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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIN DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

REA DE MICROBIOLOGIA

Prcticas de Laboratorio de Microbiologa UNIVERSIDAD DEL CAUCA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO M!TODOS DE
SIEM"RA DE MICROOR#ANISMOS $"ACTERIAS% 1. INTRODUCCIN

Gua No. 5

Las bacterias so& orga&is'os s()re'a'e&te ada)tables a di*ere&tes s(stratos+ Co& base a s(s re,(eri'ie&tos &(tricio&ales se co&sidera& co'o e-ige&tes . &o e-ige&tes+ S( est(dio se /a /ec/o )osible gracias a la i')le'e&taci0& de los 'edios de c(lti1os ,(e le s('i&istra& al orga&is'o los ele'e&tos &ecesarios )ara s( creci'ie&to+ Los 'edios de c(lti1o so& )re)aracio&es (tili2adas )ara '(c/os )ro)0sitos3 co'o4 aisla'ie&to e ide&ti*icaci0& de 'icroorga&is'os3 )r(eba de esterilidad3 a&5lisis de ag(a3 a'bie&tales3 ali'e&tos . )rod(ctos bacteriol0gicos . )r(eba de se&sibilidad a los a&tibi0ticos+ Las bacterias a(t0tro*as )(ede& (tili2ar el &itr0ge&o libre3 a'o&iaco o &itrato3 de tal 'a&era ,(e los 'edios )(ede& ser '(. si')les6 los /eter0tro*os co& (&a ca)acidad si&t7tica '5s li'itada re,(iere& co')(estos '5s co')le8os debido a ,(e las c7l(las &o )(ede& obte&er s(s re,(eri'ie&tos de &itr0ge&o directa'e&te de las )rote&as3 7stas debe& estar /idroli2adas e& co')(estos &itroge&ados '5s dis)o&ibles6 estos /idroli2ados so& co&ocidos co'o )e)to&as3 deri1ados de las )rote&as )or 'edio de 5cidos3 5lcalis o e&2i'as . so& sol(bles e& ag(a+ 1.1. COMPOSICIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

A(&,(e los di*ere&tes 'edios co&tie&e& gra& ca&tidad de s(sta&cias de)e&die&do del 'icroorga&is'o ,(e se desee aislar3 b5sica'e&te est5& co')(estos de4 P !"o#a$4 Vara& de )(re2a . calidad de)e&die&do del ti)o de /idr0lisis reali2ada+ Los 5lcalis tie&de& a destr(ir el co&te&ido 1ita'&ico de la )rote&a . ta'bi7& /ace& )erder )arte de los a'i&o5cidos6 la /idr0lisis e&2i'5tica co&ser1a las 1ita'i&as . a'i&o5cidos6 la %a$ #a )(ra &o co&tie&e carbo/idratos . tie&e alto co&te&ido 1ita'&ico . de "&'!"()a#o+ E8+ U&a )e)to&a3 case&a digerida )or la tri)si&a &o sir1e )ara las )r(ebas de *er'e&taci0&3 )ero si )ara detectar )rod(cci0& de i&dol3 la case&a /idroli2ada )or 5cido &o tie&e tri)t0*a&o &i carbo/idratos . )(ede (tili2arse e& e&sa.os de co&te&ido 1ita'&ico e& s(ero )or &o te&er 1ita'i&as6 la )e)to&a de la gelati&a obte&ida )or acci0& e&2i'5tica &o tie&e carbo/idratos &i tri)t0*a&o )(esto ,(e &o est5& )rese&tes e& la gelati&a )(ra+ Las )e)to&as de lec/e3 car&e . le1ad(ras co&tie&e& los carbo/idratos res)ecti1os3 )rese&tes e& el 'aterial origi&al . )or lo ta&to &o debe& (tili2arse e& )r(ebas de *er'e&taci0&+ I#)u$'(# * +"&a%"o$4 So& de car&e . otros te8idos6 se trata del 'aterial de orige& )roteico3 sol(ble e& ag(a3 si& acci0& e&2i'5tica+ Las )rote&as 'is'as se coag(la& )or el calor3 a*ort(&ada'e&te la acci0& e&2i'5tica 'icrobia&a . el tie')o de i&c(baci0& a('e&ta& la *acilidad de (tili2aci0&+ A, #" $ $o-'.')'%a#" $/ Agar3 #elati&a3 Agarosa3 Agar &oble+ A, #" $ $ - %"'0o$4 So& ge&eral'e&te colora&tes3 tales co'o Cristal 1ioleta o 1erde brilla&te3 ,(e i&/ibe& bacterias #ra' )ositi1os o co'o A2ida de sodio3 Citrato de 2 ) U#'.a. . & a P& $'.NaCl3 #" Co3'"4 Sodio3 Tel(rito de )otasio . La(r.l s(l*ato de sodio ,(e i&/ibe& #ra' &egati1os+ T4%#'%o A31' #"a. P& $'. #" Co3'"4 . P-a# R %"o& Coo&.'#a.o& Co3'"4 D $a%"'0a%'(# R $'.uo$ 5u3'%o$ E-a1o&a.o !o&/ R 0'$a.o Po&/ A!&o1a.a !o&/ F %6a . A!&o1a%'(#/

