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TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE

LINFOCITOS
• Rta inmune adaptativa mediada por linfocitos es estudiada mediante:
Aislamiento → Separación poblaciones-subpoblaciones → comportamiento

• No es posible diferenciar los linfocitos T de los B por microscopía ordinaria, ni


en la sangre ni en los órganos linfoides, aunque sí se observan algunas
diferencias por microscopía electrónica de barrido. No obstante, se disponen
de varios métodos que permiten diferenciar y cuantificar los linfocitos, sus
diferentes subpoblaciones e incluso su capacidad de responder a distintos
antígenos. Los métodos para el estudio de los linfocitos, más utilizados en la
actualidad, los podemos agrupar en:
.- Determinación de marcadores y receptores de
membrana.
.- Determinación de antígenos de membrana.
.- Pruebas funcionales.
TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE
LINFOCITOS
• Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque
(Boyum 1968)
Humanos: Sangre Periférica – Organos
M. experimental : bazo, NL, timo

Importante conocer si se requiere esterilidad . Rendimiento: 1-2 x 106cel / ml


TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE
LINFOCITOS
1.- Marcadores y receptores de membrana.
Estos métodos han sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y
cuantificar poblaciones de linfocitos B y T. Estos marcadores convencionales,
están basados en las características específicas de ciertos receptores de
membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. Los principales
marcadores son:

Principales receptores utilizados


tradicionalmente para diferenciar los
linfocitos T de los B

Inmunoglobulinas
Linfocitos B:
de superficie

Rosetas con
Linfocitos T: eritrocitos de
carnero
Linfocitos B
Linfocitos T
.- Para los linfocitos B: inmunoglobulinas de superficie que pueden ser detectadas con
suero policlonales o Acs. monoclonales marcados con fluorescencia (isotiocianato
de fluoresceína). En el microscopio de fluorescencia se puede observar que en la
membrana aparece una reacción fluorescente positiva.

.- Para los linfocitos T:


Rosetas con los eritrocitos. Los linfocitos T presentan la característica de formar Rosetas cuando se
unen a los eritrocitos de carnero.Actualmente se usan métodosen los que GRC se tratan con
neuroaminidasa o AET( 2-aminoethylisothiouronium bromide) para aumentar la unión de las cel. T.
Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina y la posterior
observación al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con la
naranja de acridina, presentando los linfocitos T rosetas mientras que los B se marcan con la naranja de
acridina pero no forman rosetas. E
E E
E
Rendimiento: > 95% cel. T, < 1% cel. B y ~ 2% monocitos
E E
Población no T: < 2% cel. T, 40% cel. B y 60% monocitos
E E
E
2.- Antígenos de membrana : Expresión diferencial de marcadores de
superficie y disponibilidad de AcMo con especificidad deseada

Técnicas:
.- Lisis Ac/Complemento
.- Panning
.- S. Magnética
.- Análisis por citometría de flujo.
.- Inmunohistoquímica.

Identificación Separación
- positiva

Panning:
- negativa Rendimiento: > 90% pureza y viabilidad

Ag -
Ag -
Ag+ Ag -
Ag -

Ag -
Ag -

Ag+ Ag+ Ag+

Wysocki y Sato,1978; Mage y col,1977


Engleman y col,1982; Payne y col, 1981 Placa sensibilizada Ac
Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados
fisicamente usando Acs acoplados a perlas
magnéticas

Ventajas: pureza, reproducibilidad, manejo de cantidades variables de células ( 106 a 1010 células).
Rendimiento: > 98% pureza
Análisis por citometría de flujo.

• El citómetro de flujo es un
aparato que permite • Las células, sobre las que se
caracterizar e incluso adicionan los monoclonales
separar las diferentes (se pueden valorar varios a la
poblaciones linfocitarias “in vez) frente al marcador objeto
vitro” mediante el uso de de estudio (CD2, CD4, CD8,
anticuerpos monoclonales etc.) pasan a través de un haz
marcados con fluoresceína, de un láser que detecta su
PE,etc; frente a los capacidad para dispersar la
marcadores de superficie luz (tamaño de las células) y
específicos de cada la fluorescencia que emiten
subpoblación que se desee (tipo de célula). Las
estudiar. mediciones obtenidas se
indican en porcentajes de
cada población.

