PROF. DR.

MARIANA SINCAI

ASIST. DIANA ARGHERIE

SEF. LUCR. DIANA GNGA

BIOLOGIE CELULARA SI EMBRIOLOGIE VETERINARA

FACULTATEA DE MEDICINA VETERINARA TIMISOARA

-2005-

CAPITOLUL I TEHNICI DE STUDIERE ALE CELULELOR,TESUTURILOR SI ORGANELOR

Pentru a studia structura materiei vii din celule, tesuturi si organe si care nu poate fi investigata cu ochiul liber, se utilizeaza aparate si metode speciale de cercetare. 1.INSTRUMENTELE OPTICE Aparatele optice maritoare cele mai uzuale n laboratoarele de cercetari si didactice sunt lupele si microscoapele, care functioneaza pe principiul formarii imaginilor prin lentilele convergente. Lupele pot fi mono sau binoculare si sunt utilizate pentru examinarea structurilor la limita dintre macro si microscopic. Puterea de marire a lupelor este de 30 50 de ori. Imaginea obtinuta este virtuala si dreapta. Principiul de functionare al lupelor se bazeaza pe utilizarea lentilelor convergente. Microscoapele sunt instrumente optice, a caror putere de marire se bazeaza pe utilizarea lentilelor convergente. Exista microscoape clasice si microscoape speciale. Microscopul clasic (optic sau fotonic) este alcatuit dintr-o parte mecanica si o parte optica (Fig. 1). Partea mecanica este alcatuita din metal si sustine partea optica. Cuprinde mai multe componente: - Piciorul are rol de suport; poate prezenta forme variate. La microscoapele care folosesc o sursa de lumina electrica, n picior sunt dispuse becul, oglinda, filtrul, diafragma. - Coloana (tija, mnerul) are rol de mner si suport pentru tubul microscopului si vize. Se deplaseaza n sens vertical pe o sina, cu ajutorul vizelor. - Masa (platina) constituie dispozitivul pe care se aseaza preparatul histologic care urmeaza sa fie examinat. Masa poate avea forme diferite (rotunda, dreptunghiulara). Prezinta central un orificiu care permite fasciculului de lumina sa ajunga la preparat. Preparatul histologic se fixeaza pe masa cu ajutorul unor piese metalice numite valeti sau carucior, n functie de tipul de microscop. Acestia, mpreuna cu preparatul, pot fi deplasati lateral cu ajutorul unei sine actionata de un surub plasat sub masa microscopului. De asemenea, masa poate fi deplasata antero posterior prin intermediul unui alt sistem de sine, actionat de un alt surub, angrenat cu precedentul. - Tubul, respectiv tuburile (doua pentru microscopul binocular), prezinta la partea inferioara revolverul de care sunt atasate obiectivele, iar la partea superioara ocularul sau ocularele.

