecesarias que resulten repetitivas. En ambos sentidos, eficacia diagnstica y optimizacin del uso de recursos, contribuye al aumento de eficiencia en el proceso asistencial. Los laboratorios de anlisis pueden constituir, pues, un elemento clave en la mejora de la calidad asistencial y en la eficiencia del proceso del paciente.

GESTIN DIAGNSTICA

Anlisis Epidemiologa Citogentica Cultivos Anatoma Embriologa de imagen celulares patolgica Fertilidad

GESTIN DIAGNSTICA

Otros servicios de diagnstico

Otros servicios de diagnstico


Anlisis Epidemiologa Citogentica Cultivos Anatoma Embriologa de imagen celulares patolgica Fertilidad

Laboratorio de anlisis
Elevado nivel de automatizacin
REA DE SUERO: -BIOQUMICA-INMUNOANLISISURIANLISIS HEMATOLOGA COAGULACIN

Laboratorio de anlisis
Elevado nivel de automatizacin
REA DE SUERO: -BIOQUMICA-INMUNOANLISISURIANLISIS HEMATOLOGA COAGULACIN

Nivel de automatizacin medio


BACTERIOLOGA VIROLOGA PARASITOLOGA CITOLOGA HISTOLOGA

Nivel de automatizacin medio


BACTERIOLOGA VIROLOGA PARASITOLOGA CITOLOGA HISTOLOGA

FASE DE PRODUCCIN FASE DE INFORMACIN

FASE DE PRODUCCIN

La especializacin diagnstica del laboratorio como elemento esencial en el proceso del paciente
Centralizacin de informacin

FASE DE INFORMACIN

IVD Network reas de especializacin diagnstica

IVD Network reas de especializacin diagnstica

Bibliografa
Centralizacin de informacin

Gestin de calidad total

La mejora en la eficiencia de la prctica clnica requiere, formacin, a la propia concepcin de la misin de todos y cada uno de los profesionales sanitarios, al trabajo en equipo y al convencimiento de que la coordinacin es el sistema para trabajar mejor. Todo ello debe quedar plasmado en protocolos previamente debatidos y consensuados para la utilizacin ms efectiva, racional y coherente de los recursos (1, 2, 3) Cuando se trata de conseguir una mayor eficiencia en
GESTIN CLNICA

Gestin de calidad total

1. Barea Tejeiro J. El Hospital, empresa de servicios. Gestin y Evaluacin de Costes Sanitarios. Fundacin Signo 2000; 1: 93 100. 2. Plebani M. The Changing Face of Clinical Laboratories. Clin Chem Lab Med 1999; 37:711-717. 3. Truchaud A, Le Neel T, Brochard H, Malvaux S, Moyon M, Cazaubiel M. New Tools for Laboratory Design and Management, Clin Chem 1997; 43: 1709 1715. 4. Waise A. Clinical Audit and the Contribution of the Laboratory to Clinical Outcome. Clinica Chimica Acta 1999; 280:47 57. 5. Casis E, Garrido A, Uranga B, Vives A, Zufiaurre C. Virtual Automation. Clinica Leadership &
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Figura 1: Los laboratorios de anlisis clnicos y su relacin con el resto de servicios de diagnstico. Divisin de las fases de produccin y de informacin como elemento fundamental en el servicio diagnstico.

GESTIN CLNICA

Validacin diagnstica segn patologas / terapias Gestin de perfiles bsicoa / servicios clnicos Gestin de perfiles especficos / patologas Monitorizacin tratamientos Identificacin requerimientos especficos: -Priorizacin/tiempo total de respuesta-Pruebas reflejas-Nuevos marcadores-

entre otros aspectos, potenciar los valores ligados a la

Validacin diagnstica segn patologas / terapias Gestin de perfiles bsicoa / servicios clnicos Gestin de perfiles especficos / patologas Monitorizacin tratamientos Identificacin requerimientos especficos: -Priorizacin/tiempo total de respuesta-Pruebas reflejas-Nuevos marcadores-

Figura 2: Especializacin diagnstica de los laboratorios de anlisis clnicos como elemento esencial en el proceso del paciente: informacin completa en el tiempo adecuado. La informacin se orienta a la mejora de la gestin diagnstica en reas especializadas y segn las necesidades de los distintos servicios clnicos.

Es importante estructurar los laboratorios separando las actividades relacionadas con el proceso productivo de las que constituyen parte del proceso de informacin, ello permite comprender mejor las necesidades de servicio y abordar
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el diagnstico est claro que la implicacin de los laboratorios de anlisis clnicos es importante. Ya hemos comentado la utilidad que tiene diferenciar entre las fases de produccin y de informacin. Esta ltima no slo se refiere a aspectos de

destinados a una mejor estratificacin de pacientes, aumenta la eficacia en la prevencin del desarrollo de enfermedades y ayuda a la evaluacin correcta del pronstico en pacientes ingresados. Para ello es necesario, adems, asignar el tiempo

Los laboratorios clnicos y su influencia en la calidad asistencial.

Sysmex XE2100
en hemopatas malignas
C. Crcamo, A. Arribas, M.I. de Frutos, A.M. Viloria, M.C. Jimnez y C. Larrocha. Servicio de Hematologa Analtica. Hospital La Paz . Madrid. El objetivo del presente estudio fue la valoracin del analizador hematolgico Sysmex XE2100 (Roche Diagnostics) en el procesamiento de muestras de sangre pertenecientes a pacientes con diversas hemopatas malignas. Para ello se compararon los recuentos de neutrfilos, linfocitos, monocitos,

Valoracin del analizador hematolgico

Standardization in Haemathology (ICSH). Se compararon los recuentos diferenciales de las clulas de serie blanca, primero de la totalidad de las muestras (N=300) y, en segundo lugar, estableciendo cinco grupos representativos de las patologas mayoritarias en la muestra elegida para el estudio. Estos cinco grupos fueron: linfoma no Hodgkin (LNH), sndome mielodisplsico (SMD), leucemia aguda mieloide (LAM), leucemia mieloide crnica (LMC) y mieloma mltiple (MM). Asimismo, se evaluaron la sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) de las siguientes alarmas relativas a la serie blanca proporcionadas por el Sysmex 2100E: Immature Gran (presencia de granulocitos inmaduros), Blasts (presencia de blastos) y Atypical Ly (presencia de linfocitos atpicos). Finalmente se calcul la correlacin entre el porcentaje de granulocitos inmaduros (IG%) y el porcentaje de metamielocitos mas mielocitos hallados en la observacin al microscopio. Las ecuaciones de las rectas de regresin relativas a la comparacin de mtodos se obtuvieron mediante el mtodo matmtico de regresin no paramtrica de Passing-Bablok, siendo IC el intervalo de confianza. El coeficiente de correlacin (r) se calcul aparte. RESULTADOS: Resultados de los recuentos celulares diferenciales del Sysmex XE2100:
1) TOTALIDAD DE LAS MUESTRAS ANALIZADAS (N=300):

25 % de errores con la frmula de Friedewald


( funciona muy bien slo con sueros normolipmicos )

eosinfilos y basfilos proporcionados por el Sysmex XE2100 frente a la frmula diferencial leucocitaria obtenida mediante observacin al microscopio ptico de dichas muestras. Asimismo se determin la sensibilidad y la especificidad de las alarmas relativas a serie blanca que dicho analizador genera en el anlisis de hemopatas.

MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos

Pendiente (IC 95%) 0,996 (0,98 a 1,01) 0,997 (0,97 a 1,02) 1,399 (1,29 a 1,52) 0,923 (0,87 a 1,00) 1,000 (0,83 a 1,08)

Interseccin (IC 95%) -2,53 (-3,18 a 1,78) 0,12 (-0,35 a 0,71) 0,97 (0,38 a 1,59) 0,00 (0,00 a 0,00) 0,00 (0,00 a 0,01)

r 0,92 0,72 0,46 0,95 0,84

MATERIAL Y MTODO Fueron procesadas 300 muestras de sangre total de pacientes diagnosticados de diferentes hemopatologas malgnas, pertenecientes al Servicio de Hematologa y Hemoterapia de nuestro hospital. Todas las comparaciones que se realizaron tuvieron como mtodo de referencia la observacin al microscopio ptico (M.O), la cual fue llevada a cabo por dos observadores expertos, contando cada uno de ellos 200 clulas, segn recomendaciones del International Committee for

2) LINFOMA NO HODGKIN (LNH, N=90):

MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos

Pendiente (IC 95%) 1,041 (1,02 a 1,07) 0,969 (0,9 a 1,02) 1,738 (1,45 a 2,06) 0,962 (0,91 a 1,00) 1,000 (0,78 a 1,25)

Interseccin (IC 95%) -4,85 (-7,07 a 3,15) 0,24 (-0,17 a 0,97) 0,09 (-0,59 a 1,34) -0,02 (-0,10 a 0,00) 0,00 (-0,13 a 0,05)

r 0,98 0,75 0,35 0,98 0,00

LDL DIRECTO
sin frmulas... sin errores

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Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

3) SNDROME MIELODISPLSICO (SMD, N=39):

MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Basfilos

Pendiente (IC 95%) 0,925 (0,80 a 1,04) 0,696 (0,58 a 0,84) 0,970 (0,82 a 1,14) 0,00

