TUGAS TERSTRUKTUR BIOFARMASETIKA PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI KAPLET ASAM MEFENAMAT 500 mg

Disusun oleh :

Yudha Fahmi A Awaliyatun Nikmah Heppi Purnomo

G1F008036 G1F011018 G1F011024

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN JURUSAN FARMASI PURWOKERTO 2013

PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI KAPLET ASAM MEFENAMAT 500mg Asam mefenamat merupakan derivat asam antranilat dan termasuk kedalam golongan obat Anti Inflamasi Nonsteroid (AINS). Dalam pengobatan, asam mefenamat digunakan untuk meredakan nyeri dan rematik. Obat ini cukup toksik terutama untuk anak-anak dan janin, karena sifat toksiknya, Asam mefenamat tidak boleh dipakai selama lebih dari 1 minggu dan sebaiknya jangan digunakan untuk anak-anak yang usianya di bawah 14 tahun (Munaf,1994).

Stuktur asam mefenamat Rumus Molekul : C15H15NO2 Berat Molekul : 241.29 Pemerian : serbuk hablur putih atau hampir putih. Melebur pada suhu lebih kurang 230 C disertai peruraian. Kelarutan : larut dalam alkali hidroksida, agak sukar larut dalam klorofom, sukar larut dalam etanol dan methanol, praktis tidak larut dalam air. Persyaratan Kadar : mengandung asam mefenamat tidak kurang dari 90.0% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang tertera pada etiket (Anonim,1995).

Asam mefenamat mempunyai khasiat sebagai analgetik dan anti inflamasi. Asam mefenamat merupakan satu-satunya fenamat yang menunjukkan kerja pusat dan juga kerja perifer. Mekanisme kerja asam mefenamat adalah dengan menghambat kerja enzim sikloogsigenase (Goodman, 2007). Tablet asam mefenamat diberikan secara oral. Diberikan melalui mulut dan diabsorbsi pertama kali dari lambung dan usus selanjutnya obat akan melalui hati diserap darah dan dibawa oleh darah sampai ke tempat kerjanya. konsentrasi puncak asam mefenamat dalam plasma tercapai dalam 2 sampai 4 jam. Pada manusia, sekitar 50% dosis asam mefenamat diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3hidroksimetil terkonjugasi dan 20% obat ini ditemukan dalam feses sebagai metabolit 3-karboksil yang tidak terkonjugasi (Goodman, 2007).

Parameter farmakokinetik T1/2 eliminasi

t max C max Steady state Vd Protein binding ekskresi

Keterangan 2-4 jam

2 jam 20 g/mL tercapai dalam 2 hari 1,06 L/kg Lebih dari 90 % 50 % dosis dikeluarkan di urin 20 % dosis dikeluarkan dalam feses

Efek samping dari asam mefenamat terhadap saluran cerna yang sering timbul adalah diare, diare sampai berdarah dan gejala iritasi terhadap mukosa lambung, selain itu dapat juga menyebabkan eritema kulit, memperhebat gejala asma dan kemungkinan gangguan ginjal (Setiabudy, 2009). TUJUAN EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI OBAT Produk obat yang mengandung zat aktif berupa zat kimia baru (new chemical entity = NCE) dibutuhkan penilaian mengenai efikasi, keamanan dan mutu secara lengkap. NCE ini yang dipatenkan oleh pabrik penemunya disebut juga obat inovator. Sedangkan untuk produk obat yang merupakan produk copy hanya dibutuhkan standar mutu yang antara lain berupa bioekivalensi dengan produk obat innovator sebagai produk pembanding (reference product) yang merupakan baku mutu (BPOM,2005) Evaluasi produk farmasetik perlu dilakukan guna untuk menjamin efikasi, keamanan dan mutu produk obat yang beredar serta untuk menjamin produk obat copy yang akan mendapat izin edar bioekivalen dengan produk obat inovatornya juga untuk menentukan bioavailabilitas absolut dan relatif suatu zat kimia baru, serta bioekivalensi zat tersebut dalam formulasi untuk uji klinik dan dalam produk yang akan dipasarkan. Untuk mengetahui perbandingan kualitas produk copy dengan sediaan inovator perlu diketahui bioekuivalensi antara dua sediaan tersebut. Masing-masing sediaan diukur bioavailabilitasnya. Perbandingan bioavailabilitas ini disebut bioekivalansi obat (BPOM,2005).