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SIEM"RA DE MICROOR#ANISMOS $"ACTERIAS% El )9 ta'bi7& se e')lea co'o age&te selecti1o+ Por e8e')lo3 (& )9 de :+;<=+; es selecti1o )ara bacterias co'o Vibrio chlolerae+

Gua No. 5

A, #" $ a#"'3'%&o1'a#o$+ Alg(&os 'edios co&tie&e& age&tes tales co'o a&tibi0ticos o biocidas3 ,(e act>a& co'o age&tes a&ti'icrobia&os+ 1.7. CUIDADO Y RECOMENDACIONES4

Los 'edios de c(lti1o )(ede& )re)ararse a )artir de s(s co')o&e&tes o seg>& las reco'e&dacio&es del *abrica&te3 c(a&do este se co&sig(e co'ercial'e&te /a. 1arias reglas ,(e se debe& g(ardar )ara aseg(rar la b(e&a calidad del 'edio )re)arado+ El ag(a (tili2ada debe ser destilada3 bidestilada o des'i&erali2ada3 )ro1e&ie&te de (& siste'a adec(ado de destilaci0&6 s( 'edida debe ser e-acta . e& &i&g>& 'o'e&to co& a)ro-i'acio&es ,(e ge&eral'e&te se trad(ce& e& (&a alteraci0& de la co&siste&cia del 'edio3 es)ecial'e&te c(a&do se trata de agares3 c(.os age&tes solidi*ica&tes re,(iere& trata'ie&to e-acto+ Si los i&gredie&tes &ecesarios )ara )re)arar el 'edio de c(lti1o so& des/idratados debe& )er'a&ecer e& re'o8o d(ra&te ?@ 'i&(tos3 co& la *i&alidad de )er'itir (&a /idrataci0& total de las 'ol7c(las3 lo c(al e1ita el cale&ta'ie&to e-cesi1o ,(e co&d(ce ge&eral'e&te a e1a)oraci0& . desco')osici0& del 'edio+ A&tes de so'eterse a la acci0& del a(tocla1e el 'edio debe estar co')leta'e&te dis(elto+ No disol1erlo co& la te')erat(ra del a(tocla1e3 )(es ge&eral'e&te el e-ceso de calor )rod(ce (& 'edio co& gr('os debido a (&a de*icie&te disol(ci0&+ Los 'edios de c(lti1o ,(e co&tie&e& .e'a de /(e1o3 carbo/idratos3 (rea o c(al,(ier &(trie&te3 &o )(ede& ser esterili2ados e& a(tocla1e6 estos 'edios se )re)ara& esterili2a&do )or se)arado lo ,(e co&oce'os co'o base $se esterili2a e& a(tocla1e% . los s()le'e&tos )or *iltraci0& o 1a)or *l(e&te6 la 'e2cla de los co')o&e&tes se reali2a c(a&do la base se /a e&*riado e&tre A@ . @; BC+ Los 'edios Agar SS . bis'(to de s(l*ito3 e&tre otros3 &o )(ede& ser esterili2ados e& a(tocla1e+ E& todo caso3 debe& leerse dete&ida'e&te las reco'e&dacio&es del *abrica&te3 las c(ales 1ie&e& es)eci*icadas e& el e'base del 'edio de c(lti1o+ Todos los 'edios de c(lti1o des)(7s de )re)arados . 1ertidos e& la ca8a de )etri est7riles3 debe& ser secados3 co& la *i&alidad de eli'i&ar el e-ceso de ag(a ,(e ,(eda e& la s()er*icie )ara e1itar la coalesce&cia . 'e2cla de las colo&ias c(a&do se /ace la sie'bra+ El secado de la s()er*icie ta'bi7& )re1ie&e la co&ta'i&aci0&6 se lle1a a cabo e& la est(*a i&c(badora a CD BC d(ra&te E; 'i&(tos a)ro-i'ada'e&te3 ,(ita&do la ta)a de la ca8a . coloca&do el 'edio co& la s()er*icie Des)(7s las ca8as se E-a1o&a.o !o&/ R 0'$a.o Po&/ /acia aba8o+ A!&o1a.a !o&/ del secado F %6a . A!&o1a%'(#/ )(ede& g(ardar e& re*rigeraci0& e&1(eltas e& bolsas )l5sticas /asta )or tres 'eses3 de)e&die&do del 'edio de Los ,(e a&tibi0ticos debe& (tili2arse 2 )c(lti1o+ U#'.a. . & 'edios a P& co&tie&e& $'. #" Co3'"4 e& corto tie')o+ T4%#'%o A31' #"a. P& $'. #" Co3'"4 . P-a# R %"o& Coo&.'#a.o& Co3'"4 D $a%"'0a%'(# R $'.uo$ 5u3'%o$