Interseccin (IC 95%) -4,23 ( -9,13 a 1,80) 3,09 (1,38 a 4,63) 13,36 (7,47 a 17,17) 0,10 0,00

r 0,90 0,88 0,89 0,00 0,00

Resultados de sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) de las alarmas para las poblaciones de la serie blanca:
1) TOTALIDAD DE LAS MUESTRAS (N=300):

Resultados de la correlacin entre IG(%) del Sysmex XE2100E y el cmputo de metamielocitos mas mielocitos del M.O.:
M.O. Sysmex Ecuacin de Regresin y= 0,44 + 0,24x y= 0,59 + 0,14x y= 0,36 + 1,34x y= 0,48 + 0,06x y= 0,64 + 0,14x y= 0,47 0,31x r 0,768 0,711 0,706 0,822 0,946 0,911

Alarma Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 85 75 35

Especificidad (%) 74 88 98

VPP 66 75 67

VPN 89 88 92

Total LNH SMD LAM LMC MM

Eosinfilos 0,60 (0,50 a 1,2E4932)

4) LEUCEMIA AGUDA MIELOIDE (LAM, N=92):

2) LINFOMA NO HODGKIN (LNH, N=90):

Alarma MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos Pendiente (IC 95%) 0,935 (0,87 a 0,98) 1,045 (0,98 a 1,17) 1,244 (1,01 a 1,53) 0,889 (0,79 a 1,02) 1,100 (0,71 a 1,35) Interseccin (IC 95%) -0,94 (-2,12 a 0,30) -1,28 (-4,93 a 1,97) 0,91 (-0,95 a 2,49) 0,00 (0,00 a 0,00) 0,00 (0,00 a 0,00) r 0,85 0,81 0,40 0,92 0,54 Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 77 67 23

Especificidad (%) 84 93 99

VPP 67 67 75

VPN 90 93 83

DISCUSIN: Respecto al recuento diferencial de leucocitos en la totalidad de muestras analizadas, la correlacin entre Sysmex XE2100E y la frmula manual fue buena para neutrfilos y eosinfilos, adecuada para linfocitos y basfilos, pero mala para los monocitos. El recuento de neutrfilos del Sysmex mostr muy buenas correlaciones respecto al del microscopio en LNH (r = 0,98), LMC (r = 0,99) y MM (r = 0,99) y buenas en SMD (r = 0,9) y LAM (r = 0,85). Respecto a los linfocitos, la mejor correlacin se obtuvo en LMC (r = 0,99), en LNH, SMD y LAM fue buena (r = 0,75; 0,88 y 0,81, respectivamente), pero mala en MM (r = 0,31). Los recuentos de monocitos tuvieron el mejor coeficiente de correlacin en LMC (r = 0.98), seguido de SMD (r = 0,89), pero fue mala la correlacin en LNH y SMD (r = 0,35 y 0,40), y no existi correlacin en el caso de MM (r = 0,11). La correlacin para los recuentos de eosinfilos fue muy buena en LNH y MM (r = 0,98 en ambos casos), buena para LAM (r = 0,92), mala para LMC (r = 0,56) y sin correlacin en SMD. Finalmente, los recuentos de basfilos tuvieron una muy buena correlacin en LMC (r = 0,98), regular en MM (r = 0,64), mala en LAM (r = 0,54), mientras que no hubo correlacin en LNH y SMD. En relacin a la comparacin entre el IG(%) y a la suma de los porcentajes de metamielocitos y mielocitos obtenidos en la frmula manual, las correlaciones fueron buenas para LMC y MM, siendo bastante aceptables en las otras tres patologas estudiadas y en la muestra total.

3) SNDROME MIELODISPLSICO (SMD, N=39):

Alarma Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 82 50 0

Especificidad (%) 17 71 100

VPP 82 60 0

VPN 14 63 100

5) LEUCEMIA MIELOIDE CRNICA (LMC, N=10):

MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos

Pendiente (IC 95%) 0,931 (0,86 a 1,09) 0,90 (0,78 a 1,03) 1,150 (0,92 a 1,37) 0,800 (0,23 a 3,30) 1.051 (0.77 a 1.52)

Interseccin (IC 95%) 1,01(-5,19 a 4.45) 2,10 (-0,80 a 4,19) 1,45 (-4,13 a 4,25) 0,30 (-2,60 a 1,12) -0.08 (-0.90 a 0.30)

r 0,99 0,99 0,98 0,56 0.98


4) LEUCEMIA AGUDA MIELOIDE (LAM, N=92):

Alarma Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 86 84 0

Especificidad (%) 63 86 98

VPP 41 87 0

VPN 94 82 96

6) MIELOMA MLTIPLE (MM, N=28):

5) LEUCEMIA MIELOIDE CRNICA (LMC, N=10):

Alarma MAGNITUD (%) Neutrfilos Linfocitos Monocitos Eosinfilos Basfilos Pendiente (IC 95%) 0,917 (0,86 a 0,99) 0,67 (0,50 a 1,05) 4,329 (1,28 a 12,25) 0,667 (0,40 a 0,89) 1,083 (0,67 a 2,53) Interseccin (IC 95%) -0,92(-1,61 a 0,49) 7,92 (-8,20 a 15,81) 0,39 (-12,20 a 16,00) 0,00 (-0,03 a 0,00) 0,38 (0,00 a 0,47) r 0,99 0,31 0,11 0,98 0,64 Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 100 80 0

Especificidad (%) 100 100 100

VPP 100 100 0

VPN 100 83 90

6) MIELOMA MLTIPLE (MM, N=28):

Alarma Immatue Gran Blasts Atypical Ly

Sensibilidad (%) 85 100 69

Especificidad (%) 80 86 93

VPP 79 70 90

VPN 86 100 78

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Valoracin del analizador hematolgico Sysmex XE2100 en hemopatas malignas.

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Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

A. Oliver Servicio de laboratorio de la Fundacin Puigvert. Barcelona.

EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA No pretendemos realizar una revisin exhaustiva de lo que es la hemostasia y de sus implicaciones clnicas, pero si de dar una visin general de lo que podemos esperar de un laboratorio de hemostasia y como debemos organizarnos para el tipo de pacientes que atenderemos. Asimismo, revisaremos brevemente cuales son los factores que ms pueden afectar a los resultados que informemos y qu debemos hacer para minimizar los errores del laboratorio. FISIOLOGIA DE LA HEMOSTASIA Recordemos brevemente los mecanismos bsicos que intervienen en la hemostasia normal y de los sistemas reguladores de la misma. El proceso de la hemostasia se inicia en el momento en que existe una lesin del endotelio vascular (figura 1). Ello provoca, en primera instancia, una vasoconstriccin refleja

para intentar disminuir el flujo sanguneo a travs del vaso lesionado. En ese instante, las plaquetas se adhieren al subendotelio expuesto representando la primera barrera a la hemorragia. La adhesin de las plaquetas al subendotelio se realiza a travs de un receptor especfico de las mismas (glicoprotena Ib/IX) y mediante la participacin del factor von Willebrand liberado desde el endotelio o por las propias plaquetas. Ello provoca la activacin de las plaquetas, las cuales liberarn ADP de los grnulos densos y simultneamente se inicia la activacin de la cadena de las prostaglandinas a partir del cido araquidnico liberado de la membrana plaquetar para producir tromboxano A2, un potente agregante plaquetar. Todo ello conjuntamente provocar la agregacin de las

celular. Esta protena activa el factor VII plasmtico y el complejo FT-VIIa desencadenar una serie de procesos que producirn la formacin de fibrina a partir del fibringeno (esquema). La malla de fibrina reforzar el tapn plaquetar. La clsica separacin en va extrnseca e intrnseca de la cascada de la coagulacin sigue siendo til a efectos acadmicos y de interpretacin de las pruebas de laboratorio clsicas, aunque no reflejan los mecanismos que suceden in vivo (figura ?). Cuando el cogulo formado ya no es necesario y se ha reparado la lesin vascular, es necesario restablecer la circulacin y es el sistema fibrinoltico el encargado de eliminar el cogulo a travs del principal activador de este sistema, el activador tisular del plasmingeno (t-PA) y del plasmingeno y la propia fibrina (figura ?). Todo el proceso se circunscribe al propio cogulo. plaquetas que circulan en las proximidades de la lesin vascular a travs de otro receptor plaquetar para el fibringeno, la glicoprotena IIb/IIIa, formndose el tapn plaquetar primario. Este tapn hemosttico, frgil, es reafirmado mediante el proceso de la coagulacin plasmtica, el cual tiene lugar en la superficie plaquetar, sustrato sobre el cual se desarrollan los procesos de la coagulacin y la fibrinolisis. La coagulacin plasmtica se inicia principalmente con la exposicin del factor tisular expresado en la superficie QUE LABORATORIO NECESITAMOS? El estudio biolgico de todo este complejo proceso es fundamental para poder detectar y tratar la patologa de la hemostasia. Deberemos adecuar nuestra infraestructura, personal e instrumental al tipo de pacientes que atendemos y hasta qu punto queremos llegar en la exploracin de la hemostasia. Un laboratorio de hemostasia de alto nivel es muy especializado y complejo y abarca diversos aspectos de un laboratorio clnico y de investigacin. Los

procedimientos de la exploracin de la hemostasia comprenden desde la hematologa, bioqumica e inmunologa hasta tcnicas de biologa molecular. El personal tcnico ha de ser altamente cualificado, implicado en la labor clnica y es importante que participe en todas las fases del proceso, desde la extraccin de las muestras hasta su interpretacin. La formacin continuada de nuestro personal redundar en una mejor calidad de nuestro trabajo. En cuanto al instrumental, ser preciso disponer del adecuado para el trabajo a realizar. Bsicamente, un contador de plaquetas y un coagulmetro son imprescindibles. Adems, ser necesario disponer de un agregmetro, un buen espectrofotmetro y un equipo para realizar pruebas de ELISA si queremos ir un poco ms all. El nivel ms alto se reserva para los grandes laboratorios especializados, que utilizan tcnicas analticas complejas. Sin embargo, la tecnologa actual nos ofrece la posibilidad de contar con grandes analizadores automticos que resuelven tanto las tcnicas de rutina como las ms especializadas, por lo que es frecuente encontrarlos en muchos centros hospitalarios. EL ERROR PREANALTICO Uno de los aspectos ms importantes y a la vez frecuentemente olvidado del proceso del anlisis clnico es la presencia del error eventual. Ms adelante hablaremos de los muchos esfuerzos realizados para reducir el error analtico pero, en muchas ocasiones, no se tiene lo suficientemente presente la importancia del error
Tabla I: Factores que afectan al error preanaltico.