Dasar untuk menentukan bioavailabilitas suatu obat terlebih dahulu harus diketahui profil disolusinya. Disolusi tablet ialah jumlah atau persen zat aktif dari sediaan padat yang larut pada waktu tertentu dalam kondisi baku. Kondisi yang dimaksud misalnya, dalam suhu, kecepatan, pengadukan, dan komposisi media tertentu. Uji disolusi merupakan suatu metode fisika kimia yang penting sebagai parameter dalam pengembangan produk dan pengendalian mutu sediaan obat yang didasarkan pada pengukuran kecepatan pelepasan dan melarut zat aktif dari sediaannya. Uji disolusi digunakan untuk uji bioavailabilitas secara in vitro, karena hasil uji disolusi berkorelasi dengan ketersediaan hayati obat dalam tubuh (Ari,2006). Studi bioekivalensi (BE) adalah studi bioavailabilitas (BA) komparatif yang dirancang untuk menunjukkan bioekivalensi antara produk uji (suatu produk obat copy) dengan produk obat inovator /pembandingnya. Caranya dengan membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produk-produk obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain dan pelaksanaan studi BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB), termasuk harus lolos Kaji Etik.Ekivalensi farmaseutik Dua produk obat mempunyai ekivalensi farmaseutik jika keduanya mengandung zat aktif yang sama dalam jumlah yang sama dan bentuk sediaan yang sama. Alternatif farmaseutik adalah dua produk obat merupakan alternatif farmaseutik jika keduanya mengandung zat aktif yang sama tetapi berbeda dalam bentuk kimia (garam, ester, dsb) atau bentuk sediaan atau kekuatan (BPOM,2005). Dua produk obat disebut bioekivalen jika keduanya mempunyai ekivalensi farmaseutik atau merupakan alternatif farmaseutik dan pada pemberian dengan dosis molar yang sama akan menghasilkan bioavailabilitas yang sebanding sehingga efeknya akan sama, dalam hal efikasi maupun keamanan. Jika bioavailabilitas nya yang tidak memenuhi kriteria bioekivalen maka kedua produk obat tersebut disebut bioinekivalen. Dua produk obat mempunyai ekivalensi terapeutik jika keduanya mempunyai ekivalensi farmaseutik atau merupakan alternatif farmaseutik dan pada pemberian dengan dosis molar yang sama akan menghasilkan efikasi klinik dan keamanan yang sebanding. Dengan demikian, ekivalensi/inekivalensi terapeutik seharusnya ditunjukkan dengan uji klinik.Akan tetapi, untuk produk obat yang bekerja sistemik, uji klinik mempunyai kendala berikut : pada penyakit ringan tidak terlihat, pada penyakit berat tidak etis; endpoint yang diukur seringkali kurang akurat sehingga variabilitasnya besar sekali, dengan akibat dibutuhkan sampel yang besar;

sebagai uji klinik untuk menunjukkan ekivalensi dibutuhkan sampel yang besar sekali.

Oleh karena itu, sebagai alternatif dilakukan uji bioekivalensi yang endpointnya sangat akurat (yakni kadar obat dalam plasma) sehingga variabilitasnya rendah, dan dengan demikiansampel yang dibutuhkan jauh lebih kecil. Jika terdapat perbedaan yang bermakna secara klinik dalam bioavailabilitasnya, maka kedua produk obat tersebut dinyatakan inekivalen secara terapeutik (inekivalensi terapeutik) (BPOM,2005). PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI KAPLET ASAM MEFENAMAT 500mg Evaluasi ketersediaan hayati kaplet asam mefenamat dilakukan dengan beberapa tahapan, yaitu evaluasi ekivalensi farmasetik, uji disolusi terbanding (uji in vitro) dan uji ketersediaan hayati secara in vivo. 1. EKIVALENSI FARMASETIK Uji pertama yang dilakukan untuk mengevaluasi ketersediaan hayati suatu obat adalah uji ekivalensi farmasetik. Uji ini akan menunjukkan kadar zat aktif dalam suatu sediaan. Dua produk obat memiliki ekivalensi farmasetik jika kedua obat tersebut mengandung zat aktif yang sama dalam jumlah yang sama dan bentuk sediaan yang sama. Suatu pengujian ekivalensi farmasetik dapat dilakukan dengan cara membandingkan kandungannya, yaitu PROTOKOL PENGUJIAN Metode pengukuran kadar : spektrofotometri UV (Singh,2011) Instrumen : Perkin Elmer UV-Visible Spektrovotometri model lambda 25 dengan spektral band width 1 nm Akurasi panjang gelombang : 0,5 nm dan 1 cm yang cocok dengan sel kuarta. Panjang gelombang analisis : 285 nm Larutan induk Larutan induk memiliki konsentrasi 1 mg/ml yang dibuat dengan melarutkan 50 mg obat murni dalam 0,1 M HCl dan diencerkan dengan 50 ml 0,1 M HCl. Penentuan kurva baku asam mefenamat Pembuatan kurva baku dilakukan dengan mengambil larutan induk sebanyak 7 titik yaitu 0, 1, 2 ,3 , 4, 5, 6 dan 7.0 mL dan diletakkan pada labu ukur 100 mL, kemudian ditambahkan 0.1 M HCl sampai

tanda batas. Kemudian larutan tersebut diukur panjang gelombangnya pada rentang 200400 nm. Panjang gelombang yang dihasilkan adalah 285 nm. Dari data yang dihasilkan lalu ditentukan persamaan kurva baku dari asam mefenamat standar. Pengukuran kadar / kandungan tablet asam mefenamat Dua puluh kaplet ditimbang secara akurat dan digerus sampai halus menjadi serbuk. Serbuk asam mefenamat sebanyak 100mg ditimbang secara akurat dan dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan 60 ml HCl 0,1 M. campuran tersebut dikocok selama 1520 menit dan di add sampai volume 100 ml. Larutan disaring dengan kertas Whatman No. 42 kemudian 10 mL alikuot yang didapat digunakan untuk analisis kadar dengan metode spektrofotometri yang telah ditetapkan.