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7. OB2ETIVOS A)licar t7c&icas )ara la )re)araci0& de los 'edios de c(lti1o . reco&ocer la i')orta&cia de s(s co')o&e&tes )ara el creci'ie&to bacteria&o+ E&sa.ar los '7todos bacteriol0gicos '5s (s(ales )ara el creci'ie&to . aisla'ie&to de 'icroorga&is'os+ 8. CONSULTAS PRELIMINARES Los est(dia&tes deber5& co&s(ltar e& c(al,(ier te-to de 'icrobiologa as)ectos ge&erales sobre los 'edios de c(lti1o+ 9. MATERIALES Por gr()o de traba8o se e')lear5& los sig(ie&tes 'ateriales4 Erle&'e.er E@; 'l T(bos de e&sa.o co& ta)a rosca Ca8as de Petri Asa bacteriol0gica Es)5t(la Pa)el al('i&io $)orci0&% C(lti1o bacteria&o 5. REACTIVOS Agar &(triti1o Pe)to&a Ag(a destilada ?;; 'l F; 'l E@; 'l 1 F C ? ? ? ?

No /a. restricci0& de seg(ridad )or el (so de estos 'edios de c(lti1o+ Re'itirse al )rotocolo de )re)araci0& reco'e&dado )or el )ro1eedor e& el e'base del 'edio de c(lti1o+ :. E5UIPOS "ala&2a de )recisi0& I&c(badora A(tocla1e
E-a1o&a.o !o&/ R 0'$a.o Po&/

? ? ?
A!&o1a.a !o&/ F %6a . A!&o1a%'(#/

La i&c(badora estar5 )re1ia'e&te calibrada a la te')erat(ra re,(erida )or el A(-iliar de Laboratorio+ Ga1or &o 'a&i)(lar el e,(i)o . 'a&te&erlo cerrado+ Abrir sola'e&te )ara 2 ) U#'.a. . & a P& $'. #" Co3'"4 i&cl(ir el c(lti1o a i&c(bar+ T4%#'%o A31' #"a. P& $'. #" Co3'"4 . P-a# R %"o& Coo&.'#a.o& Co3'"4 D $a%"'0a%'(# R $'.uo$ 5u3'%o$