Material de extraccin. Tubos, tapones. Anticoagulantes. Aditivos. Agujas. Extraccin de sangre. Transporte de la muestra. Tiempo de espera. Conservacin.

Figura 1: Inicio del proceso hemosttico.

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Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

preanaltico, que es el que se produce desde el momento en que el clnico formula la peticin de laboratorio hasta que la muestra obtenida del paciente entra en la cadena analtica. El error preanaltico puede surgir por un fallo de entrada en la misma secretara del laboratorio, por una toma de muestra defectuosa o por una mala centrifugacin o preparacin de la muestra. En el laboratorio de hemostasia es extremadamente importante una correcta toma de la muestra ya que las condiciones de su extraccin y conservacin afectan mucho los resultados obtenidos. Adems, hay que tener en cuenta que estamos trabajando con muestras perecederas y que es necesario realizar las pruebas en un periodo no superior a 4 horas desde el momento de la extraccin. Los factores que ms influyen en el error preanaltico se muestran en la tabla I. En cuanto a los tubos, hoy en da se acepta que los sistemas de vaco estriles con un volumen de vaco del 80% son adecuados para las pruebas de hemostasia. Estos tubos han de ser de vidrio siliconado o de plstico que no active la coagulacin. Deben estar provistos de tapones diseados para prevenir el efecto aerosol. Es importante utilizar un tamao de tubo adecuado al volumen de sangre que vamos a extraer, ya que si usamos tubos demasiados grandes, podemos provocar un aumento de la activacin de la hemostasia. El anticoagulante utilizado por excelencia en el laboratorio de hemostasia es el citrato trisdico 0,105 a 0,109 mol/L, mejor tamponado con cido ctrico. No es recomendable el uso del citrato al 3,8% ya que puede afectar el ndice internacional de sensibilidad (International Sensitivity Index ISI-) de las tromboplastinas. El pH ha de estar entre 5,1 y 5,3 para mantener la muestra entre 7,3 a 7,45. Hay que tener en cuenta el efecto del hematocrito sobre la idoneidad de la muestra, ya que hematocritos por debajo del 30% o por encima del 55% pueden afectar los resultados, especialmente el aumento del tiempo de tromboplastina parcial activada, por lo que debe corregirse la concentracin del citrato. Otro aspecto muy importante es la extraccin de sangre. Las agujas deben ser inferiores a 1 mm de luz y superiores a 0,7 mm. En ambas situaciones podemos incrementar el trauma de la extraccin. No es aconsejable utilizar palomitas por su tamao y el volumen vaco. Tampoco son recomendables las extracciones a travs de catteres ya que en muchas ocasiones la muestra estar contaminada con la heparina afectando los resultados e invalidndolos. Otra fuente de variabilidad es tambin la posicin del paciente en el momento de la extraccin, la cual ha de realizarse preferentemente en posicin supina a fin de

evitar la hemodilucin por declive y es mejor despus de un reposo de 30 minutos para las pruebas de fibrinolisis (especialmente el . (t-PA). Es conveniente escoger una vena grande que no se colapse y evitar siempre el brazo que no lleve sueros o medicacin. No debemos aplicar el torniquete ms de un minuto y hemos de retirarlo cuando empiece a fluir la sangre. Existen otras condiciones de la extraccin que pueden afectar los resultados, como el ayuno menor de 12 horas, la puncin con el mnimo estrs posible y lo menos traumtica, as como el orden de extraccin de los tubos, ya que los primeros mililitros deben usarse para el llenado de otros tubos que no sean los de citrato y no deben extraerse despus de tubos con EDTA, otros anticoagulantes o activadores de la coagulacin; si se extrae la muestra de un catter, hay que desechar los primeros 10-20 ml de sangre y los tubos deben mezclarse cuidadosamente sin formar espuma. Por ltimo, hay que tener en cuenta que una vez extrada la muestra la deberemos guardar a temperatura ambiente y centrifugarla lo antes posible. El fro activa algunos factores de la coagulacin, como el factor VII. CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA. Las mediciones instrumentales y los fenmenos biolgicos estn sujetos a un mayor o menor grado de variabilidad, cuya importancia depender de la naturaleza de las observaciones efectuadas. Como se desprende de ello, nuestro laboratorio de hemostasia, que hemos adaptado a nuestras necesidades, con el instrumental adecuado, nuestro personal entrenado y con el error preanaltico controlado, dar unos resultados que fluctuarn alrededor del valor real del espcimen en funcin de su propia variabilidad. Hay que tener en cuenta cuatro tipos distintos de variabilidad: Intraserial, dentro de cada serie de determinaciones. Interserial o interdiaria, variabilidad serie a serie o da a da. Intraindividual, variabilidad del propio individuo en diferentes condiciones. Interindividual, variabilidad entre sujetos. Siempre hay que tener presente que en toda determinacin realizada en laboratorio hay un cierto grado de incertidumbre, la cual puede reducirse con un buen control de calidad. El error puede ser de diferentes tipos, pero vamos a referirnos al error analtico que podemos valorar con un buen control de calidad. El error analtico puede ser sistemtico o aleatorio. El primero es el que se produce

Tabla III. Tabla de frecuencias.

Tabla IV: Alteraciones de la hemostasia.

Intervalo de clase 80-85 85-90 90-95 95-100 100-105 105-110 110-115

Frecuencia 1 2 4 6 4 2 1

CONGNITAS Hemofilias A y B. Resto de factores. Trombopatas. ADQUIRIDAS Hepatopatas. Inhibidores de la coagulacin. Trombopenias. Insuficiencia renal. Sepsis.

siempre en una misma direccin, mientras que el segundo es intrnseco al propio proceso analtico. Podemos minimizar el error con un buen control de calidad de los instrumentos, metodologa y reactivos, con una buena formacin de los tcnicos, y un programa adecuado de control de calidad. El control de calidad (CC) es una herramienta fundamental en cualquier laboratorio que quiera saber cual es la calidad de sus resultados. El CC interno nos indicar nuestra variabilidad interna y el externo nos permitir compararnos con otros laboratorios. Lo verdaderamente importante es no efectuar el control de calidad simplemente porque es una tarea que debemos cumplir. A partir de un anlisis cuidadoso del control de calidad hemos de tomar las decisiones oportunas para restablecer la calidad que ofrecemos en nuestro laboratorio, corrigiendo las desviaciones que puedan surgir por mltiples causas. PARMETROS DEL LABORATORIO DE RUTINA Actualmente es difcil llegar a definir con exactitud cual es la rutina de un laboratorio de hemostasia, ya que depender mucho del instrumental y del personal disponible y de las preferencias individuales. Hay que recordar que ninguna prueba de laboratorio sustituye a una historia clnica bien hecha. En el caso de descartar trastornos de la hemostasia, deberemos descubrir aquellos antecedentes trombticos o hemorrgicos que
Tabla II: Pruebas de hemostasia preoperatorias.

Recuento de plaquetas. Tiempo de Protrombina (Quick). Tiempo de tromboplastina parcial activada. Tiempo de trombina. Fibringeno.

puedan ser relevantes como, por ejemplo, hemorragias en la infancia, hemorragias en intervenciones quirrgicas anteriores o tras extracciones dentarias. Presencia de hematomas, equmosis, petequias, etc. Es muy caracterstica la presencia de una afectacin familiar en aquellos casos con trastornos genticos de la hemostasia. Las pruebas bsicas que deberemos realizar como cribaje de la hemostasia se reflejan en la tabla II. Aunque normalmente no se realiza la cuantificacin del fibringeno, ni del Dmero D, incluimos estas dos pruebas por ser las de ms uso despus del estudio preoperatorio. Sin embargo, hay que hacer una serie de reflexiones. Estas pruebas slo nos sirven para detectar una tendencia hemorrgica y no predicen la trombosis. Por otra parte, los trastornos hemorrgicos congnitos son poco frecuentes y, en condiciones normales, es suficiente un porcentaje pequeo de factores para una hemostasia correcta si exceptuamos el nivel de plaquetas. Veamos brevemente que nos aportan cada una de las pruebas que realizaremos. Tiempo de protrombina: Explora la va extrnseca y nos informar especialmente de los dficits de los factores II, V, VII y X. Tambin es sensible a las hipofibrinogenemias y disfibrinogenemias. Es el prueba utilizada como control del tratamiento anticoagulante oral expresado como INR (International Normalized Ratio). utiliza tromboplastina clcica como reactivo. Tiempo de tromboplastina parcial activada: Explora la va intrnseca, informando de los dficits de factores VIII, IX, XI, XII, precalicrena y Quiningeno de alto peso molecular. Este test es muy sensible a la presencia de anticoagulante lpico, dependiendo del reactivo que utilizamos, ya que hay diferencias entre los distintos reactivos comerciales disponibles. Adems nos sirve para monitorizar el tratamiento con heparina no fraccionada.