- Revolverul este alcatuit din doua calote metalice, una superioara, fixata la partea inferioara a tubului si una inferioara mobila, prevazuta cu orificii pentru nsurubarea obiectivelor si care prin rotire permite asezarea n axa optica a microscopului, a obiectivului cu puterea de marire dorita. - Vizele constituie dispozitive prin care se realizeaza apropierea sau ndepartarea obiectivului de preparatul histologic. Sunt doua tipuri de vize: macrometrica si micrometrica. Cu viza macrometrica se efectueaza miscari de amplitudine mare, prin care se obtine imaginea cmpului microscopic din preparatul histologic care se studiaza. Cu viza micrometrica se executa miscari fine, prin care se clarifica imaginea obtinuta cu viza macroscopica. Partea optica cuprinde aparatul de captat si transmis lumina si aparatul de marire. Aparatul de captat si transmis lumina este format din: - Oglinda, situata n piciorul microscopului, fixata la un unghi de 450, astfel nct sa capteze si sa proiecteze fasciculul luminos n axa optica a microscopului; - Diafragma, alcatuita dintr-un sistem de lame semilunare montate ntr-un inel metalic, permite reglarea cantitatii de lumina proiectata asupra preparatului. Este montata n picior si actionata de un dispozitiv lateral; - Filtrul este alcatuit dintr-un disc de sticla alba mata introdus ntr-un inel metalic. Este plasat naintea becului si are rolul de a micsora intensitatea luminii; - Condensatorul este alcatuit din 2 3 lentile convergente, cuprinse ntr-o camasa metalica. El este situat sub masa microscopului si se poate deplasa n plan vertical printr-un sistem de sine, actionat de un surub lateral. Condensatorul are rolul de a concentra fasciculul luminos asupra preparatului histologic. Cu ct condensatorul este mai ridicat mai aproape de preparatul histologic, lumina este mai puternica, deoarece se reduce spatiul de aer dintre lentila condensatorului si sticla preparatului histologic, spatiu n care razele luminoase se refracta si si schimba directia. Aparatul de marire cuprinde obiectivele si ocularele. Obiectivele sunt alcatuite dintr-un sistem de lentile convergente dispuse ntro camasa metalica. Lentila inferioara a obiectivului colectoare este plan convexa (partea plana este spre preparat) si are proprietati maritoare. Celelalte lentile servesc la corectarea imaginii formate de lentila frontala. Puterea de marire a lentilei colectoare este direct proportionala cu curbura lentilei si invers proportionala cu diametrul ei (cu ct diametrul lentilei este mai mic, puterea de marire a obiectivului este mai mare). Spatiul liber dintre preparatul histologic si lentila obiectivului constituie distanta frontala. Obiectivele se clasifica n: - Obiective uscate, la care ntre preparat si lentila frontala ramne un spatiu de aer n care razele luminoase sufera fenomenul de refractie; - Obiective umede (de imersie), la care ntre preparat si lentila frontala se interpune un lichid (ulei de cedru) care prezinta acelasi indice de refractie cu al

sticlei, suprimnd astfel fenomenul de refractie (razele luminoase, la trecerea dintrun mediu cu o anumita densitate ntr-un mediu cu o alta densitate si schimba directia). Aceste obiective au o putere mare de marire si sunt marcate cu un inel negru. Notarea obiectivelor se face dupa puterea lor de marire: - obiective mici: 6, 10, 20 X; - obiective mari: 40, 60 X; - obiective de imersie: 90, 100 X. Ocularul este alcatuit dintr-un sistem de lentile convergente situate ntr-un tub metalic. Corespunzator puterii lor de marire, ele se noteaza astfel: 5, 7, 10, 15, 20 X. Puterea de marire a microscopului se calculeaza nmultind puterea de marire a obiectivului cu cea a ocularului.

Ocular Obiective Coloana (tija sau mner) Masa sau platina Viza micrometrica Diafragma Lumina Piciorul sau baza Viza macrometrica

Fig. 1. Microscopul clasic

Formarea imaginii la microscop Preparatul histologic este situat n afara focarului obiectivului. Obiectivul realizeaza o prima imagine, marita, rasturnata si reala, care se formeaza ntre focarul ocularului si lentila ocularului. Ocularul actioneaza fata de aceasta imagine ca o lupa, realizndu-se astfel o imagine virtuala marita si dreapta, situata ntre obiect si lentila frontala a condensatorului. Astfel, imaginea finala obtinuta este, fata de obiect, marita, rasturnata si virtuala. Imaginea finala este situata ntre obiect si lentila frontala a condensatorului. Alte tipuri de microscoape Microscopul cu contrast de faza. La condensator se adapteaza un dispozitiv, care transforma varietatile indicilor de refractie a diferitelor structuri n variatii ale intensitatii luminoase. Razele luminoase, trecnd prin doua medii care au indici de

