INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE ESTUDIOS CIENTFICOS Y TECNOLGICOS No. 15

DIDORO ANTNEZ ECHEGARAY

INSTRUCTIVO DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE

QUMICA CLNICA
ALUMNO: _________________________________________________________

GRUPO: ____________________

EQUIPO: _____________________

PROFESOR TITULAR:: _________________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: ____________________________________________________________________

______________________________________________________________________

NDICE
PRCTICA CONTENIDO: INTRODUCCIN........................................................................ 1 REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUMICA CLNICA Y PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRCTICA.. VOLUMETRA Y ESPECTROFOTOMETRA EN QUMICA CLNICA CUANTIFICACIN DE GLUCOSA SRICA. CUANTIFICACIN DE UREA SRICA. CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO..... SEMINARIO DE INTEGRACIN I (Practica: 1, 2, 3, 4 y 5) CUANTIFICACIN DE CREATININA SRICA. CUANTIFICACIN DE COLESTEROL SRICO. CUANTIFICACIN DE TRIGLICRIDOS SRICOS.. CUANTIFICACIN DE HIERRO SRICO. CUANTIFICACIN DE BILIRRUBINAS SRICAS.. SEMINARIO DE INTEGRACIN II (Practicas: 7, 8, 9, 10 y 11) CUANTIFICACIN DE PROTENAS TOTALES.. CUANTIFICACIN DE ALBMINA SRICA EXAMEN GENERAL DE ORINA. EXAMEN FISICO Y QUMICO... EXAMEN GENERAL DE ORINA. EXAMEN QUMICO Y MICROSCPICO INTEGRACIN DEL EXAMEN GENERAL DE ORINA SEMINARIO DE INTEGRACIN III (Practicas: 13, 14, 15, 16, 17) BIBLIOGRAFA.. 68 46 50 54 60 26 30 34 37 40 Pgina 4

6 8 12 16 21

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

INTRODUCCIN: El presente instructivo, es un esfuerzo ms que realiza la Academia de Qumica Clnica como apoyo a los alumnos para su preparacin y formacin que se da en los cursos terico- prcticos de Qumica Clnica, el cual deber permitirle enfrentar los retos que encontrar en su vida profesional frente al creciente nmero de tcnicas manuales y automatizadas que continuamente se estn desarrollando para la deteccin y cuantificacin de metabolitos u otros compuestos de inters clnico para la medicina moderna. Adems, cada vez es menor el tiempo que transcurre entre un descubrimiento y su aplicacin. No solamente la comunicacin es ms rpida, sino que las casas comerciales de equipo de laboratorio elaboran muy pronto los aparatos y reactivos necesarios. La funcin del laboratorio de Qumica Clnica es realizar anlisis cualitativos y cuantitativos de lquidos corporales tales como sangre, suero, plasma, lquido cefalorraqudeo y orina. As mismo, las personas responsables de realizar los anlisis debern conocer perfectamente los aspectos tcnicos de los que se realicen, as como el principio del mtodo para que los resultados obtenidos de dicha prueba sean tiles a los mdicos en el diagnstico y tratamiento de la enfermedad. Los anlisis debern realizarse lo ms preciso y exacto posible, para lo cual se requiere de mtodos analticos confiables y una buena instrumentacin. Esto implica el conocimiento de las reacciones qumicas involucradas y el efecto que de las variables fsicas tienen sobre ellas, as como la funcin de cada uno de los reactivos utilizados. Los datos obtenidos en un laboratorio clnico se utilizan para tomar decisiones importantes. Todos los resultados generados van asociados a variaciones que interfieren con la evaluacin e interpretacin de los datos. El responsable de laboratorio debe ser capaz de evaluar esta variacin y determinar su significado para tomar decisiones con base a los datos obtenidos. Esto lleva a la necesidad de enfatizar el Control de Calidad en el trabajo de laboratorio. Por ello en cada una de las tcnicas a realizar los alumnos corrern un suero control junto con el problema, de tal manera que se percaten de la importancia del control de calidad en su trabajo diario.