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El laboreatorio de hemostasia.

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Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

Los reactivos utilizados son la cefalina con activador del sistema contacto y el cloruro clcico. Tiempo de trombina: Explora la fibrinoformacin. Nos detectar las hipo y disfibrinogenemias. Es sensible a la presencia de heparina, productos de degradacin de la fibrina y a las paraprotenas. El reactivos utilizado es trombina bovina. Tiempo de reptilase: Es una prueba similar al tiempo de trombina que utiliza un veneno de serpiente (Bothrops atrox) en lugar de trombina. Es insensible a la presencia de heparina, con lo que nos servir para detectar contaminaciones de la muestra. Cuantificacin del fibringeno: La tcnica ms adecuada es la determinacin del fibringeno coagulable. Muchos instrumentos disponibles en el mercado informan del fibringeno derivado a partir de la densidad ptica del cogulo obtenido en la realizacin del tiempo de protrombina. Este dato es solamente orientativo y no sustituye nunca al fibringeno coagulable. Utiliza como reactivo trombina bovina en altas concentraciones (100 U/ml). Dmero D: Esta prueba nos indica la generacin de trombina y plasmina en el rbol vascular. El dmero D es el producto de la escisin de la fibrina por la plasmina. Se encuentra aumentado en trombosis, tromboembolismo pulmonar, infarto de miocardio, cncer, coagulacin intravascular diseminada, etc. Se trata de una prueba inmunolgica que mide la aglutinacin de partculas de ltex recubiertas de anticuerpos monoclonales contra el dmero D, aunque tambin pueden utilizarse mtodos ELISA. CONCLUSIONES De esta forma un laboratorio de hemostasia, adaptado a sus necesidades, con el instrumental adecuado, un personal entrenado y con el error preanaltico controlado, permitir dar unos resultados ptimos de funcionamiento y actividad.

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EVALUACIN DEL INMUNOANLISIS DE ANFETAMINAS (AMPSX) CON APLICACIN SENSIBLE A MDMA EN EL COBAS INTEGRA 400 APLICACIN A LA DETECCIN EN MUESTRAS DE ORINA

M. Lpez-Rivadulla. Instituto de Medicina Legal. Servicio de Toxicologa Forense. Universidad de Santiago de Compostela.

El incremento en el consumo de las denominadas drogas de diseo o de sntesis, est teniendo una amplia incidencia en la casustica de las intoxicaciones en urgencias hospitalarias. El marco social en que s e e n c u e n t ra n i n m e r s a s e s t a s s u s t a n c i a s , c o n s u m o e n g ra n d e s aglomeraciones (macrodiscotecas, pabellones deportivos, etc), as como el segmento de la poblacin a la que afectan (mayoritariamente jvenes), favorece en gran medida su alto consumo. Adems, ste est sujeto a cambios y tendencias, lo cual favorece que una amplia variedad de compuestos puedan ser incluidos en las pastillas de xtasis. A pesar de esta situacin hay un nmero reducido de procedimientos analticos optimizados que permitan realizar con fiabilidad el escrutinio de estas

sustancias.

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El laboreatorio de hemostasia.

21

2. Material y mtodos.

2.2.2 ESTUDIO PRINCIPAL

MODULAR ANALYTICS SWA Simplificando procesos

2.1 Propsito del estudio. El estudio se ha llevado a cabo con el fin de evaluar el comportamiento tcnico y la fiabilidad del test Anfetaminas con aplicacin sensible a la metilendioxianfetamina (MDMA) en el COBAS INTEGRA 400. Las caractersticas analizadas para la evaluacin del comportamiento incluyeron la imprecisin, la inexactitud, sensibilidad y comparacin de mtodos. Los inmunoanlisis que se compararon con el reactivo a evaluar AMPSX(Cutoff 500 ng/L), fueron el AMPS (valor de corte (Cutoff) 1000 g/L, Roche Diagnostics) y ADX (valor de corte 300g/L, Abbott). El mtodo de referencia utilizado fue la combinacin de cromatografa de gases con espectrometra de masas (GC-MS). 2.2 Diseo experimental y Validacin
2.2.1 PERODO DE FAMILIARIZACIN.

Imprecisin intraserial e interdiaria Materiales y mtodo utilizado


MATERIAL DE MUESTRA

DAT Cal 6 ((0,5 x aproximadamente 250 g/L) AMP 375 (0,75 x aproximadamente 375 g/L) AMP 625 (1,25 x aproximadamente 625 g/L) BDI IV-25% (1,5 x aproximadamente 750 g/L) Mezcla orina humana
APLICACIN

Semicuantitativo y cualitativo
MEDICIN

5 medidas de cada una de las 5 muestras (25 determinaciones en total) 1 serie en INTEGRA 400 2 series (casete 1 semicuantitativo, casete 2 cualitativo) en INTEGRA 700
CALIBRACIN

Imprecisin intraserial Materiales y mtodo utilizado


MATERIAL DE MUESTRA

Principio de la serie
DURACIN

DAT Cal 6 AMP 375 AMP 625 BDI IV-25%


APLICACIN

(0,5 x aproximadamente 250 g/-L) (0,75 x aproximadamente 375 g/L) (1,25 x aproximadamente 625 g/L) (1,5 x aproximadamente 750 g/L)

5 das

Semicuantitativo y cualitativo
MEDICIN

La validacin se realiz calculando la media, la mediana, los valores mnimo y mximo y los coeficientes de variacin. Tabla I
Tabla I. Datos de precisin relativos a la evaluacin del mtodo AMPSX.

5 medidas de cada una de las 4 muestras (20 determinaciones en total) 1 serie en INTEGRA 400 2 series (casete 1 semicuantitativo, casete 2 cualitativo) en INTEGRA 700
CALIBRACIN

Intraserial Material 0,5x 0,75xl 1,0x 1,25x 1,5x Das 5 5 5 5 5 n 100 100 99 100 100 Media [g/L] 296 347 484 596 699 SD 27,81 21,54 31,9 33,07 37,81 CV Media [%] [g/L] 9,4 6,2 6,6 5,5 5,4 280 347 497 602 715

Intediario SD [%] CV

31,27 11,2 24,82 41,28 47,36 51,89 7,2 8,3 7,9 7,3

Principio de la serie
DURACIN

1 da

La validacin se realiz calculando la media, la mediana, los valores mnimo y mximo y los coeficientes de variacin

Diagnostics

Mtodos de comparacin El procedimiento AMPSX se compar con otros inmunoanlisis de anfetaminas, en este caso AMPS y ADX, y con el mtodo de referencia GC-MS. Material: Controles como en los casos anteriores, 500 muestras de orina para anlisis de rutina y 50 muestras de orina positivas a anfetaminas. Se realizaron determinaciones del control por triplicado al

23

Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

comienzo del experimento, determinaciones de cada muestra de orina y otra vez triplicados del control al finalizar el experimento. Se llevaron a cabo realizando 10 experimentos en total en 10 das diferentes.

Tabla IV. Sensibilidad y especificidad de la aplicacin AMPSX respecto del mtodo de referencia (GC-MS).

4. Conclusiones

Bibliografa recomendada

n=546

GC/MS

3. Resultados

Precisin y exactitud. Con el uso de la aplicacin semicuantitativa AMPX, la precisin fue estudiada usando el modelo del National Committee of Clinical Laboratory Standards NCCLS, obtenindose unos coeficientes de variacin (CVs) aceptables (5,4-9,4-7,2-11,2 %). De igual modo los CVs totales en los anlisis interdiarios fueron aceptables (6,0-14,4-6,4-14,8 %, recuperacin media 98-115%). Tabla II y III.
Tabla II. Precisin interdiaria segn el protocolo de la NCCLS para la determinacin de anfetaminas por el mtodo semicuantiativo AMPSX.

63 AMPSX 1400 5

La evaluacin de la nueva aplicacin AMPSX es en trminos generales muy satisfactoria. El concepto de los reactivos Cobas Integra (casete) permite procesar drogas de abuso sin ninguna manipulacin y sin tiempos de espera. La nica operacin a realizar antes de procesar las muestras de rutina es una calibracin por cada casete. El analizador Cobas Integra 400 junto con los reactivos On Line, permite al laboratorio especializado en drogas de abuso, consolidar el men ms amplio conforme a sus requisitos de rutina.