refractie diferiti (aer sticla) si micsoreaza si modifica directia creind un contrast de faza. Microscopul cu cmp ntunecat. La acest tip de microscop, se ntlneste un condensator de tip special, format din oglinzi parabolice care mpiedica razele de lumina sa strabata preparatul histologic, ele intersectndu-se ntr-un punct situat deasupra preparatului, astfel ca acesta ramne neluminat. Sursa de lumina este situata lateral (o lampa cu arc voltaic). Razele extreme, oblice, de la aceasta sursa strabat preparatul si particulele ntlnite n cale apar stralucitoare pe un fond ntunecat. Microscopul cu lumina polarizata este un microscop fotonic, la care se ataseaza doua prisme din spat de Islanda numite nicoli: polarizatorul si analizatorul. Polarizatorul este atasat sub condensator si are rolul de a polariza lumina asupra preparatului. Analizatorul este adaptat la ocular si determina proprietatile optice ale unor structuri din punct de vedere al izo si anizotropiei lor. Microscopul cu fluorescenta se bazeaza pe proprietatea unor substante de a transforma radiatiile ultraviolete n radiatii vizibile, proprietate care poarta numele de fluorescenta. Structurile fluorescente sunt cele care prezinta fluorescenta naturala sau li se ofera aceasta proprietate, prin tratare cu substante fluorescente. Microscopul electronic are o putere de rezolutie de 200.000 300.000 X. Preparatele care urmeaza sa fie studiate sunt interpuse n calea unui fascicul de electroni, produs de un catod aflat la partea superioara a unui tub metalic n care se produce vid. Lentilele sunt nlocuite cu cmpuri electrostatice sau electromagnetice. Imaginea este proiectata pe un ecran fluorescent sau pe o pelicula de film fotografic. Materialul care urmeaza sa fie studiat cu microscopul electronic necesita n prealabil o pregatire speciala. Fixarea preparatelor examinate la microscopul electronic se realizeaza cu fixatori speciali, mai ales cu acid osmic. Sectiunile foarte subtiri (100 - 300) obtinute la microtoame speciale, sunt fixate pe grile metalice si introduse n suporturi speciale si sunt supuse fluxului de electroni. Puterea de rezolutie a M.E. este de 300.000 X sau si mai mult. Unitati de masura 1 m = 100 cm = 1000 mm 1 cm = 100 mm 1 mm = 1000m (micrometri) 1m = 1000 m (milimicroni) 1 nm = 10 (angstroni) 1 = 100 nm (nanometri)

2.METODE DE CERCETARE N CITOHISTOLOGIE Examenul celulelor, tesuturilor si organelor poate fi efectuat: 1. Pe animalul viu, n care caz se poate studia circulatia sanguina (urechea de iepure, membrana interdigitala la broasca) sau miscarile cililor si flagelilor. 2. Pe preparate citohistologice proaspete, respectiv n examinarea ntre lama si lamela a unor fragmente de tesuturi si organe, celule dislocate sau libere n medii naturale. Aceste preparate pot fi colorate cu anumiti coloranti vitali (rosu de Congo, tus de China, albastru de metilen, rosu neutru, verde Janus etc.). Pentru a prelungi durata preparatului histologic proaspat, marginile lamelei se parafineaza. Examinarea preparatului proaspat furnizeaza date limitate, mai putin precise, iar alterarea rapida a structurilor vitale nu permite observatii ndelungate. Se pot examina n stare proaspata: ?sngele: pentru studierea unor modificari de forma ale eritrocitelor sau pentru depistarea unor paraziti intracelulari (hemosporidiile) sau plasmatici (tripanosomele); ?secretii: saliva, suc gastric, suc intestinal, bila , secretii lacrimale si faringoesofagiene, secretii vaginale, lichid spermatic, lichid amniotic, lichid cefalorahidian, lichid ascitic si sinovial etc. ?amprente: din organe extirpate chirurgical sau leziuni cutanate (utilizate mai ales n evidentierea celulelor tumorale). Procedeul de lucru: pe lame de sticla perfect curate si degresate se pune o picatura de snge sau de secretie, eventual se poate dilua cu o picatura de ser fiziologic daca densitatea materialului este prea mare. Deasupra se aplica o lamela. Marginile lamelei se pot parafina pentru a evita uscarea rapida a preparatului. 3.Pe preparate histologice permanente. Acest tip de preparat asigura conservarea pe timp ndelungat (ani de zile) a structurilor histologice care, n acest scop, sunt prelucrate prin tratamente speciale. Obtinerea acestor preparate se realizeaza printr-o succesiune de operatii: recoltarea, fixarea, spalarea, includerea, sectionarea, colorarea si montarea. Recoltarea. Fragmentele de tesuturi sau organe se recolteaza de la animalul viu (biopsie) sau de la animalul mort sau sacrificat (autopsie), cu instrumentar ascutit si curat. Fragmentele de organe recoltate nu trebuie sa depaseasca 2 5 mm grosime si 2 cm suprafata. Probele trebuie sa fie prelevate n cel mai scurt timp de la moartea animalului pentru a evita alterarile morfologice. n timpul recoltarii se evita zdrobirea, uscarea sau tractiunile brutale ale tesuturilor care urmeaza sa fie cercetate. Fragmentele recoltate sunt plasate n borcane cu dop rodat n care se afla solutia de fixare. Se recomanda ca organele moi (ficat, splina, pulmoni etc.) sa fie recoltate prioritar. De asemenea, organele care pot suferi distorsiuni ca: mezenterul,