PRACTICA No. 1

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUMICA CLNICA Y PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRCTICA:
I. COMPETENCIA: Aplica el Reglamento del Laboratorio de Qumica Clnica y los puntos que abarca el reporte de cada prctica durante todo el semestre. II. INTRODUCCIN:

REGLAMENTO DE LABORATORIO DE QUMICA CLNICA:

1. 2. Slo podrn entrar a las prcticas los alumnos que estn inscritos oficialmente. Entrarn al laboratorio con bata blanca de manga larga, bien puesta y perfectamente abotonada; slo podrn quitrsela al salir de ste. 3. Se impartir 1 sesin por semana a cada grupo, tomndose la asistencia al inicio de cada una de ellas y existiendo un margen de tolerancia de 5 minutos despus de la hora sealada para ingresar al laboratorio. 4. Se anotarn las faltas de asistencia con todo rigor y por ningn motivo se pondrn retardos despus de la tolerancia, ni se justificarn las faltas. 5. Las faltas al laboratorio se calificarn con cero, ya que si no se realiza una prctica, no se puede evaluar. 6. Colocar todos sus objetos personales en los anaqueles. Dejar fuera exclusivamente el material que se va a utilizar. 7. Queda estrictamente prohibido el uso de aparatos electrnicos durante el trabajo en el laboratorio (MP3, MP4, Ipod, Ipad, audfonos, telfonos celulares, entre otros); la primera vez que se le encuentre un aparato de ste tipo ser notificado verbalmente, la segunda ocasin se le retendr por el tiempo que dure la prctica y a la tercera, se le retendr por el resto del semestre escolar. Los telfonos celulares slo podrn utilizarlos en modo vibrador y en caso de recibir alguna llamada de urgencia, debern pedir permiso a los profesores para salir del laboratorio a responderla. Podrn utilizar la cmara del telfono nicamente para tomar fotografas de sus evidencias de trabajo en el laboratorio. 8. A aquellos estudiantes que vistan estrafalariamente, a la moda punk, dark o emo (pantaln corto, bermudas, cabello pintado, zapatos abiertos tipo huarache, con perforaciones o piercings, etc.) no se les permitir la entrada al laboratorio ni al saln de clase. 9. Cada alumno deber trabajar durante todo el curso en el equipo y mesa de trabajo que se le asigne al inicio del mismo, salvo que los profesores lo cambien. 10. Es obligacin de los alumnos guardar orden, disciplina y atencin durante la estancia en el laboratorio para prevenir accidentes y daos al equipo; quienes no cumplan con esta disposicin, tendrn que abandonarlo, anulndose la prctica que estn realizando. 11. Para evitar retraso durante el desarrollo de la prctica, el alumno deber estudiarla cuidadosamente antes de entrar al laboratorio y preparar

12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

adecuadamente su material didctico a exponer. Procediendo de sta manera, podr el alumno preguntar a los profesores todas sus dudas, as como preparar el material necesario para cada una de las prcticas con la debida anticipacin. Los alumnos que no cumplan con lo anterior no tendrn derecho a la evaluacin respectiva, pudiendo permanecer en el laboratorio y desarrollar la prctica. Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio. La basura deber separarse y depositarse en los botes colocados debajo de cada mesa y no en las tarjas cnicas de las mismas. Los RPBI debern separarse y depositarse en las bolsas rojas colocadas dentro del contenedor rojo. Las agujas debern depositarse en el contenedor de punzocortantes de color rojo, mientras que su capuchn en la basura comn. El material que se utilice en la prctica deber quedar en el lugar que se indique y perfectamente limpio y seco. Si se abandona el laboratorio sin autorizacin de algn profesor, aunque la prctica se haya terminado, se considerar como falta. Cuando todo el grupo deje de asistir a alguna prctica y no existe causa justificada oficialmente, sta se dar por vista y podr ser tema de cualquier examen. El material que se deteriore, rompa o extrave, se deber reponer en 15 das como mximo o se suspendern a los alumnos causantes. El alumno que al finalizar las prcticas adeude material no tendr derecho a presentar el examen final. Colocar los bancos sobre la mesa al terminar la sesin. Para tener derecho a presentar el examen ordinario C ser requisito indispensable tener mnimo el 80% de asistencias y prcticas realizadas, si se tiene del 70 al 80% deber presentar un examen extraordinario de todo el curso, si se tiene del 50 al 70% no tendr derecho a presentar en examen ordinario C y deber presentar ETS. Adems, tambin deber entregar en cada examen su carpeta de evidencias.