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;. PROCEDIMIENTO Para cada (&o de los 'edios de c(lti1os des/idratados o de otros co')o&e&tes ,(e est5& dis)(estos e& e-/ibici0&3 a&ote los sig(ie&tes datos4 No'bre3 co')osici0&3 (sos3 )re)araci0&+ Desta)e el e&1ase . deter'i&e $si& tocar s( co&te&ido%4 color3 olor3 te-t(ra $cristales3 gr5&(los3 )ol1o%+ Realice esta obser1aci0& del 'edio lo '5s r5)ido )osible3 )(es los 'edios de c(lti1o so& alta'e&te /igrosc0)icos $absorbe& /('edad%+ ;.1 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS COMERCIALES E*ect>e los c5lc(los corres)o&die&tes )ara )re)arar @; 'L de agar &(triti1o co'ercial+ Siga las i&str(ccio&es de la eti,(eta del *rasco+ Esta ca&tidad ser5 distrib(ida de la sig(ie&te *or'a4 D 'L e& t(bo i&cli&ado C 'L e& t(bo e& col('&a F; 'L e& ? Erle&'e.er+ Esterilice los 'edios de c(lti1o e& la a(tocla1e+ + Des)(7s de ,(e los 'edios de c(lti1o salga& del a(tocla1e de8e e&*riar /asta a)ro-i'ada'e&te @;BC . 1ierta el co&te&ido del erle&'e.er e& dos ca8as de )etri $E; 'L e& cada (&a% e i&c(be el resto e& baHo 'ara a A@oC3 i&cli&e (&o de los t(bos . )o&ga el otro 1ertical'e&te3 de8e e&*riar . rot(le+ E*ect>e los c5lc(los )ara )re)arar C; 'L de caldo &(triti1o+ Siga las i&str(ccio&es de la eti,(eta3 1ierta )orcio&es de @ 'L e& F t(bos de e&sa.o3 rot(le3 esterilice . de8e e&*riar+ Pre)are ?;; 'L de Ag(a Pe)to&ada3 1i7rtalos e& F t(bos de =+= 'L . esterilice+ Estos 'edios se g(ardar5& )ara ser e')leados e& el sig(ie&te )rocedi'ie&to+ ;.7 AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE MICROORGANISMOS <BACTERIAS= La obser1aci0& e i&ter)retaci0& de los c(lti1os )ri'arios des)(7s de la i&c(baci0& es el )aso de*i&iti1o e& la decisi0& de co&ti&(ar o &o co& la ide&ti*icaci0& de los 'icroorga&is'os aislados+ La decisi0& se basa e& la obser1aci0& de las caractersticas . &>'ero de cada ti)o de colo&ia3 grado de )(re2a3 coloraci0& de #ra' . los ca'bios e& el 'edio de c(lti1o ,(e rodea la colo&ia los c(ales re*le8a& la acti1idad 'etab0lica de la bacteria aislada3 ele'e&to i')orta&te e& la ide&ti*icaci0&+ Se debe te&er e& c(e&ta las caractersticas del creci'ie&to4 ta'aHo3 ele1aci0&3 'arge&3 E-a1o&a.o !o&/ R 0'$a.o Po&/ A!&o1a.a *ila'e&tosa3 !o&/ F %6a . A!&o1a%'(#/ color3 s()er*icie3 co&siste&cia . *or'a $)(&ti*or'e3 circ(lar3 ri2oide3 etc+%+
2 ) U#'.a. . & a . P& $'. #" Co3'"4 . P-a# R %"o& Coo&.'#a.o& Co3'"4 D $a%"'0a%'(# R $'.uo$ 5u3'%o$ P& $'. #" Co3'"4 T4%#'%o A31' #"a-

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Ig(al'e&te3 los ca'bios e& los 'edios de c(lti1o di*ere&ciales6 1arios colora&tes i&dicadores de )9 e1ide&cia& la acti1idad 'etab0lica . a.(da& a ide&ti*icar las colo&ias aisladas+ ;.7. 1. CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS BACTERIANOS Esterilice el asa e& la lla'a del 'ec/ero cale&t5&dola co')leta'e&te /asta el ro8o+ Co& el asa sie'bre se)arada'e&te (&a '(estra del c(lti1o ,(e le corres)o&da4 Proteus sp, E. coli, B. Cereus, Salmonella, S. aureus, Pseudomona sp3 o Klebsiella sp.; E& (& t(bo de e&sa.o co& agar &(triti1o i&cli&ado i&trod(2ca el asa e& l&ea recta e i&oc(le la s()er*icie del 'edio+ Gla'ee la boca del t(bo . t5)elo+ Gla'ee &(e1a'e&te3 esterilice &(e1a'e&te el asa+ Re)ita el a&terior )rocedi'ie&to co& el t(bo co& agar &(triti1o e& col('&a+ Obte&ga otra '(estra del c(lti1o bacteria&o . ra.e s(a1e'e&te de 'a&era /ori2o&tal sobre la s()er*icie del agar co&te&ido e& (&a ca8a de )etri+ Ta)e . esterilice el asa+ No ol1ide rot(lar+ I&oc(le de 'a&era si'ilar el c(lti1o dis)o&ible e& caldo &(triti1o3 agita&do bie& el asa de&tro del caldo+ I&c(be )or ?: < EA /oras3 /aga obser1acio&es . es,(e'as3 describa co'o crece el 'icroorga&is'o est(diado3 a.>dese co& las *ig(ras a&e-as+