Costoso... Exacto, rápido y fácil en manos experimentadas


Citometrí
a de Flujo
Side G
scatter M

Forward scatter
(size)

• Inmunohistoquímica. Utilizando anticuerpos monoclonales,


marcados con fluorescencia o con peroxidasa, frente a los
diferentes linfocitos, se puede valorar la situación de estas células
en cualquier tejido. Incluso utilizando dos anticuerpos monoclonales,
cada uno frente a una población linfocitaria distinta, y cada uno
marcado con una enzima diferente (doble marcaje) (peroxidasa –
fosfatasa alcalina) se pueden estudiar dos poblaciones celulares a la
vez en cualquier tejido .
3.- Pruebas funcionales:
• Estos métodos de estudio se basan en valorar la capacidad que tanto
los linfocitos T como los B tienen para reconocer a un antígeno
determinado. Las técnicas más utilizadas son:
• · Estimulación blástica o Blastogénesis
• · La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+)

La utilización de la transformación linfocitaria,


blastogénesis o proliferación es actualmente una
de las técnicas más precisas y difundidas para
el estudio de la capacidad de estimulación
específica y no específica de los linfocitos “in
vitro”. Esta técnica se basa en la capacidad que
los linfocitos tienen para responder frente a un
antígeno (respuesta específica) que por
vacunación o por sufrir una infección, ha inducido
linfocitos memoria.
Los linfocitos al estar de nuevo en contacto con
el antígeno inducen una proliferación, la cual
puede ser inducida de forma no específica
gracias a la capacidad de los linfocitos de
reaccionar con diferentes tipos de lectinas o
mitógenos. Los mitógenos
inducen una estimulación blástica de tipo
inespecífico tanto en los linfocitos B como
en los T.
• TECNICAS:
a.- Incorporación de 3H dentro del ADN de las células.
b.- FACS → contenido de ADN-ARN (proliferación de células
individuales)
c.- Ensayos colorimétricos: MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-
yl)2,5diphenyltetrazolium bromide) y SDS
• Funciones efectoras de cel. T . ¿ Qué
podemos medir ?
 Secreción de citoquinas en Sn de cultivo.
 Efectos regulatorios sobre cel. B ( por ej. cuantificar niveles de Ig)
 Actividad citotóxica.
 La actividad citotóxica de los linfocitos T(CD8+)
La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una célula blanco se puede
estudiar, midiendo la capacidad de destrucción, que un determinado número de
linfocitos T tienen para destruir un determinado número de células blanco, al estar
ambas poblaciones en contacto. Hay varios métodos para poder valorar el porcentaje de
lisis o muerte celular que expresan las células blanco, aunque el más utilizado por su
precisión, sensibilidad y reproducibilidad, es el de la liberación de cromo 51 procedente
de las células blanco.
 
Este método consiste, brevemente, en lo siguiente: Las células blanco
(que expresan los antígenos determinados en su membrana) son
marcadas con Cromo 51 y puestas en contacto en una proporción
adecuada con las células efectoras (linfocitos T). Tras incubar ambas
poblaciones celulares conjuntamente por un periodo de incubación
determinado, se centrifugan y seguidamente una parte del sobrenadante
resultante es medido mediante un contador de partículas gamma para
conocer el porcentaje de cromo 51 liberado al medio. A mayor cantidad
de cromo liberado mayor actividad citotóxica.
 Producción de citoquinas in vitro:
a.- Inmunoensayos.
b.- Bioensayos

• INMUNOENSAYOS: ELISA

Ventajas: Especificidad, rapidez y facilidad


Desventajas: sensibilidad (10-50 pg /ml) <<<
Bioensayo. No diferencia citoquinas activas de
fragmentos inactivos.
ELISPOT
ASSAY
 BIOENSAYOS:

Ensayos muy sensibles ( 1 pg/ml) → bioactividad y


potencia.
TECNICAS:
a.- Proliferación → Crecimiento cel. Blanco susceptibles ( IL-
1,2,3,4,5,6,7).
b.- Citotoxicidad → Muerte o inhibición del crecimiento de cel.
Blanco susceptibles ( TNF → L929, IL-1 → A375).
c.- Diferenciación de cel. Blanco susceptibles ( CSF, IL-3 →
crecimiento sobre agar suave; INF- γ ( expresión de MHC clase
II, fagocitosis macrófagos).

Desventajas:
Cel. Viables Dificil de realizar, Multiples
mayor Citoquinas
tiempo( compartiendo
dias a semanas)
actividad y
<<especificidad.
Cuidadosos controles

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