PUNTOS QUE COMPRENDE EL REPORTE DE CADA PRCTICA:

1. 2. 3. 4. NMERO Y TTULO DE LA PRCTICA. COMPETENCIA. PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO UTILIZADO. ESPECIFICACIONES DE DESEMPEO (POR EJEMPLO: LINEALIDAD, PRECISIN, EXACTITUD EXPRESADA COMO INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIN, LMITE DE DETECCIN, INTERVALO DE MEDICIN, VERACIDAD DE LA MEDICIN, SENSIBILIDAD ANALTICA Y ESPECIFICIDAD ANALTICA). 5. SISTEMA DE MUESTRA PRIMARIA (POR EJEMPLO: SUERO, PLASMA, ORINA). 6. TIPO DE CONTENEDOR Y ADITIVOS. 7. EQUIPO Y REACTIVOS REQUERIDOS. 8. INTERFERENCIAS (POR EJEMPLO: LIPEMIA, HEMLISIS, BILIRRUBINEMIA) Y REACCIONES CRUZADAS. 9. INTERVALOS BIOLGICOS DE REFERENCIA. 10. INTERPRETACIN POR EL LABORATORIO.

11. CUESTIONARIO
Tomado de: ISO-15189:2003 NMC-EC-15189-IMNC-2006.

PRACTICA No. 2

VOLUMETRA Y ESPECTROFOTOMETRA EN QUMICA CLNICA

I. COMPETENCIA.

Realiza diluciones 1:2 a partir de una solucin estndar y, por medio de ellas construye una curva tipo, identificando la clasificacin de los diferentes mtodos espectrofotomtricos. II. INTRODUCCIN. La base de la colorimetra y la espectrofotometra es que muchas sustancias tienen color propio o pueden dar lugar a productos finales coloreados en ciertas reacciones qumicas. Hay una relacin entre la intensidad de ste color y la concentracin de uno o varios de los reactivos o productos; de esta manera, la intensidad del color puede utilizarse para medir la concentracin de reactivos o productos. Existen muchos instrumentos para la medicin del color; pero antes de hablar de su funcionamiento y manejo, es necesario conocer las leyes fsicas sobre las cuales se basan, as mismo es conveniente tener presente algunos conceptos empleados en este tema. LUZ: Es una variedad de energa radiante que forma parte del espectro electromagntico la cual tiene una velocidad de aproximadamente 3 x 1010 cm/seg. SOLUCIONES COLOREADAS: Algunas soluciones tienen color, por que absorben la luz de cierta longitud de onda y dejan pasar las de otras longitudes de onda. Las soluciones que no absorben la luz visible, vindose incoloras, pueden absorber en el infrarrojo o el ultravioleta. LEY DE LAMBERT Y BEER: La ley de Beer relaciona la cantidad de luz absorbida con la concentracin del componente coloreado y dice lo siguiente: cuando en una solucin diluida se hace incidir un rayo de luz monocromtica, la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la cantidad de molcula presentes en la solucin; e inversamente proporcional ser la cantidad de la luz transmitida. SOLUCIN: Es una mezcla homognea de dos o ms componentes, uno llamado soluto y otro llamado disolvente, en la cual el primero se encuentra en menor proporcin con respecto al segundo. SOLUCIN ESTNDAR O PATRN: Es aquella solucin en la cual se le conoce exactamente su concentracin. CONCENTRACIN: Es la cantidad de soluto por unidad de disolvente que contiene una solucin. DILUCIN: Es el proceso de aadir disolvente a una solucin para hacer menos densa o concentrada.

BLANCO DE REACTIVOS O BLANCO: Es aquella solucin que se trabaja en la misma forma que el problema y bajo las mismas condiciones, pero que en lugar de contener muestra problema generalmente se le adiciona agua destilada o nicamente los reactivos. TESTIGO: Es una solucin usada como calibrador en la que la concentracin de analito* ha sido establecida por mtodos analticos de confiabilidad conocida. SERIE TIPO: Es un conjunto de soluciones estndar o patrn. Se puede preparar haciendo diluciones a partir de un patrn primario. CURVA DE CALIBRACIN: Es una sucesin de puntos en un papel milimtrico en donde lo que se grafica es la relacin que existe entre la concentracin de una serie tipo de un determinado analito y su respectiva absorbancia o transmitancia, y sirve para poder conocer la concentracin de un problema especfico. ANALITO: Es el componente del metabolismo en el momento de ser medido o analizado.