2. UJI DISOLUSI TERBANDING (UJI IN VITRO) Dasar untuk menentukan bioavailabilitas suatu obat terlebih dahulu harus diketahui profil disolusinya. Uji disolusi digunakan untuk uji bioavailabilitas secara in vitro, karena hasil uji disolusi berkorelasi dengan ketersediaan hayati obat dalam tubuh. Potensi dan karakteristik disolusi in vitro dari produk obat uji dan pembanding dipastikan dulu sebelum dilakukan studi BE. Hasilnya harus dilaporkan sebagai profil persen obat yang terlarut terhadap waktu. Nomor batch kedua produk harus dicantumkan, demikian juga tanggal kadaluarsa produk pembanding. Kandungan zat aktif antara kedua produk tidak boleh berbeda lebih dari 5%. Jika potensi produk pembanding menyimpang > 5% dari kandungan 100% yang tercantum dalam label, perbedaan ini dapat digunakan kemudian untuk koreksi dosis pada perhitungan parameter bioavailabilitas pada studi BE (BPOM,2005). PROTOKOL PENGUJIAN Uji dilaksanakan secara analitik observasional dengan sampel 1 jenis kaplet asam mefenamat 500mg sediaan copy dan sediaan inovator (Ponstan). Masing - masing sediaan 4 tablet. Bahan yang diperlukan adalah kaplet asam mefenamat 500mg 8 buah masing masing dalam sediaan copy dan inovator (ponstan) sebanyak 4 kaplet,aquades 7200 ml untuk mengisi 8 vessel sebagai media disolusi dan sebanyak 16 liter aquadessebagai penangas air pada disolusi tester. Pada tahap pertama sampel akan mengalami uji disolusi. Alat uji disolusi yang digunakan adalah Disolution Tester tipe 1 ERWEKA

DT600HH, diset pada suhu 370C, kecepatan 100 rpm selama 20 menit. 900 ml media disolusi disiapkan untuk uji disolusi. Media yang dianjurkan untuk pengujian terdiri dari : HCL 0,1 N atau media simulated gastric fluid (SGF) bebas enzim Buffer pH 4,5 Buffer fosfat pH 6,8 atau media simulated intestinal fluid (SIF) bebas enzim Kaplet asam mefenamat 500mg dimasukkan dalam 8 vessel pada tiap-tiap media disolusi masing masing 1 buah. Sampel diambil dengan spuit tiap 5 menit sehingga dalam waktu 20 menit,total data yang didapat untuk asam mefenamat 500mg sediaan copy dan sediaan inovator (Ponstan) adalah 48 data. Setelah semua data didapat kemudian dilanjutkan dengan pembacaan hasil uji disolusi melalui aspirasi pada spektrofotometer. Alat yang digunakan adalah Spektrofotometer UV. Alat diatur pada panjang gelombang 254 nm dengan memasukkan media disolusi sebagai larutan blangko, kemudian dilihat absorbansi produk copy maupun produk inovator pada tiap titik pengambilan sample.. Dari hasil tersebut dapat dihitung kadar zat aktif yang terlarut (%).

Kadar zat aktif yang terlarut (%) = Fu Au Cb V x Mb x ---- x ---- x ---- x 100 % Fb Ab Ke V = volum media disolusi (dalam ml) Mb = penimbangan baku (dalam mg) Fu = faktor pengenceran sampel Fb = faktor pengenceran larutan baku Au = absorbansi larutan sampel Ab = absorbansi larutan baku Cb = kadar larutan baku yang diukur (dalam mg per ml) Ke = kadar asam mefenamat per tablet yang tertera pada etiket ( mg) (Ari,2006) Dari rumus diatas,dapat diketahui persen obat terlepas dari sediaan yang diuji.jika produk yang diuji merupakan produk inovator maka profil disolusi yang didapat tidak perlu dibandingkan. Namun jika produk yang diuji disolusinya adalah produk copy maka profil disolusi produk copy yang didapat dibandingkan dengan profil disolusi produk inovator, Profil

disolusi dibandingkan dengan menggunakan faktor kemiripan f2 yang dihitung dengan persamaan berikut :

Rt = persentase kumulatif obat yang larut pada setiap waktu sampling dari produk pembanding (R =reference) Tt = persentase kumulatif obat yang larut pada setiap waktu sampling dari produk uji (T = test) Nilai f2 50 atau lebih besar (50100) menunjukkan kesamaan atau ekivalensi ke 2 kurva, yang berarti kemiripan profil disolusi ke-2 produk; Jika produk copy dan produk pembanding memiliki disolusi yang sangat cepat (> 85% melarut dalam waktu < 15 menit dalam ke-3 media dengan metode uji yang dianjurkan), perbandingan profil disolusi tidak diperlukan. Disamping itu harus ditunjukkan bahwa eksipien dalam komposisi produk obat sudah dikenal, bahwa tidak ada efek terhadap motilitas saluran cerna atau proses lain yang mempengaruhi absorpsi, juga diperkirakan tidak ada interaksi antara eksipien dan zat aktif yang dapat mengubah farmakokinetik zat aktif. Jika digunakan eksipien baru atau eksipien yang biasa digunakan tapi dalam jumlah yang luar biasa besar, diperlukan tambahan informasi yang menunjukkan tidak adanyadampak terhadap bioavailabilitas. Uji disolusi terbanding juga dapat digunakan untuk memastikan kemiripan kualitas dan sifat-sifat produk obat dengan perubahan minor dalam formulasi atau pembuatan setelah izin pemasaran obat (BPOM,2005). 3. PELAKSANAAN EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI Bioavailabilitas (ketersediaan hayati) adalah persentase dan kecepatan zat aktif dalam suatu produk obat yang mencapai/tersedia dalam sirkulasi sistemik dalam bentuk utuh/aktif setelah pemberian produk obat tersebut, diukur dari kadarnya dalam darah terhadap waktu atau dari ekskresinya dalam urin 1. Bioavailabilitas absolut Bioavailabilitas absolut adalah bila dibandingkan dengan sediaan intravena yang bioavailabilitasnya 100 % ( F = 1)