Barbault S, Fichet N, Feldman D, Fievet MH, Thuillier A. Comparison of two urinary tests for rapid screening of drugs of abuse. J Pharm Clin 1999; 18:84-85. Iwersen-Bergmann S, Schmoldt A. Direct semiquantitative screening of drugs of abuse in serum and whole blood by means of CEDIA DAU urine immunoassays. J Anal Toxicol 1999; 23: 247-256. Shindelman J, Mahal J, Hemphill G, Pizzo P, Coty WA. Development and evaluation of an improved method for screening of amphetamines. J Anal Toxicol 1999; 23: 506-510. Boettcher M, Haenseler E, Hoke C, Nichols J, Raab D, Domke I. Precision and comparability of Abuscreen OnLine assays for drugs of abuse screening in urine on Hitachi 917 with other immunochemical tests and with GC/MS. Clin Lab 2000; 46: 4952. Pellegrini M, Rosati F, Pacifici R, Zuccaro P, Romolo FS, Lopez A. Rapid screening method for determination of Ecstasy and amphetamines in urine samples using gas chromatographychemical ionisation mass spectrometry. Journal of Chromatography, B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2002; 769: 243-251. Moore FML, Jarvie D R, Simpson D. Comparison of polyclonal and monoclonal assays for routine screening of urines for amphetamines. Ann Clin Biochem 1996; 33: 78-81. Domke I, Cremer P, Huchtemann M. Therapeutic drug monitoring on COBAS INTEGRA 400 evaluation results. Clin Lab 2000; 46: 509-515.

47

Material 0,5x 0,75x 1,0x 1,25x 1,5x

Das Media [g/L] Mediana [g/L] SD [g/L] CV [%] 10 10 10 10 10 289 369 542 633 749 285 354 533 323,5 732 41,73 42,12 67,38 63,28 45,13 14,4 11,4 12,4 10,0 6,0

Comparacin con otros mtodos Se analizaron 379 muestras de orina por el mtodo AMPSX con el mtodo AMPS, ambos aplicados en el equipo Cobas Integra 400. La recta de regresin no paramtrica obtenida por el mtodo de Passing Bablok se muestra en la figura 1
Figura 1: Comparacin de mtodos. En abcisas el mtodo AMPS; en ordenadas el mtodo AMPSX

2000

AMPSX [mg/mL] Integra 400

Tabla III. Precisin total segn el protocolo de la NCCLS para la determinacin de anfetaminas por el mtodo semicuantiativo AMPSX.

ESTADSTICAS
1500

Material 0,5x 0,75x 1,0x 1,25x 1,5x

n 60 60 60 60 60

Mnimo Mximo Media Mediana SD [g/L] [g/L] [g/L] 191 307 408 516 656 435 487 665 800 909 307 383 555 647 747 307 380 555 634 745,5 45,53 38,72 51,08 57,26 48,13

CV [%] 14,8 10,1 9,2 8,9 6,4

Metodo X: Anfetaminas [mg/L] 379 244,966 152,000 33,000 1.959,000 1.926,000

Metodo Y: Anfetaminas Sensible a MDMA [mg/L] 379 245,836 143,000 33,000 1.948,000 1.915,000

N
1000

Media Mediana Mnimo

500

Mximo Rango

500

1000

1500

2000

Sensibilidad y especificidad. Los resultados de especificidad y sensibilidad para AMPSX, en la deteccin de compuestos derivados anfetamnicos en comparacin con GC-MS fueron de 99,4 y 92,6% respectivamente. El porcentaje de falsos positivos es muy aceptable con la aplicacin (0,6 %), aunque se han obtenido resultados comparables en relacin con la especificidad y sensibilidad usando la aplicacin AMPS (95,6-99%) (tabla IV)

AMPS [mg/L] Integra 400

Regresin Passing Bablock Y = 1.023 * X - 2.909 md(95) = 136.330 N = 379, r = 0.959

24

Evaluacin del inmunoanlisis de anfetaminas (AMPSX) con aplicacin sensible a MDMA en el COBAS INTEGRA 400.

25

Valoracin del analizador Sysmex XE2100 en la determinacin de reticulocitos en sangre perifrica


15

Introduccin:

La determinacin de los reticulocitos en sangre perifrica es de gran utilidad en la evaluacin de los desrdenes de las clulas de la serie roja y para conocer la biopatologa de los hemates. Asimismo el reticulocito est demostrando ser muy eficaz como indicador precoz de recuperacin hematolgica tras los tratamientos de ablacin de la mdula sea (1). Por ello, cada da va adquiriendo mayor importancia la necesidad en el laboratorio clnico de poder disponer de instrumentos que proporcionen de un modo automtico resultados exactos sobre la cuantificacin de reticulocitos y la informacin de su grado de maduracin. El Sysmex XE2100 de Roche Diagnostics es un nuevo analizador hematolgico totalmente automatizado que permite el recuento absoluto de los reticulocitos junto con el anlisis de rutina de las muestras de sangre. Por este motivo, nuestro laboratorio llev a cabo este trabajo con el objetivo de evaluar dicho instrumento en la valoracin de los reticulocitos en sangre perifrica tomando como referencia la observacin al microscopio ptico; asmismo se compar frente a otros dos analizadores hematolgicos -Cell-Dyn 4000 de Abbott y ADVIA120 de Bayer- utilizados normalmente en la determinacin de rutina de reticulocitos en nuestro laboratorio.
Material y mtodos:

En el Cell-Dyn 4000 la medida de los reticulocitos se realiza mediante fluorescencia de argn (longitud de onda de excitacin: 488 nm) en clulas de la serie roja que se han teido con un colorante especfico para los nucletidos. Los dos datos que procesa el CD4000 son la fluorescencia verde (FL1) y la dispersin intermedia de luz angular (IAS), proporcionando informacin sobre el porcentaje, recuento absoluto y grado de maduracin de los reticulocitos presentes en la muestra sangunea. En el ADVIA120, el reactivo de reticulocitos contiene un tensoactivo que esferocita los hemates isovolumtricamente. Asimismo contiene un colorante catinico que tie las clulas segn su contenido en RNA. Tras las reacciones citoqumicas se miden las seales de la difraccin de luz de ngulo bajo, de ngulo alto y de absorcin de cada clula. La absorcin de luz es proporcional al contenido de RNA, de tal manera que los reticulocitos teidos absorbern ms luz que los hemates maduros, proporcionando finalmente un informe sobre diferentes parmetros que valoran el estadio de maduracin de la poblacin de reticulocitos de la muestra. Estadstica: las ecuaciones de las rectas de regresin para la comparacin entre los valores obtenidos con el Sysmex XE2100 con el mtodo manual y con los otros dos analizadores se calcularon mediante la regresin no paramtrica de PassingBablok, calculndose aparte el coeficiente de correlacin.

C. Crcamo, M.I. de Frutos, A. Arribas, Ins Galn, C. Latienda, M.A. Velasco, A.M. Viloria, M.C. Jimnez , C. Larrocha Servicio de Hematologa Analtica. Hospital La Paz. Madrid.

Se procesaron 107 muestras, seleccionadas aleatoriamente, de pacientes remitidos a nuestro laboratorio para anlisis de rutina de reticulocitos. Se presentan los resultados en forma de recuento porcentual (%). El examen al microscopio ptico se realiz con tincin azul brillante de cresilo, contando dos observadores expertos 1000 clulas cada uno. Los tres analizadores que se comparaban estaban perfectamente calibrados siguiendo las recomendaciones especficas por sus respectivos fabricantes. El Sysmex 2100XE utiliza un reactivo de reticulocitos que contiene polimetino. Este colorante penetra al interior de la clula tiendo los cidos nuclicos, es decir, el RNA de los reticulocitos y en el resto de las clulas nucleadas tanto el DNA como el RNA. La muestra se analiza luego por citometra de flujo utilizando un lser semiconductor para detectar la dispersin frontal y lateral de la luz. Los reticulocitos se separan de los hemates maduros por las diferencias en el contenido de ARN y de las clulas nucleadas por diferencias en el contenido de RNA/DNA. Cuanto mayor es la cantidad de cidos nucleicos en una clula ms fuerte es la seal de fluorescencia lateral. A mayor tamao celular ms fuerte es la seal de dispersin frontal. Los reticulocitos son separados fcilmente de los leucocitos ya que el DNA de los ncleos de stos tambin se tie.

Resultados:

En la evaluacin del recuento porcentual de los reticulocitos proporcionado por el Sysmex XE2100 frente a la observacin al microscopio ptico no se observ una desviacin significativa de la linealidad y se obtuvo un coeficiente de correlacin de 0,97 para un total de 107 muestras (Figura 1). En la comparacin

16

Sysmex

12

0 0 4 8 12 RETICULOCITOS SYSMEX VERSUS M.O Sysmex = 0,78 + 0,17 x M.O (N = 107)

M.O 16

Figura 1.