;.7.7. METODOS DE AISLAMIENTO ;.7.7.1. E# $u! &)'%' 4 Co& el asa bacteriol0gica to'e (&a '(estra de (& t(bo ,(e co&tie&e (& c(lti1o bacteria&o 'i-to3 $' 31& !o& $"&a$ sobre (& tercio de la ca8a de )etri ,(e co&tie&e agar &(triti1o3 de la sig(ie&te 'a&era4 Gla'ee el asa+ E& (& e-tre'o de la ca8a co& agar realice ra.ados s(a1es e& *or'a /ori2o&tal sobre la s()er*icie del agar (tili2a&do el asa $*or'a&do estras% )ara reali2ar el )ri'er aisla'ie&to bacteria&o3 gire la ca8a =;B . *la'ee el asa6 co&ti&>e el aisla'ie&to reali2a&do el 'is'o )rocedi'ie&to e& los tres e-tre'os resta&tes de la ca8a+ E& el >lti'o e-tre'o3 c(a&do este reali2a&do la estriaci0& te&ga c(idado de &o tocar co& el asa el )ri'er ra.ado ,(e reali20+

;.7.7.7. E# !&o)u#.'.a.4 T7c&ica (tili2ada )ara /acer rec(e&to a )artir de dil(cio&es+ Co& este '7todo de sie'bra es '5s *5cil obser1ar reaccio&es 'etab0licas bacteria&as3 tales co'o4 li)0lisis3 )rote0lisis . *er'e&tacio&es+ El 'edio de c(lti1o )re)arado e& el erle&'e.er debe estar *(&dido . a A@ BC+ E-a1o&a.o To'e ?!o&/ 'L del c(lti1o 'i-to . tra&s*i7ralo al t(bo co& = 'L R 0'$a.o Po&/ A!&o1a.a !o&/ de Ag(a Pe)to&ada+ F %6a . A!&o1a%'(#/ To'e ? 'L de la dil(ci0& a&terior . de)ostelo e& el ce&tro de la ca8a de )etri est7ril 1aca+ 2 ) U#'.a. . & a P& $'. #" Co3'"4
T4%#'%o A31' #"a. P& $'. #" Co3'"4 . P-a# R %"o& Coo&.'#a.o& Co3'"4 D $a%"'0a%'(# R $'.uo$ 5u3'%o$

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Gua No. 5

Verter el 'edio de c(lti1o e& la ca8a de )etri . /o'oge&ei2ar )or 'o1i'ie&tos giratorios /ori2o&tales e& 1arias direccio&es3 te&ie&do c(idado de &o *or'ar b(rb(8as+ De8ar solidi*icar e i&c(bar+

>. OBSERVACIONES? CLCULOS Y RESULTADOS A&ote las obser1acio&es reali2adas sobre los c(lti1os3 e&*ati2a&do e& las caractersticas del creci'ie&to de las bacterias+ Para tales e*ectos3 e')lee los descri)tores e&tregados e& la #(a de Pr5ctica No+ C+ @. RECUPERACIN? DESACTIVACIN YAO ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS. Los resid(os res(lta&tes corres)o&de& a c(lti1os bacteria&os3 los c(ales se i&acti1a& . esterili2a& e& a(tocla1e+ U&a 1e2 ter'i&ado el )roceso de esterili2aci0&3 los resid(os se dis)o&e& e& bolsas ter'oresiste&tes3 se de8a& e&*riar /asta solidi*icaci0& . se al'ace&a& te')oral'e&te ba8o co&gelaci0&3 La dis)osici0& *i&al se /ace 'edia&te el ser1icio de recolecci0& de resid(os biol0gicos co&tratado )or la U&i1ersidad co& la Ad'i&istraci0& M(&ici)al+ 1B. BIBLIOGRAFA MADI#AN M+ T+3 MARTINIO J+M+ . PARIER J+ "ROCI+ "iologa de los 'icroorga&is'os+ Octa1a edici0&+ Pearso& Pre&tice 9all3 Madrid3E;;A+

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