2. Uji bioavailabilitas relatif Bioavailabilitas relatif adalah bila suatu sediaan dibandingkan dengan sediaan bukan intravena. Bioavailabilitas produk copy asam mefenamat 500mg ditentukan bioavailabilitas relatifnya dibandingkan dengan tablet Ponstan 500mg (produk inovator) Evaluasi ketersediaan hayati dilakukan dengan studi bioekivalensi (BE),yaitu studi bioavailabilitas (BA) komparatif yang dirancang untuk menunjukkan bioekivalensi antara produk uji (suatu produk obat copy) dengan produk obat inovator /pembandingnya. Caranya dengan membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produkproduk obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain dan pelaksanaan studi BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB), termasuk harus lolos Kaji Etik. Produk obat uji yang digunakan dalam studi BE harus dibuat sesuai dengan Cara Pembuatan Obat yang Baik (CPOB), dan catatan batchnya harus dilaporkan. Produk uji yang digunakan dalam studi BE untuk tujuan registrasi harus identik dengan produk obat yang akan dipasarkan. Karena itu, tidak hanya komposisi dan sifat-sifatnya (termasuk stabilitas), tetapi juga cara produksinya harus sama dengan cara produksi rutin yang akan datang. Idealnya, produk uji harus diambil dari batch skala industri. Jika ini tidak mungkin, batch produksi berskala kecil atau pilotbatch dapat digunakan asalkan tidak lebih kecil dari 10% batch skala industri atau 100.000 unit (pilih yang besar), kecuali jika ada alasan khusus. Sponsor harus menyimpan sampel dari semua produk yang diteliti dalam studi (dalam jumlah yang cukup) selama 2 tahun setelah selesainya studi atau 1 tahun lebih lama dari masa pakai (shelflife) produk atau sampai keluarnya izin edar (mana yang lebih lama) agar dapat dilakukan pemeriksaan ulang jika diminta oleh Badan POM. Kaji Etik Oleh karena studi BA/BE dilakukan pada subyek manusia (suatu uji klinik) maka protokol studi harus lolos kaji etik terlebih dahulu sebelum studi dapat dimulai.

DESAIN Pelaksanaan uji in vivo dilaksanakan sesuai dengan panduan yang dibuat oleh dunia internasional. Pengujian bioavailabilitas dari asam mefenamat dievaluasi dari ploting kadar obat dalam darah terhadap waktu pengambilan sampel setelah pemberian obat secara oral,yang kemudian diikuti dengan perhitungan parameter-parameter farmakokinetiknya. Studi dilakukan pada subyek yang sama (dengan desain menyilang) untuk menghilangkan variasi biologik antar subyek (karena setiap subyek menjadi kontrolnya sendiri), hal ini sangat memperkecil jumlah subyek yang dibutuhkan. Jadi untuk membandingkan 2 produk obat, dilakukan studi menyilang 2-way (2 periode untuk pemberian 2 produk obat pada setiap subyek). Tiap Subjek uji mendapatkan 500mg asam mefenamat 5 kali interval pemberian terlebih dahulu dengan asumsi pada 5 kali pemberian kadar obat dalam darah sudah steady state. Pengambilan sampel darah dilakukan pada saat kadar obat plasma sudah steady state,sehingga memberikan nilai farmakokinetika yang konstan. Pemberian produk obat yang pertama (obat inovator/ponstan) harus dilakukan secara acak agar efek urutan (order effect) maupun efek waktu (period effect), bila ada, dibuat seimbang. Kedua perlakuan dipisahkan oleh periode washout yang cukup untuk eliminasi produk obat inovator yang diberikan pertama kali diberikan dalam hal ini periode washout pemberian asam mefenamat adalah 10 jam (5 kali t1/2 asam mefenamat,t1/2 = 2 jam) (USP,2013) Subjek Kriteria seleksi o Sukarelawan sehat (untuk mengurangi variasi antar subyek); o Sedapat mungkin pria dan wanita (jika wanita pertimbangkan risiko pada wanita usia subur; o Umur antara 18 55 tahun o Berat badan dalam kisaran normal (47-87 kg) o Kriteria sehat berdasarkan uji laboratorium klinis yang baku (hematologi rutin, fungsi hati, fungsi ginjal, gula darah, dan urinalisis), riwayat penyakit, dan pemeriksaan fisik; o Pemeriksaan khusus mungkin harus dilakukan sebelum, selama dan setelah studi selesai, bergantung pada kelas terapi dan profil keamanan obat yang diteliti.