27

Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

HEM
con el CD4000 r fue de 0,95 para 106 muestras, observndose una desviacin significativa de la linealidad (Figura 2); finalmente
16 Sysmex

Discusin:

OS

PA I

12

0 0 4 8 12 Reticulocitos Sysmex vs Reticulocitos CellDyn Sysmex = 0,73 + 0,23xCellDyn (N = 107)

CellDyn 16

Figura 2.

respecto al ADVIA120, no se observ desviacin significativa de la linealidad y para 104 muestras se obtuvo una r de 0,93 (Figura 3).
16 Sysmex

12

Los mtodos automticos de deteccin de reticulocitos basados nicamente en medidas de dispersin de la luz generalmente son incapaces de evaluar cambios sutiles en sus recuentos y por tanto son inadecuados para monitorizar la recuperacin de la serie roja tras las terapias mieloablativas. Este inconveniente se debe a que los mtodos de dispersin tienen una precisin pobre para recuentos bajos y con frecuencia no es satisfactoria su discriminacin entre hemates y reticulocitos. La fluorescencia es el nico mtodo fiable para obtener una informacin cualitativa de la maduracin de estas clulas. Midiendo la intensidad de la fluorescencia, los reticulocitos inmaduros se distinguen por la tincin intensa de su RNA mientras que las formas ms maduras estn menos teidas (3). Los tres instrumentos utilizados en este estudio cumplen con la recomendacin de la doble medida fluorescencia/dispersin de la luz- y por tanto son comparables. Desde el punto de vista estadstico, el Sysmex 2100XE rindi unas buenas correlaciones en las comparaciones frente al mtodo manual y los otros analizadores hematolgicos, sin embargo el XE2100 present una tendencia a la subestimacin del recuento porcentual de los reticulocitos y en el caso de la comparacin del Cell-Dynn 4000 se apreci una desviacin significativa de la linealidad. El hecho de que no se obtuviese identidad estadstica en ninguna de las comparaciones de mtodos efectuadas puede deberse fundamentalmente a que los tres analizadores utilizan diferentes tipos de lser: de argn, semiconductor y al hecho de que los colorantes empleados en cada caso son diferentes: polimetino para el Sysmex XE2100, cianina CD4K530 para el Cell-Dyn 4000 y oxazina 750 para el ADVIA 120.

TA

tPA
-1

FDP D-Dimero Plasmina Fibrina Fibrinogeno

SI

Plasminogeno

TM

IIa

IIa
AT

PC

APC PS

II
PS

AP

AT

Va

Xa

Plaquetas activadas

vWF X
AT

Bibliografa:
0 Advia 0 4 8 12 16

XI

IXa VIIIa APC PS

VIII

Reticulocitos Sysmex vs Reticulocitos Advia Sysmex= 0,86 + 0,14xAdvia (N = 104)

1. DOnofrio G, Tichelli A, Foures C, Theodorsen L. Indicators of hematopoietic recovery after bone marrow transplantation: The role of reticulocyte measurements. Clin Lab Haematol 18 (Supl. 1): 45 (1996). 2. Passing H and Bablok W. (1983). A new biochemical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in Clinical Chemistry. J. Clin Chem Clin Biochem. 21:709. 3. Davis BH, Bigelow NC. Reticulocyte analysis and reticulocyte maturity index. Meth Cell Biol: 42 (1994).

XIa
AT

IX

Figura 3.
Vas de activacin Coagulacin Fibrinolisis Vas de inhibicin

El test de Passing-Bablok (2) para las tres comparaciones se recoge en la tabla siguiente:
COMPARACIN XE2100 vs MO XE2100 vs CD4000 XE2100 vs ADVIA ESTIMACIN PENDIENTE = 0,78 INTERSECCIN = 0,17 PENDIENTE = 0,73 INTERSECCIN = 0.23 PENDIENTE = 0,86 INTERSECCIN = 0,14 INTERVALO DE CONFIANZA (95%) 0,73 0,81 0,11 0,24 0,69 0,77 0,17 0,30 0,76 0,97 0,01 0,28

Xa TFPI

VIIa
TF

PAI-1

AT

APC PS

Xa

TFPI

EN EL CORAZN DE LA HEMOSTASIA

28

Valoracin del analizador Sysmex XE2100 en la determinacin de reticulocitos en sangre perifrica.

Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

DIAGNSTICO MOLECULAR Y MONITORIZACIN DE LA HEPATITIS C


Silvia Sauleda Oliveras1, Jos Manuel Hernndez Snchez1, Francisco Castro Bohrquez2, Juan Ignacio Esteban Mur3 1 Centre de Transfusi i Banc de Teixits. 2 Centro Mdico Delfos. 3 Hospital General Universitari Vall dHebron Barcelona, Espaa.

Tabla I. Tcnicas de diagnstico y monitorizacin del virus de la hepatitis C.

Diagnstico molecular de la hepatitis C

Marcador Anticuerpos anti-VHC RNA VHC

Tcnicas Ensayos inmunoenzimticos Inmunoblots


DETECCIN CUALITATIVA:

Actualmente, el diagnstico de la hepatitis C se realiza mediante una combinacin de las tcnicas serolgicas y moleculares. En pacientes de alto riesgo de exposicin parenteral o en la prctica clnica, la exposicin al virus de la hepatitis C se diagnostica por presencia de anticuerpos anti-VHC mediante tcnicas inmunoenzimticas y se confirma la infeccin activa mediante la determinacin cualitativa del RNA del VHC en suero o plasma (Tabla II). Sin embargo, en determinadas situaciones el
Tabla II. Indicaciones de las tcnicas de deteccin del VHC.

- reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) - amplificacin mediada por transcripcin (TMA)


DETECCIN CUANTITATIVA

- PCR cuantitativa - DNA ramificado (branched-DNA) - TMA cuantitativa Genotipo VHC


GENOTIPADO (BIOLOGA MOLECULAR):

- ensayos de hibridizacin de producto amplificado - secuenciacin


SEROTIPADO (TCNICAS SEROLGICAS):

- inmunoensayos competitivos Indicacin Cribado de donantes 10 Tcnica Anticuerpos anti-VHC Deteccin cualitativa RNA VHC Anticuerpos anti-VHC Deteccin cualitativa RNA VHC Genotipo VHC Deteccin cuantitativa RNA VHC Deteccin cuantitativa VHC Deteccin cualitativa VHC Deteccin cualitativa VHC

Desde el aislamiento del virus de la hepatitis C (VHC) a finales de los aos ochenta, las herramientas
RNA VHC (log10 copias/mL)

para el diagnstico y monitorizacin de la hepatitis C han mejorado progresivamente. Por un lado, las tcnicas serolgicas de deteccin de anticuerpos anti-VHC han evolucionado hasta reactivos de tercera generacin que han reducido el periodo ventana serolgico a unos 60 das de media. Por otro lado, se han desarrollado tcnicas comerciales de deteccin del RNA VHC, de modo que actualmente la determinacin cualitativa y cuantitativa del RNA VHC se ha implantado en la prctica clnica diaria (Tabla I). Recientemente, y ante la generalizacin de tcnicas moleculares de deteccin del RNA VHC, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha establecido un patrn internacional de referencia para la estandarizacin de resultados de la carga viral del VHC en Unidades Internacionales por mL.(1) Para las pruebas moleculares se puede utilizar tanto suero o plasma, aunque no plasma heparinizado ya que puede inhibir la reaccin de PCR. Una vez extrada, la muestra de sangre debe ser centrifugada y el suero o plasma separado de los hemates en un periodo no superior a tres horas. El suero o plasma debe guardarse a 20C si va a analizarse en pocos das o a 80C para almacenamientos prolongados. Una vez descongeladas, las muestras deben guardarse a 4C hasta su procesamiento y evitar los ciclos de congelacin-descongelacin. La correcta recogida y procesamiento de las muestras son esenciales para una interpretacin fiable de las tcnicas moleculares. Las tcnicas de deteccin del RNA VHC se basan en la amplificacin del genoma viral (PCR, TMA) o en la amplificacin de la seal (branched-DNA). Al igual que las tcnicas serolgicas, los mtodos comerciales de deteccin del RNA VHC se han mejorado para conseguir una mayor sensibilidad y una mayor independencia del genotipo VHC (Figura 1)(2). Los mtodos cualitativos de deteccin del RNA suelen ser ms sensibles (< 50 UI/mL) que los cuantitativos, por lo que se recomiendan para el diagnstico y para la comprobacin de resolucin de la infeccin mediada por tratamiento antiviral.

P<0,001

P<0,001

P<0,001

P<0,001

Diagnstico Pauta de tratamiento

Monitorizacin del tratamiento Evaluacin de la respuesta postratamiento

diagnstico debe realizarse directamente mediante el anlisis


0 1 2 3 4 Monitor v1.0 Monitor v2.0
Figura 1. Comparacin de la media de carga viral (log10 RNA VHC/mL) para los 4 genotipos VHC entre un mtodo cuantitativo de primera y de segunda generacin (Amplicor HCV Monitor v1.0 y Amplicor HCV Monitor v2.0, Roche Molecular Systems). El reactivo de primera generacin subestima la carga viral respecto al reactivo de segunda generacin, especialmente para los genotipos 2, 3 y 4.

del RNA VHC. Este es el caso de individuos inmunodeprimidos, especialmente pacientes en hemodilisis, donde la ausencia de anticuerpos no descarta la infeccin activa, o en recin nacidos de madre portadora donde se detecta reactividad anti-VHC de origen materno hasta los 18 meses. En el mbito de la donacin de sangre, a parte del cribado para anticuerpos anti-VHC, se ha incorporado recientemente el cribado adicional de las donaciones por RNA VHC (PCR, TMA) o antgeno del core. Aunque el cribado de donantes mediante tcnicas inmunoenzimticas de segunda o tercera generacin ha eliminado prcticamente la hepatitis C postransfusional, se han descrito casos aislados de transmisin del VHC a receptores

Genotipo VHC

30

31

Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

de productos sanguneos celulares provenientes de donantes en fase de preseroconversin. En un estudio clsico de Schreiber et al. realizado en donantes de Estados Unidos, el riesgo de transmisin del VHC por esta causa se estim en 1/280.000 donaciones (3). En un estudio ms reciente en nuestra rea, el riesgo se estima en 1 de cada 150.000 donaciones (4). La implantacin de las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos (NAT) en el cribado de las donaciones elimina prcticamente el riesgo de transmisin del VHC a travs de donaciones en el periodo ventana serolgico.