stomacul, fragmente de intestin, sa fie fixate cu ace sau prin coasere, pe dopuri de pluta sau bucati de carton. Fixarea are ca scop oprirea proceselor vitale din celule si tesuturi ntr-un stadiu ct mai aproape de cel real, mpiedicnd alterarile structurale ulterioare. Agentii fixatori utilizati sunt: fizici si chimici. Fixatorii fizici: - frigul: congelarea (la -2; - 250C). - caldura: uscata la flacara, pentru frotiuri; umeda vapori fierbinti. Fixatorii chimici: - simpli: alcool etilic (800, 960, 1000), formol (5 15%), alcool metilic, acetona, acid acetic, acid picric etc. - compusi: Bouin, Carnoy. Fixatorii compusi au avantajul ca fiind amestecuri de substante fixatoare conserva mai multe structuri morfologice si au un timp mai redus de actiune. Se recomanda prepararea lor n momentul utilizarii. Fixatorul Bouin este obtinut din: 25 ml formol concentrat + 75 ml solutie saturata de acid picric + 5 ml acid acetic glacial. Durata de fixare este 48 ore. Fixatorul Carnoy se obtine din: 60 ml alcool etilic absolut + 30 ml cloroform + 10 ml acid acetic glacial. Durata de fixare este 1-3 ore. Fixatorii chimici actioneaza prin precipitare, coagulare sau oxidoreducere. Durata fixarii depinde de natura tesutului si de tipul fixatorului folosit la fixare (de la 6 ore la 10 zile). Spalarea este operatia prin care se opreste procesul de fixare si se ndeparteaza excesul de fixator. Se realizeaza cu apa de robinet sau apa distilata, alcool, acetona, n functie de fixatorul folosit si metodele ulterioare de prelucrare. Durata spalarii este egala cu aceea a fixarii si se realizeaza n aceleasi vase (borcane cu dop rodat) n care s-a efectuat si fixarea. Includerea este operatiunea prin care fragmentul de tesut sau organ se nglobeaza ntr-o substanta solidificabila si elastica, care sa permita ulterior obtinerea de sectiuni foarte subtiri, de ordinul micronilor. Includerea se poate face n parafina, celoidina sau la gheata (n cercetari histoenzimologice). Cel mai utilizat procedeu l constituie includerea n parafina. Deoarece parafina nu este miscibila cu apa, dupa spalare, fragmentele de organe se deshidrateaza (trecerea prin solutii crescnde de alcool etilic). Sunt utilizate 3 bai de alcool etilic: 800, 960 si 1000, fiecare de aproximativ o ora. nainte de includerea n parafina, piesele se clarifica prin tratare cu benzen, toluen sau xilen, doua bai a cte o ora fiecare, care totodata ndeparteaza alcoolul din fragmentele tisulare. mbibarea pieselor cu parafina se realizeaza n termostat, la temperatura de 560C, n vase de portelan sau cristalizoare mici. Se utilizeaza trei bai de parafina, fiecare cu o durata de 1 ora. Din ultima baie de parafina, fragmentele tisulare sunt trecute n tipare de metal asezate pe o placa de sticla. Peste piese, se toarna parafina topita si se lasa la temperatura camerei pentru solidificare.