CLASIFICACIN DE MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS:

I. POR LA CINTICA DE REACCIN (TIEMPO): 1. DE PUNTO FINAL.- Se lee la absorbancia al trmino de la reaccin (formacin de color). 2. CINTICOS.- Se mide la diferencia de absorbancias por minuto: CONTINUOS.- Se leen los valores inmediatamente despus de adicionarle el suero. DISCONTINUOS.- Se leen los valores 5 10 minutos despus de adicionarle el suero, esto con la finalidad de que se incube la mezcla para que se lleve a cabo una inhibicin inmunoqumica (Ag-Ac). II. POR LA FOTOMETRA (COLOR): 1. VISIBLES.- Se leen utilizando una longitud de onda de 380 a 680 nm. 2. UVCERCANO.- Se leen utilizando una longitud de onda de 290 a 380 nm. 3. UV PURO.- Se leen utilizando una longitud de onda de 260 a 290 nm. III. FUNDAMENTO:

La curva tipo o de calibracin est basada en la Ley de Lambert-Beer-Bouger, la cual dice que la absorbancia (A) = abc, donde a = absorcin especfica, b = longitud del trayecto luminoso, y c = concentracin del componente coloreado. IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS.

MATERIAL DE VIDRIO: 6 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm. 4 frascos reactivos color mbar de 250 mL. 1 vaso de precipitados de 250 mL. 2 pipetas serolgica de 5.0 mL.

 2 Matraces aforados de 1000 mL. 5 celdillas o cubetas UTENSILIOS: Gradilla metlica Franela Papel parafilm Marcador de tinta indeleble Bulbo de hule Esptula Escobilln chico y grande Tela suave o gasa. APARATOS: Espectrofotmetro Balanza granataria Balanza analtica REACTIVOS: Sulfato de cobre al 5%. V. DESARROLLO:

1. Marcar 5 tubos de ensayo de 16 X 150 mm. del 1 al 5, enseguida: 2. Aadir al primer tubo 10.0 mL. de sulfato de cobre al 5% la cual se tomar como la solucin 1:1 con una concentracin de 5 g/100 mL. 3. A partir de la solucin anterior, realizar cuatro diluciones; para la dilucin 1:2 tomar 5.0 mL. de solucin 1:1 ms 5.0 mL. de agua destilada, la cual tendr una concentracin de 2.5 g/100 mL. 4. De la dilucin 1:2 tomar 5.0 mL. y colocarlos en otro tubo, ms 5.0 mL. de agua destilada, obtenindose una dilucin 1:4 con una concentracin de 1.25 g/100 mL., se hace lo mismo con esta dilucin para obtener otra nueva de 1:8 con una concentracin de 0.625 g/100 mL. y finalmente otra de 1:16 con una concentracin de 0.312 g/100 mL. de sulfato de cobre. 5. Leer las absorbancias de cada tubo, as como la solucin problema proporcionada aparte y en otro tubo, a una longitud de onda de 700 nm, ajustado a cero con agua destilada. 6. Realizar una curva de calibracin con las lecturas obtenidas y concentraciones correspondientes a cada una. REPORTE DE LA PRCTICA: A. Elaborar un cuadro de datos con las concentraciones de cada solucin tipo y sus respectivas lecturas obtenidas.

B. Con los datos anteriores, construir la curva tipo en papel milimtrico con el cuadro de datos, colocando la concentracin de cada solucin tipo en el eje de las abscisas, y la absorbancia obtenida para cada una de ellas en el eje de las ordenadas. C. Interpolar en la curva tipo la absorbancia obtenida para la solucin problema y obtener la concentracin de sta. D. Calcular la concentracin del problema por medio del mtodo analtico. E. Establecer una comparacin de los resultados obtenidos por ambos mtodos. VI. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Menciona si la grfica obtenida cumple con la ley de Beer, y por qu? Anota las limitaciones de sta ley. Enuncia los conceptos de absorbancia y transmitancia. Explica dos mtodos para poder calcular la concentracin de un determinado analito en donde se utilicen la absorbancia o densidad ptica. 5. Esquematiza el proceso de lectura interno de un espectrofotmetro. 6. Explica dos mtodos matemticos para corregir las grficas obtenidas.