sinnimo de no respuesta y, por lo tanto, se recomienda suspender el tratamiento (5). El tratamiento con interfern y ribavirina consigue respuestas mantenidas en un 30% de los pacientes con genotipo 1 4, y en ms del 60% de los pacientes con genotipos 2 3. Sin embargo, es un tratamiento que no est exento de efectos secundarios (sndrome pseudo-gripal, astenia e insomnio, entre otros) que en algunos casos requiere la retirada de los frmacos antes de los seis meses de terapia e independientemente de la respuesta virolgica. Con las tcnicas cuantitativas de deteccin del RNA VHC disponibles actualmente, la monitorizacin de la carga viral permite predecir la respuesta final en la mayora de pacientes durante los tres primeros meses de terapia

Bibliografa

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Monitorizacin del tratamiento antiviral

combinada. Prcticamente en todos los pacientes respondedores, la carga viral disminuye 1 logaritmo por mes respecto a los

Una vez diagnosticada la presencia de infeccin activa mediante una prueba cualitativa de RNA VHC y antes de iniciar el tratamiento antiviral, es necesario determinar la carga viral basal y el genotipo del paciente. Ambas variables han demostrado correlacin significativa con la respuesta mantenida y su combinacin marcar la pauta de tratamiento del paciente. As, los pacientes de genotipo 1 4 con cargas virales superiores a 800.000 UI/mL recibirn 1 ao de tratamiento combinado con interfern alfa y ribavirina, tratamiento de eleccin contra la hepatitis crnica C siempre que no haya contraindicacin para la ribavirina. El resto de pacientes, es decir genotipos 1 4 con cargas virales inferiores a 800.000 UI/mL y genotipos 2 3 independientemente de su carga viral basal, recibirn tratamiento combinado durante 6 meses. La respuesta virolgica al tratamiento se valora a los seis meses de finalizado el mismo mediante la determinacin cualitativa del RNA VHC. Un resultado negativo en este punto se asocia a curacin de la enfermedad. En los pacientes tributarios de un ao de tratamiento es necesario valorar adems la carga viral a los seis meses del inicio mediante una determinacin cualitativa de RNA, ya que se considera que un resultado todava positivo es

valores basales durante los primeros meses de tratamiento combinado. Aunque todava no es un hecho plenamente establecido, parece cumplirse que una disminucin de al menos 1 log/mes durante los primeros tres meses tiene un valor predictivo negativo (VPN) del 100% y un valor predictivo positivo (VPP) de aproximadamente el 80% (6). En otras palabras, los pacientes que no cumplan esta regla no tienen prcticamente ninguna opcin de conseguir una respuesta mantenida, mientras que los que cumplan esta pauta de dinmica viral tienen cerca de un 80% de probabilidades de curacin. Estos datos tienen dos lecturas. Por un lado el VPN permitira la retirada precoz (antes de los seis meses de tratamiento combinado) en los pacientes donde no se observe respuesta y que sufran intolerancia manifiesta a la medicacin. Por otro lado, el VPP permite al clnico obtener una mayor adhesin del paciente a un tratamiento que provoca molestias y minimizar los abandonos por efectos secundarios leves. En resumen, las tcnicas de deteccin del RNA del virus de la hepatitis C, tanto cualitativas como cuantitativas, son extremadamente tiles en cribado, diagnstico y manejo clnico de los pacientes VHC positivos.

32

Diagnstico molecular y monitorizacin de la hep a titis C

33

Roche Diagnostics informa / Octubre 2002

Tr astor nos e n e l metabolismo de l h i e r r o. Los desrdenes en la distribucin del hierro se pueden describir basndose en la diferente regulacin de la sntesis de ferritina y del receptor de transferrina (1). Esto se aplica, en particular, a los casos en que los desrdenes metablicos simples de hierro, como la deficiencia del mismo o su exceso, no estn complicados con enfermedades adicionales tales como la inflamacin crnica, tumores o insuficiencia renal (1, 2). La ferritina es el indicador de la cantidad de hierro de reserva. El receptor soluble de la transferrina indica la demanda de hierro de las clulas y la actividad eritropoytica. El ndice sTfR log Ferritina (3) es la medida ms sensible para la evaluacin del vaciado de los depsitos de hierro y de los compartimentos de hierro funcional. En los procesos inflamatorios crnicos (infecciones o, frecuentemente, enfermedades tumorales), el hierro es redistribudo con un relativo exceso en los depsitos de hierro mientras que las clulas eritropoyticas quedan relativamente desprovistas de hierro (4, 5). A partir del momento en que la capacidad de reabsorcin de hierro queda muy limitada, la demanda del mismo se puede satisfacer nicamente utilizando el hierro funcional. El almacenamiento se realiza en forma de ferritina o de hemosiderina. Cualquier clula es capaz de aceptar un exceso de hierro sintetizando ferritina. Los mecanismos bsicos son idnticos para cualquier tipo de clula (Figura 1). El complejo transferrina-Fe+3 se une al receptor de transferrina de la membrana celular. La entrada de hierro puede ser regulada por la expresin del receptor de t ra n s fe r r i n a . E l h i e r ro i n d u c e l a sntesis de apoferritina. En la mayor parte de las situaciones metablicas,
Lehmann P1, Volkmann M2, Lotz J3, Baldauf A2, Roeddiger R1 1 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania. 2 Universittsklinikum Heidelberg, Rheuma-Ambulanz und Zentrallabor Heidelberg, Alemania. 3Universitt Mainz, Zentrallabor, Mainz, Alemania.

una porcin representativa de la ferritina sintetizada es liberada al


Figura 1. Esquema del almacenamiento celular de hierro y sntesis de la ferritina.

plasma sanguneo.

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Introduccin

Resultados

Mtodos de determinacin En este trabajo se presentan los resultados de un estudio externo dirigido a determinar los intervalos de referencia del nuevo test Tina-Quant [a] sTfR en analizadores de Roche Diagnostics. Adems se intenta definir un criterio para distinguir entre status normal de hierro, anemia por deficiencia de hierro, desrdenes en la distribucin del hierro (anemia producida por enfermedades crnicas) y exceso de hierro, representando sobre un grfico los valores de las pruebas rutinarias de sTfR, ferritina y protena C reactiva (CRP) (6). Las muestras utilizadas en este estudio procedan de 163 pacientes de un departamento ambulatorio de reumatologa y de 48 pacientes de dilisis de otro hospital.
Materiales y mtodos

Intervalos de Referencia Actualmente no existe mtodo de referencia para la determinacin del receptor soluble de la transferrina (sTfR). Debido a la relativamente baja concentracin de receptor soluble de la transferrina en el plasma sanguneo (<10 mg/L <100nMol/L), slo los mtodos de medida que sean lo suficientemente sensibles sern vlidos para su determinacin . En la rutina se usan fundamentalmente mtodos inmunoturbidimtricos potenciados con partculas de ltex. Como calibradores se utilizan preparaciones de sTfR basadas en suero humano, el complejo de sTfR con transferrina, o mezclas de los dos. Esto conduce a resultados variables en funcin del procedimiento concreto utilizado. La molcula sTfR del suero reacciona con el anticuerpo antisTfR (monoclonal, de ratn) y forma un complejo antgenoanticuerpo que es medido turbidimtricamente en un analizador automtico de laboratorio (Figura 3) Los resultados de la determinacin externa de intervalos de referencia (7])para el nuevo reactivo de sTfR se muestran en la Tabla I.
Tabla I. Intervalos de referencia para Tina-quant [a] sTfR.

Hombres Nmero Edad Tina quant [a] sTfR [mg/L] Mediana Percentil 2,5 - 97,5 211 18 - 60 3,0 2,2 5,0

Mujeres premenopusicas 216 18 - 45 2,7 1,9 4,4

Un eficiente mtodo para diferenciar entre anemias es el clculo del cociente sTfR/Log ferritina, segn Suominen et al. (3). La CRP discrimina entre procesos inflamatorios y no inflamatorios. Los expertos recomiendan los siguientes valores de corte (cutoff) (6): STfR para pacientes con dficit frrico: 5 mg/L Ferritina para pacientes con dficit frrico: 30 mg/L Ferritina para pacientes con sobrecarga frrica: 400 mg/L CRP para pacientes con reaccin persistente de fase aguda: 5 mg/L. Adems, stos son los valores de corte para el cociente sTfR y Log ferritina: 5,0 log 30 4,4 log 15 = 3,4 (Hombres) = 3,7 (Mujeres) 2,2 log 400 1,9 log 150 = 0,9 (Hombres) = 0,9 (Mujeres)

Diferenciacin Usando sTfR, Ferritina y CRP Se examinaron un total de 163 pacientes de un departamento ambulatorio de reumatologa y 48 pacientes de dilisis de otro hospital. Se les efectu un examen diario de rutina para el diagnstico diferencial entre status normal de hierro, deficiencia de hierro, distribucin anmala o exceso del mismo, usando sTfR, ferritina y CRP (Figs. 5 y 6). La determinacin combinada de sTfR, ferritina y CRT se mostr como un sistema muy adecuado para su uso en este diagnstico diferencial. Se prob a distribuir los resultados en diferentes grupos (Tabla II).
Tabla II: Diferenciacin y terapias recomendadas para distintas anemias, usando valores de sTfR, ferritina y CRP
Campo* Ferritina [mg/L] > 30 > 15 sTfR [mg/L] alto (Medida de la actividad eritropoytica) <5 < 4,4 <5 < 4,4 >5 > 4,4 sTfR CRP log Ferritin [mg/L] < 3,4 < 3,7 >5 >5 Comentarios

Los estudios se realizaron usando reactivos Tina-quant [a] Ferritina, Tina-quant [a] CRP y Tina-quant [a] sTfR en un analizador Roche/Hitachi 911. La hematimetra (Hb, Hct, hemates y VCM) se realiz por separado. El reactivo Tinaquant [a] sTfR usado para determinar el receptor soluble de la transferrina se encuentra comercialmente disponible. Receptor Soluble de la Transferrina (sTfR) El receptor de unin de la transferrina a la membrana celular es una glicoprotena compuesta por dos cadenas idnticas unidas por puentes disulfuro.