Sectionarea este operatia prin care piesa este taiata n felii subtiri, de ordinul micronilor. Aceasta operatie se realizeaza cu instrumente speciale, numite microtoame. Blocul de parafina cu piesa inclusa se fixeaza pe un suport metalic (port piesa), care se introduce ntr-un lacas al microtomului. Sectionarea se realizeaza cu cutite speciale, grosimea sectiunilor potrivindu-se cu ajutorul unei vize. n mod obisnuit se lucreaza cu sectiuni de 4 8 . Prin sectionarea blocului se obtin panglici cu sectiuni, care vor fi preluate cu ajutorul unor pensule fine si puse pe niste cartoane de culoare neagra, pentru a fi vizibile. De aici, cu ajutorul unor lame de barbierit, se vor lua una sau doua sectiuni care vor fi puse pe suprafata unor lame de sticla unse n prealabil un strat subtire de albumina Mayer (obtinuta din albusul de ou vezi tehnici citohistologice). Colorarea sectiunilor se realizeaza cu scopul diferentierii optice a componentelor celulare si tisulare, care necolorate au acelasi indice de refractie. Colorantii utilizati n tehnica histologica pot fi: - naturali: hematoxilina, orceina, safranina (vegetali), carminul (animali); - sintetici: derivati de anilina. Dupa mecanismul de colorare, colorantii se mpart n: - coloranti bazici: au afinitate pentru substraturi cu reactie acida (nucleul), ex. hematoxilina, safranina, albastru de metilen; - coloranti acizi: au afinitate pentru substraturi cu reactie bazica (citoplasma celulelor adulte), ex. eozina, fuxina acida, oranj G etc; - coloranti neutri: evidentiaza structurile neutre, ex. eozinat de albastru de metilen. Coloratiile pot fi: - directe: colorantul se fixeaza pe substrat fara pregatire anterioara; - indirecte: colorantul se fixeaza pe substrat numai daca acesta a fost tratat n prealabil cu un agent chimic (mordant): alaun, acid fosfotungstic; - progresive: actiunea colorantului este stopata prin spalare n momentul colorarii suficiente; - regresive: dupa o supracolorare, excesul de colorant se ndeparteaza cu apa, pna cnd au ramas colorate numai structurile care intereseaza; - simple: se utilizeaza un singur colorant (ex. hematoxilina ferica); - combinate: se utilizeaza doi (H.E.), trei (tricromica) sau mai multi coloranti (policrome ex. Papanicolau); - ortocromatice: structurile se coloreaza identic cu colorantul; - metacromatice: structurile se coloreaza cu o culoare apropiata de cea a colorantului; - panoptice: cu un singur colorant se obtine o varietate de culori si nuante (May Grnwald Giemsa).

Impregnarile metalice n cercetarile de histologie se utilizeaza pentru evidentierea unor structuri si tehnica impregnarii metalice. Aceasta tehnica consta n reducerea si precipitarea unor saruri metalice (argint, aur, osmiu). Metoda este folosita n studiul sistemului nervos si a unor constituienti celulari (complex Golgi, neurofibrile). Mordansarea Anumiti coloranti nu pot actiona asupra substraturilor daca acestea nu au fost tratate anterior cu anumita substanta care face legatura dintre colorant si substrat. Aceste substante se numesc mordanti, ei fiind n general compusi pe baza de aluminiu, fier, molibden, crom sau mercur. Deoarece majoritatea colorantilor sunt folositi n solutii apoase, sectiunile, nainte de a fi trecute n coloranti se deparafineaza (n doua bai de benzen a cte 20 minute fiecare) si se rehidrateaza (prin trecere n solutii crescnde de alcool etilic: 1000, 960, 800 si 70 0, a cte 15 minute fiecare, dupa care se spala bine n apa distilata). Montarea este operatia prin care sectiunile colorate se pot conserva vreme ndelungata ntre lama si lamela. Cel mai utilizat mediu de conservare este balsamul de Canada, o rasina nemiscibila cu apa. Din aceasta cauza, dupa colorare, sectiunile se deshidrateaza (prin solutii de alcool n concentratii crescnde: 700, 800, 960, 1000, 15 minute fiecare baie), apoi se ndeparteaza alcoolul (cu doua bai de benzen, 20 minute fiecare baie). Pe sectiune se pune o picatura de balsam de Canada iar deasupra se aplica o lamela, care se va presa usor pentru ntinderea uniforma a balsamului.. Dupa montare se aplica la capatul lamei de sticla o eticheta, n care se specifica organul, specia de la care provine si metoda de colorare utilizata.