PRACTICA No. 3

CUANTIFICACIN DE GLUCOSA SRICA

MTODO ENZIMTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE LA GLUCOSA-OXIDASA (GOD-POD) DE TRINDER I. COMPETENCIA. Determina cuantitativamente la concentracin de glucosa en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. La glucosa es el azcar principal de la sangre que sirve a los tejidos como el principal combustible metablico. Es un compuesto orgnico conocido qumicamente como glcido o azcar, pues est constituido por los elementos C, H y O. Qumicamente es un derivado aldehdico de polialcohol cuya frmula mnima o condensada es C6H12O6. La glucosa es el carbohidrato o azcar ms importante de la qumica mdica ya que es la unidad constituyente del almidn, de la celulosa y el glucgeno las cuales son los principales materiales de reserva energtica. Los monosacridos, glucosa, y galactosa, productos finales de la digestin de carbohidratos en el tubo digestivo, son absorbidos por la mucosa del duodeno y de la primera parte del intestino delgado. Una vez absorbidos, los monosacridos circulan en el plasma en solucin simple despus de su absorcin, la glucosa circulante es captada principalmente por el hgado. Pero tambin por los msculos y otros tejidos, donde se almacenan en forma de glucgeno mediante una serie de reacciones denominadas glucognesis, en las que se consume energa. Tambin pueden ser transportados hasta las clulas que necesitan energa en ese momento, penetrando en su interior; aqu tras un proceso laborioso, conocido como gluclisis, que puede tener lugar en condiciones aerobias o anaerobias, la clula consigue energa para sus procesos metablicos. Cuando el organismo necesita glucosa, recurre al glucgeno, que acta como reserva y puede producir glucosa mediante un proceso conocido como glucogenolisis, influido por dos hormonas; glucagon en el hgado, y adrenalina en el msculo. As mismo cuando la necesidad de glucosa es muy grande, bien porque no puede utilizarse la glucosa existente en el torrente circulatorio, o bien porque no existen reservas, puede formarse glucosa en la propia clula a partir de fuentes alternativas, como el lactato, los aminocidos, el glicerol, los cidos grasos y los cuerpos cetnicos, mediante un proceso conocido como neoglucognesis o gluconeognesis, que tiene lugar en las clulas hepticas, adiposas y musculares. De esta forma es como se mantienen los niveles sanguneos de glucosa que son necesarios para las clulas.

10

III.

FUNDAMENTO.

La glucosa es oxidada por la enzima Glucosa Oxidasa (GOD) en solucin acuosa a cido glucnico y perxido de hidrogeno. El Perxido de Hidrgeno formado reacciona con fenol y 4-aminofenazona en presencia de la enzima Peroxidasa (POD) dando un cromgeno de color rosa - rojizo de Quinonimina, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de glucosa presente en la muestra.

GOD
Glucosa + O2 + H2O Ac. Glucnico + H2 O2

POD
H2 O2 + 4 aminofenazona + fenol
(ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES)

Quinonimina
(CROMGENO ROSA-ROJIZO)

2H20

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS. MATERIAL DE VIDRIO: 5 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm. 1 Pipeta Pasteur con bulbo 1 Vaso de precipitados de 250 mL. 1 Termmetro de 10 C. a +110 C. 3 Celdillas, o fotoceldas UTENSILIOS: Gradilla metlica Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Marcador de tinta indeleble Escobilln chico y grande Bulbo de hule EQUIPO: Centrfuga elctrica Bao mara Espectrofotmetro Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000 y 10 L.