Factores que Causan Desrdenes en el Metabolismo del Hierro y en la Eritropoyesis La eritropoyetina (EPO) es el factor de crecimiento esencial para la regulacin de la eritropoyesis. Representa un nuevo estndar para el tratamiento de anemias crnicas (8). La Figura 4 muestra que la regulacin de la eritropoyesis se controla, fundamentalmente por el factor de crecimiento EPO y el hierro (1, 6). Las figuras 5 y 6 estn divididas en 4 campos, limitados por los valores de corte de la CPR (5 mg/L) y por los cocientes sTfR/Log ferritina de 3,4 3,7 y 0,9, que permiten diferenciar las anemias causadas por una defectuosa distribucin del hierro (A), la deficiencia de hierro (D) y la sobrecarga de hierro (B) del status frrico normal (C). La figura 6 ilustra la correlacin entre la CRP y el ndice sTfR/Log ferritina en 163 pacientes de un departamento ambulatorio de reumatologa.

Figura 3. Principio del medida de la determinacin de receptor soluble de la transferrina (sTfR), usando reactivos con ltex.

Dado que todava no existen preparaciones internacionales de referencia para sTfR, se determinaron los intervalos de referencia en COBAS INTEGRA y Roche-Hitachi para el nuevo reactivo de Roche Diagnostics (RD). Se examinaron un total de 211 hombres y 216 mujeres (premenopusicas) (7).

Incorrecta distribucin del hierro. Incorrecta utilizacin del hierro con reaccin de fase aguda (Terapia EPO). Sobrecarga frrica (sangras). Status frrico normal, sin reaccin de fase aguda Depsitos bajos de hierro, sin reaccin de fase aguda (substitucin de hierro).

> 400 > 150 30-400 15-150 < 30 < 15

< 0,9 < 0,9 < 3,4 < 3,7 > 3,4 > 3,7

<5 <5 <5 <5

< 30 < 15

Figura 2. Representacin esquemtica de las molculas de TfR y sTfR (Punnonen et al., 1988 (32)).

muy alto > 3,4 (Medida de la > 3,7 demanda celular de hierro)

>5

Depsitos bajos de hierro con reaccin de fase aguda (substitucin de hierro).

* Referido a la Figura 7

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El receptor soluble de la transferrina (sTfR), la ferritina y la protena C reactiva como marcadores.

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Remitente: Paciente:

Diagnstico Diferencial y Monitorizacin de Desrdenes en el Metabolismo del Hierro

Centro de extraccin: Telfono: Muestra recibida:

Tests preanalticos: Magnitudes bioqumicas Recuento hematolgico Suero Plasma EDTA

Protenas: STfR (receptor soluble transferrina) [mg/L] Fecha Ferritina CRP de entrada [mg/L] [mg/L]

Intrvalos de Referencia: Mujeres premenopusicas Hombres Mujeres premenopusicas Hombres (Valor de consenso) 1.9 4.4 mg/L 2.2 5.0 mg/L 15 150 mg/L 30 400 mg/L < 5 mg/L

Hematologa: Hemoglobina Eritrocitos Hematocrito MCV MCH Fecha de entrada [g/dL] [/pL] [%] [fL] [pg]

Figura 6. Relacin entre la concentracin de CRP y sTfR/Log ferritina (ndice sTfR) en Pacientes de un departamento ambulatorio de reumatologa.

Software para el Diagnstico Diferencial de Desrdenes en el Metabolismo del Hierro


Figura 4. Desrdenes de la eritropoyesis cursados por deficiencias en vitaminas, factores de crecimiento (EPO) y hierro.

1000

Administracin parenteral: A D Hb. medida [g/L] [g/L] Fecha de entrada [g/L] [kg] [L/kg] [mg Fe/g Hb] [g] Hb. valor esperado Hb. dficit Peso

Figura 5. Relacin entre la concentracin de CRP y el cociente sTfR/Log Ferritina (ndice sTfR) en pacientes dializados en un Hospital Universitario.

De esos resultados surge la idea de usar un programa de software para orientar el diagnstico diferencial de la mayora de desrdenes del metabolismo del hierro. Se determin la relacin matemtica entre tres magnitudes independientes (figura 7). Como magnitudes independientes se utilizaron: Ferritina como la magnitud que evala el estado de las reservas de hierro. sTfR como la magnitud que evala la actividad eritropoytica (hierro funcional). CRP es la magnitud usada para el diagnstico de desrdenes inespecficos en el metabolismo del hierro (por ejemplo, causados por procesos inflamatorios).

100

CRP [mg/L]

10 5

Volemia Fe de funcional en Hb Fe de reserva en depsitos

B
0 0 0,9 1

C Administracin de
3,4-3,7 10 >100

sTfR [mg/L] / Log Ferritina [mg/L]

eritropoyetina

Fecha de entrada

[U.I.]

Campo

Desrdenes en el Metabolismo del Hierro

STfR / log Ferritina

Concentracin de CRP

Terapia Recomendada

A:

Distribucin incorrecta del hierro

< 3.7 (Mujeres) < 3.4 (Hombres) < 0.9 (Mujeres y Hombres) 0.9 3.7 (Mujeres) 0.9 3.4 (Hombres) > 3.7 (Mujeres) > 3.4 (Hombres)

> 5 mg/L

Depende del recuento de reticulocitos: Eritropoyetina

B:

Sobrecarga de hierro Status frrico normal

< 5 mg/L < 5 mg/L

Sangras

Conclusin

C:

Los desrdenes en el metabolismo del hierro se pueden describir usando la ferritina: protena de almacenamiento de hierro y el receptor soluble de la transferrina, indicador de la demanda celular de hierro. Adicionalmente la actividad eritropoytica puede ser estimada a travs de la medicin del receptor soluble de la transferrina. La CRP acta como un indicador de reaccin persistente de fase aguda. La correlacin entre la CRP y los cocientes de sTfR/Log ferritina proporcionan un diagnstico diferencial eficiente de las anemias

D:

Ferropenia

< > 5 mg/L

Suministro de hierro

Indicaciones:

Terapia recomendada:

Figura 7. Programa de anemias y recomendaciones para la terapia de desrdenes en el metabolismo del hierro.

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El receptor soluble de la transferrina (sTfR), la ferritina y la protena C reactiva como marcadores.

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(deficiencia de hierro, desrdenes en su distribucin) y de la sobrecarga de hierro frente al status frrico normal. Se desarroll un software especfico para el diagnstico diferencial de anemias.
Referencias

Esensis
Diagnostics laboratory organisation

1. Wick M, Pinggera W, Lehmann P. Eisenstoffwechsel, Anemien Therapie und Diagnose Neue Konzepte bei Renaler Anmie und Rheumatoider Arthritis. 6. erweiterte Auflage, Springer Wien New York (2000). 2. Thomas L (Ed.) Labor und Diagnose, 5. Auflage, TH Books Verlagsgesellschaft Frankfurt (1998). 3. Suominen P, Punnonen K, Rajamki A, Irjala K. Serum transferrin receptor and transferrin receptor-ferritin index identity healthy subjects with subclinical iron deficits. Blood 1998; 92: 2934-2939. 4. Andrews NC. Disorders of iron metabolism. N Eng J Med 1999; 341: 1986-95. 5. Weiss G, Houston T Kastner S, Johrer K, Grunewald K, Brock JH. Regulation of cellular iron metabolism by Erythropoietin: Activation of iron-regulatory protein and upregulation of transferrin receptor expression in erythroid cells. Blood 1997; 89: 680 6. Thomas L, Nowrousian MR, Wick M, Mller B, Hrl WH, et al. Expert Meeting: Clinical assessment of soluble Transferrin Receptor. 12/2000; Frankfurt 7. Lotz J, Hafner G, Blanckaert N, Claeys G, Togni G, Carlsen J, Kolbe-Busch S, Rddiger R. Multicenter evaluation of a soluble transferrin receptor (sTfR) assay on the Hitachi 911/917 and Cobas Integra 400/700 automated analyzers. Clin Chem 2000; 46, A174 (Suppl.) 8. Kessler U, Gottschalk R, Stucki G, Kaltwasser JP. Benefit in clinical outcome and disease activity of treatment of anaemia of chronic disease in rheumatoid arthritis with recombinant human Erythropoietin. J Rheumatol 1998; 41:210

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1 Klapper PE, Jungkind DL, Fenner T, Antinozzi R, Schirm J, Blanckmeister C. Multicenter international work flow study of an automated polymerase chain reaction instrument. Clin Chem. 1998; 44:1737-1739.

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