o Sebaiknya bukan perokok. Jika perokok sedang (kurang dari 10 batang sehari) diikutsertakan, harus disebutkan dan efeknya pada hasil studi harus didiskusikan; o Tidak mempunyai riwayat ketergantungan pada alkohol atau penyalahgunaan obat; o Tidak kontraindikasi atau hipersensitif terhadap asam mefenamat o Uji serologis terhadap Hepatitis B (HBsAg), Hepatitis C (antiHCV) dan HIV (anti-HIV) optinal B. (Alil,2004) Jumlah subjek Jumlah subyek yang dibutuhkan dihitung berdasarkan parameter bioavailabilitas yang utama, yakni AUC atau luas area dibawah kurva kadar obat dalam darah terhadap waktu, yang menunjukkan jumlah obat yang masuk peredaran darah sistemik. Jumlah subjek berjumlah 12 orang dimana 6 orang mendapatkan pemberian obat produk inovator dan 6 orang mendapatkan pemberian produk copy

Standardisasi kondisi studi Kondisi studi harus dibakukan (untuk mengurangi variabilitas berbagai faktor yang terlibat kecuali produk yang diuji) : o subjek uji dipuasakan selama 10 jam sebelum pemberian obat asam mefenamat yang diujikan o studi BE asam mefenamat harus dilakukan bersama makanan standar;karena makanan dapat menikan kadar asam mefenamat dalam darah o Volume air yang diminum bersama produk harus konstan (antara 150 200 ml) karena dapat mempengaruhi pengosongan lambung; o Semua makanan dan minuman yang dikonsumsi setelah pemberian produk harus dibakukan komposisi dan waktu pemberiannya selama periode pengambilan sampel darah : Air boleh diminum kapan saja kecuali 1 jam sebelum dan 2 jam sesudah pemberian produk; Makanan standar diberikan tidak kurang dari 4 jam setelah pemberian produk;

o Subyek tidak boleh makan obat lain apapun (termasuk obat bebas dan obat tradisional) selama beberapa waktu sebelum penelitian (minimal 1 minggu) dan selama penelitian. o Subyek tidak boleh mengkonsumsi makanan dan minuman yang dapat berinteraksi dengan fungsi sirkulasi, saluran cerna, hati atau ginjal (misal : merokok, minum alkohol, kopi, teh, kola, coklat atau jus buah) selama 24 jam sebelum penelitian dan selama periode pengambilan sampel darah; o Subjek uji diatur agar dalam posisi duduk pada hari pengujian karena posisi tubuh dan aktivitas fisik juga harus distandardisir sepanjang hari penelitian karena akan mempengaruhi motilitas dan aliran darah saluran cerna. (Alil,2004) Genetic phenotyping Menurut (Alil,2004),Phenotyping subyek harus dilakukan karena diketahui asam mefenamat memiliki beberapa veriabilitas pada beberapa gen terkait seperti CYP3A4.Dosis harus disesuaikan pada subyek yang bersangkutan : untuk alasan keamanan pada studi menyilang maupun studi paralel; untuk menghindari terjadinya bias/variasi pada studi paralel

Dosis pemberian Dosis asam mefenamat yang diberikan adalah 500mg 500mg asam mefenamat diberikan 5 kali interval pemberian (5 x 8 jam) terlebih dahulu untuk mencapai kadar obat dalam plasma yang steady state. Pengambilan sample dilakukan saat obat mencapai kadar steady state.

Pengambilan sempel darah o sample darah digunakan untuk analisa kadar obat dalam sirkulasi sistemik o kadar obat atau metabolit diukur dalam serum atau plasma setelah obat dalam plasma sedah pada kondisi steady state. o Sampel darah harus diambil pada waktu-waktu tertentu sehingga dapat menggambarkan fase-fase absorpsi,distribusi, dan eliminasi obat;

o Untuk kebanyakan obat diperlukan 12-18 sampel darah, yakni : 1 sampel sebelum obat : pada waktu nol (t0) ; 2-3 sampel sebelum kadar maksimal (Cmax) ; 4-6 sampel sekitar Cmax ; 5-8 sampel setelah Cmax, sampai sedikitnya 3 atau lebih waktu paruh eliminasi obat dalam plasma (> 3 x t1/2). Dengan demikian akan diperoleh AUC (luas area dibawah kurva kadar obat terhadap waktu) sedikitnya 80% dari AUC yang diekstrapolasi ke tidak terhingga () o Estimasi waktu paruh eliminasi harus diperoleh dari sedikitnya 3-4 sampel selama fase log linear terminal; o Untuk obat atau metabolit aktifnya yang mempunyai waktu paruh eliminasi (t1/2) yang panjang (> 24 jam), sampel darah harus diambil sampai sedikitnya 72 jam jika variabilitas intra-subyek kecil, atau lebih lama jika variabilitas intra-subyek besar; o Pada studi keadaan tunak, untuk obat dengan kronofarmakologi, jika ritme sirkadian diketahui mempengaruhi bioavailabilitas, maka sampel darah harus diambil selama 1 siklus 24 jam penuh,namun asam mefenamat tidak terpengaruh siklus sirkardian. (Lo,1997) Pengambilan sampel urin o Sample unrin di kumpulkan dari subjek uji. Sample urin digunakan karena 50% dosis asam mefenamat diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3-hidroksimetil terkonjugasi Sampel urin hanya digunakan eliminasi obat melalui ginjal cukup besar (> 40%); o Urin dikumpulkan di tempat studi secara periodik sampai sedikitnya 3 x waktu paruh eliminasi obat (3 x t1/2).atau sampai obat dalam tubuh sudah pada kondisi steady state. o Studi dilakukan selama 24 jam, waktu sampling dilakukan pada jam 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 dan 24 jam. Volume urin setiap interval waktu tersebut harus diukur dan dilaporkan; o Dibuat kurva jumlah obat kumulatif yang diekskresi dalam urin terhadap waktu. (Hirai,1997)

Kadar yang diukur 1. Sampel darah Kadar yang diukur dalam plasma/serum adalah senyawa induk atau dalam hal ini adalah zat aktif dari asam mefenamat atau N-2,3xililantranilat. asam mefenamat dalam serum terdapat dalam bentuk utuh karena belum di metabolisme (bukan merupakan prodrug),asam mefenamat baru di metabolisme saat peroses eliminasi. (Lo,1997) 2. Sampel urin Kadar yang diukur dalam urin adalah metabolit 3-hidroksimetil terkonjugasi, karena sekitar 50% dosis asam mefenamat diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3-hidroksimetil terkonjugasi. (Goodman, 2007) Metode bioanalitik 1. Sampel darah (Lo,1997) Sampel asam mefenamat stabil dalam darah untuk dilakukan analisis selanjutnya Metode : microbore high-performance liquid chromatography diode array detection dan capillary gas chromatographyflame ionization detection. HPLC (HPLC-DAD): HPLC tipe Hewlett-Packard 1090 yang dilengkapi dengan detektor diode array Kolom : 200 mm x 2.1 mm I.D. microbore ODS-Hypersil (ukuran partikel 5 mm ) Fase gerak : sistem elusi gradien dengan larutan A: 2 mM bufer fosfst pH 3.2 dan larutan B: Acetonitrile Panjang gelombang analisis : 210 nm Flow-rate fase gerak : 0.4 ml/min Total waktu analisis : 35 menit Pengaturan gradien eluen : Time (min) 0 20 30 31 % Acetonitrile 5 50 50 5

GC (kromatografi gas) / GC-FID Gas kromatografi tipe Hewlett-Packard 5890 dengan detektor flame ionisasi Kolom : 25 m narrow-bore x 0.25 mm I.D. HP-5 (tebal film 0.33 mm) Kondisi analisis GC : suhu awal : 100 0C selama 1 menit ; suhu hingga akhir analisis : 3000C sampai 14menit, suhu injector : 3000C; suhu detector temperature: 3100C; tekanan gas N2: 250 kPa; tekanan gas H2: 105 kPa; tekanan udara: 300 kPa; column flow: 1 ml /min, kecepatan alir gas: 5 ml /min. Preparasi sempel Sample darah yang dianalisis harus bebas dari Human Immunodeficiency Virus I dan II, Treponema Pallidum dan virus Hepatitis B Disiapkan sample darah kontrol (tidak mengandung asam mefenamat yang dianalisis),darah diambil dari subjek sebelum pemberian obat.sampel disimpan pada suhu 40C selama 3 hari sebelum proses selanjutnya. Sampel darah di tambahkan 0.5 ml larutan NH4Cl jenuh Divortex selama 10 detik,lalu ditambahkan 5 ml extracting solvent (ethyl acetate mengandung 4.0 mg/ml heptabarbitone) Dikocok selama 15 menit Disentrifugasi pada 2500rpm selama 4 menit Supernatan diambil dan dipindahkan tabung reaksi,dan dikenai paparan gas nitrogen untuk menghilangkan pelarut organik pada sampel. Sampel di vortex dengan ditambahkan campuran 1 ml acetonitrile- hexane selama 10 s pada vortex. Pindahkan sampel pada vial sebanyak 2ml untuk siap dianalisis dengan HPLC-DAD dan GCFID Analisis sempel dengan HPLC-DAD Sistem HPLC yang digunakan dikalibrasi dengan cara menganalisa sampel darah kontrol lalu ditentukan linearitas pembacaan dengan penentuan korelasi relatif tinggi peak vs konsentrasi Sampel yang dianalisis dilakukan kuantifikasi dengan teknik penambahan internal standar. Internal standar yang dipakai adalah heptabarbitone (wktu retensi=15.837 min )

 Sample dianalisis kualitatif dengan parameter waktu retensi dan analisis kuantitatif (kadar) dengan menghitung luas peak yang dihasilkan. Analisis sempel dengan GC-FID Sampel yang dianalisis dilakukan kuantifikasi dengan teknik penambahan internal standar. Internal standar yang dipakai adalah heptabarbitone (wktu retensi=15.350 min ) Analisis kualitatif sampel menggunakan waktu retensi relati dan analisis kuantitatif (kadar) dengan menghitung luas peak yang dihasilkan. Kontrol kualitas metode analisis Analisis dilakukan dengan menganalisa sample darah standar dari Cardiff Bioanalytical Services, UK yang mengandung kadar asam mefenamat 5 g/ml Presisi metode analisis cukup baik dengan nilai CV berkisar 5.4 sampai 21.8%.

2. Sampel urin (Hirai et al,1997) Metode : high performance liquid chromatography dengan normal solid-phase extraction. HPLC : HPLC : sistem kromatografi terdiri dari waters 600E solvent delivery pump dengan JASCO 851-AS intelligent autosampler dan Shimadzu SPD-6AV variable-wavelenght detector. Millenium 2010 Chromatography Manager digunakan untuk integrasi puncak kromatografi. Kolom : reversed phase (fase terbalik) kolom Inertsil ODS-2 150 x 4.6 mm I.D. (ukuran partikel 5 m ) Fase gerak : sistem elusi gradien dengan larutan 50 mM buffer fosfat dan asetonitril (58:42,v/v) pada pH 5.0 Panjang gelombang analisis : 230 nm Flow-rate fase gerak : 0.9 ml/min Standar internal : indometasin Pembuatan larutan Larutan stok asam mefenamat dengan konsentrasi 1 mg/ml dibuat dengan pelarut metanol. Larutan ini akan stabil selama 1 bulan ketika disimpan pada -20 0C dalam freezer.

 Larutan kerja I digunakan untuk recovery study yang dibuat dengan mencampurkan larutan stok asam mefenamat yang telah dibuat yang diikuti dengan pengenceran menggunakan metanol sampai memiliki konsentrasi 50 g/ml. Larutan kerja II digunakan untuk persiapan kurva kalibrasi standar dan kontrol kualitas sampel yang disiapkan seperti larutan kerja I, tanpa penggunaan indometasin sebagai internal standar. Larutan ini dibuat dengan konsentrasi 50 g/ml. Larutan standar internal dibuat dengan cara mengencerkan larutan stok indometasin menggunakan metanol sampai memiliki konsentrasi 20 g/ml. Preparasi sampel Sep - Pak Silica cartridge yang digunakan untuk analisa sampel dicuci dengan 10 ml etil asetat dan dikeringkan. Sebanyak 100 l larutan internal standar diuapkan sampai kering pada suhu 37 C. Sebanyak 1,0 ml sampel urin ditambahkan, dan divortex. Sebanyak 250 l dari 1 M buffer asetat pH 5.0 ditambahkan ke sampel, dan divortex. Sebanyak 250 l dari larutan yang dihasilkan dimasukkan ke Sep-Pak silica cartride dan dikeringkan. Cartridge dielusi dengan 3 ml etil asetat, dan eluat diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen pada 37 C. Residu kering dilarutkan dengan 200 l fase gerak. Sebanyak 10-30 l dari reconstituent tersebut diinjeksikan ke HPLC. Sampel urin yang ditambahkan dengan asam mefenamat dengan konsentrasi yang telah diketahui, disiapkan sebanyak larutan kerja I dan II yang telah diencerkan, kemudian diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen pada water bath 37 C. Sebanyak 1,0 ml urin yang bebas asam mefenamat ditambahkan dan divortex. Pembuatan sample biologis Sample kontrol menggunakan urin bebas obat yang diperoleh dari subjek uji sebelum pemberian obat asam mefenamat. Urin dari subjek uji diambil setelah obat berada pada keadaan tunak didalam tubuh (5 kali interfal pemberian) Setelah pemberian asam mefenamat 500mg maka sampel urin diambil pada interval waktu yang sudah ditentukan di awal

 Sample urin diukur volume dan pH tiap kali pengambilan Sample lalu disimpan pada suhu -20C sampai akan dianalisis. Metode Validasi Recovery dan reproducibility Dibuat latutan asam mefenamat dengan konsentrasi 0.2, 1.0 dan 5.0 g/ml. Tiap konsentrasi dibuat menjadi 6 replikasi. Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis yang mana setelah itu peak yang muncul pada kromatogram dibandingkan tingginya dengan larutan asam mefenamat standar pada konsentrasi yang sama. metode yang digunakan harus mempunyai nilai recovery >78% Linearitas Dibuat larutan asam mefenamat dengan seri konsentrasi pada rentang 0.05-10.0 g/ml Tiap konsentrasi dibuat menjadi 7 replikasi. Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis kadarnya. metode yang digunakan harus mempunyai linearitas dengan r lebih besar dari 0,99 Akurasi dan presisi Dibuat latutan asam mefenamat dengan konsentrasi 0.05, 0.5 dan 5.0 g/ml. Tiap konsentrasi dibuat menjadi 3 replikasi. Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis kadarnya. Dari kadar yang diukur pada setiap konsentrasi,nilai relatif standar deviasi yang diperoleh tidak boleh lebih dari 5%. Kuantifikasi Sampel dianalisis menggunakan HPLC ddengan cara menginjeksikannya ke kolom. Panjang gelombang yang digunakan adalah 230 nm. Konsentrasi dari asam mefenamat dalam sampel urin dihitung dengan membandingkan rasio tinggi puncak dari asam mefenamat/standar internal dengan kalibrasi sampel urin yang mengandung konsentrasi asam mefenamat yang diketahui. Parameter farmakokinetik yang diukur Bentuk dan luas area di bawah kurva kadar plasma terhadap waktu (data darah), serta profil ekskresi ginjal kumulatif dan kecepatan ekskresi (data urin) digunakan untuk menilai jumlah dan kecepatan absorpsi / jumlah yang bioavailabel dalam tubuh.

1. Data Darah o AUCt = Area di bawah kurva kadar asam mefenamat dalam plasma (atau serum atau darah) terhadap waktu dari waktu 0 sampai waktu terakhir kadar obat diukur dihitung secara trapezoidal. o AUC = AUC dari waktu 0 sampai waktu tidak terhingga = AUCt + Ct / ke (menggambarkan jumlah obat yang bioavailabel) o Cmax = kadar puncak (maksimal) asam mefenamat dalam plasma (atau serum atau darah) yang teramati. o tmax = waktu sejak pemberian asam mefenemat sampai dicapai Cmax o t1/2 = waktu paruh asam mefenamat dalam plasma (atau serum atau darah) AUC dan Cmax merupakan parameter yang paling relevan untuk penilaian BE. AUCt paling dapat dipercaya untuk menggambarkan besarnya absorpsi (jumlah obat yang bioavailabel) 2. Data Urin o Aet = jumlah kumulatif metabolit asam mefenamat yang dikeluarkan atau ditemukan dalam urin dari waktu 0 sampai waktu terakhir kadar diukur o Ae = Ae dari waktu 0 sampai waktu tidak terhingga, diperoleh dengan cara ekstrapolasi = jumlah obat maksimal yang diekskresi dalam urin sebanding dengan jumlah obat yang bioavailabel o dAe/dt = kecepatan ekskresi metabolit asam mefenamat dalam urin o (dAe/dt)max = Kecepatan maksimal ekskresi obat dalam urin terjadi pada waktu tmax (plasma) dan besarnya sebanding dengan Cmax (plasma),sehingga besarnya bergantung pada jumlah dan kecepatan absorpsi. Ae dan (dAe/dt)max merupakan parameter yang paling relevan untuk penilaian BE. Aet paling dapat dipercaya untuk menggambarkan besarnya absorpsi (jumlah obat yang bioavailabel). Analisis data Data farmakokinetik yang telah dikumpulkan dari setiap subjek dilakukan analisa lebih lanjut dengan analisis statistik yang sesuai untuk menghitung perbedaan bioavailabilitas antara produk uji dan produk pembanding, dan untuk menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang bermakna secara klinik.

1. Data Darah Parameter bioavailabilitas yang dibandingkan untuk penilaian bioekivalensi adalah AUC,Cmax dan tmax. Cara menghitung AUC0t ; AUC0- ; ke , t1/2 harus dicantumkan. AUC dan Cmax, ditransformasi logaritmik (ln) terlebih dulu sebelum dilakukan analisis statistik karena kinetik obat mengikuti kinetik first order sehingga dalam skala logaritmik akan diperoleh distribusi yang normal dan varians yang homogen. nilai nilai ln AUC ke-2 produk dibandingkan menggunakan analisis varians (ANOVA). 2. Data Urin Parameter yang dibandingkan adalah Ae dan (dAe/dt)max Kriteria Bioekivalen (BPOM,2005) Produk uji asam mefenamat (test = T) dan produk pembanding ponstan (reference = R) dikatakan bioekivalen jika : a. Rasio nilai rata-rata geometrik (AUC)T / (AUC)R = 1.00 dengan 90% Cl = 80 125%. b. Rasio nilai rata-rata geometrik (Cmax)T / (Cmax)R juga = 1.00 dengan 90% C I = 80-125%. Oleh karena Cmax lebih bervariasi dibanding AUC, maka interval yang lebih lebar mungkin cocok. Interval ini harus ditetapkan sebelumnya, c. Perbandingan tmax dilakukan hanya jika ada claim yang relevan secara klinik mengenai pelepasan atau kerja yang cepat atau adanya tanda-tanda yang berhubungan dengan efek samping obat. 90% CI dari perbedaan tmax harus terletak dalam interval yang relevan secara klinik. Catatan : Nilai confidence interval (CI) tidak boleh dibulatkan ; jadi untuk CI 80125, nilainya harus minimal 80.00 dan tidak lebih dari 125.00.

DAFTAR PUSTAKA AliI,obaid et al, 2004, Pharmacokinetics Differences Of Tab Mefenamic Acid (Ma) 5oomg (One Pill) And 250mg (Two Pill) With And Without Food, Inti. Chem. Pharm. Med. J. Vol. 1, pp.63-68 (2004). Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Jakarta, Departemen Kesehatan RI. Ari,Ardiarini ,2006 , Perbandingan Bioavailabilitas ( Bioekivalensi ) Obat asam mefenamat Dalam Sediaan Generik Dan Paten Secara In Vitro. artikel karya tulis ilmiah, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang. BPOM,2005, Pedoman Uji Bioekuivalensi, Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat Dan MakananRepublik IndonesiaNomor : Hk.00.05.3.1818 , Badan Pengawas Obat Dan Makanan, Jakarta. Goodman dan Gilman, 2007, Dasar Farmakologi Terapi, Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran EGC. Hirai T., Shozo M., Ikuo K., 1997, Simultaneous analysis of several non-steroidal anti-inflammatory drugs in human urine by high-performance liquid chromatography with normal solid-phase extraction, Elsevier Science B.V. S0378-4347(96)00509-9. Lo, T.C. Chao, S.E. Ng-Ong, Y.J. Yao, T.H. Koh , 1997 , Acidic and neutral drugs screen in blood with quantitation using microbore high-performance liquid chromatographydiode array detection and capillary gas chromatographyflame ionization detection. Forensic Science International 90 (1997) 205214. Munaf S, 1994, Catatan Fuliah Farmakologi Bagian II, Jakarta, Penerbit Buku Kedokteran EGC. Setiabudy, R, 2009, Farmakologi dan Terapi E V, Jakarta, Balai Penerbit Fakultas Kedokteran UI. Singh H, Rajnish K, Pinderjith S, 2011, Development Of Uv Spectrophotometric Method For Estimation Of Mefenamic Acid In Bulk And Pharmaceutical Dosage Forms. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences ISSN- 0975-1491 Vol 3. USP , 2013, Mefenamic Acid Tablet. Compendium.html, The United States Pharmacopeial Convention. Diakses tanggal 3 januari 2013.