11

MATERIAL BIOLGICO: Suero o plasma, obtenidos dentro de los 30 minutos despus de haber extrado la sangre. REACTIVOS: KIT PARA GLUCOSA, MTODO ENZIMATICO DE TRINDER marca SPINREACT. No. 1 Reactivo de color - enzimas (Glucosa Oxidasa, Peroxidasa, 4 aminofenazona, Fenolato de sodio, Buffer de fosfatos y Excipientes y estabilizadores de pH 7.0 +- 0.2) No. 2 Solucin patrn de glucosa (100 mg/dL 5.56 mmol/L). Los reactivos estn listos para usarse. Bien cerrados y conservados en refrigeracin, entre + 2 C. y + 8 C. son estables hasta la fecha de caducidad sealada en el envase. Una vez abierto son estables durante 30 das, conservados a la temperatura anterior o 7 das a temperatura ambiente (15 - 25C) protegidos de la luz. Precauciones: Para uso de diagnstico in vitro. El reactivo contiene azida de sodio como conservador la cual puede reaccionar con el cobre o plomo de las tuberas formando azidas metlicas explosivas. Para desecharlo enjuague con mucho agua para prevenir su formacin. NOTA: Para prevenir la contaminacin del reactivo de glucosa coloque un volumen ligeramente mayor al que va a utilizar en un contenedor separado y no regrese el remanente al frasco original. V. PROCEDIMIENTO. Tcnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Tomar 3 tubos de ensayo de 13 X 100 mm y marcarlos como: B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida pipetear: REACTIVOS BLANCO MUESTRA PATRN R. de trabajo Suero Patrn de 100 mg/dL 1.0 mL ______ ______ 1.0 mL 10 L ______ 1.0 mL ______ 10 L

2. Mezclar bien e incubar a 37 C. en bao mara durante 10 minutos o a temperatura ambiente durante 30 minutos (15 - 25C). 3. Leer las absorbancias de la muestra y el patrn a 505 nm. con filtro verde, ajustando a cero con el blanco de reactivos. El color es estable durante 60 minutos. NOTA: El volumen se puede incrementar si el aparato requiere volmenes mayores que 1 mL. CLCULOS: Glucosa (mg/100mL) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn
12

X [Patrn]

Como la reaccin colorida sigue la Ley de Lambert y Beer, puede ser usado el factor para calcular los resultados, de acuerdo a la siguiente frmula: FACTOR (F) = Concentracin del Patrn Absorbancia del Patrn Glucosa (mg/100 mL) = Absorbancia de la Muestra X FACTOR (F) Para obtener la concentracin de glucosa en mmol/L se multiplica por el factor de conversin, que es de 0.0555 0.0556 CIFRAS DE REFERENCIA: Suero o plasma: 60 a 110 mg/dL (3.33 - 6.10 mmol/L) REPORTE DEL ALUMNO: A) B) C) D) E) F) G) H) Datos obtenidos Frmulas Clculos Resultados (con sus unidades correspondientes) Discusin o anlisis de resultados Conclusiones Cuestionario Bibliografa

VI. CUESTIONARIO. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Menciona 5 sntomas que presenta una persona diabtica. Menciona el tiempo de estabilidad que tiene una muestra antes de separarla y despus de separarla, para realizar la prueba. Explica el significado de una glucosa preprandial y una glucosa postprandial. Menciona otros exmenes de laboratorio tiles en el diagnstico de la diabetes. Indica por qu la determinacin de la glucosa en sangre se realiza en ayunas. Que recomendaciones daras a un paciente con una glucosa por arriba de las cifras de referencia.

13

PRACTICA No. 4

CUANTIFICACIN DE UREA SRICA

MTODO QUMICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE O-FTALALDEHDO Y METODO UV CINTICO DE SAMPSON I. COMPETENCIA. Determina cuantitativamente la concentracin de urea en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. SUSTANCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS. Existen en el suero aproximadamente unas quince sustancias nitrogenadas no proteicas (NNP) con importancia desde el punto de vista clnico, pero solo seis de ellas se determinan rutinariamente en los laboratorios de qumica clnica. Esta fraccin NNP consta de nitrgeno no ureico, el cual constituye aproximadamente el 45% del total, seguido, en orden de importancia cuantitativa, por los aminocidos, el, cido rico, la creatinina, la creatina y el amonio. UREA. La mayora de las investigaciones iniciales destinadas a la cuantificacin de la urea fueron realizadas por autores interesados en el problema de blanco nitrogenado. Esta es la razn por la que, especialmente en los pases anglosajones, ha quedado la costumbre de expresar los valores de urea como nitrgeno ureico en sangre (BUN). Bioqumica: La urea, el principal producto final del metabolismo de las protenas en el hombre, se forma principalmente a partir de los grupos amino de los aminocidos. El hgado es probablemente el rgano ms importante en la sntesis de la urea a travs del ciclo de la ornitina. MTODOS: Los mtodos para la determinacin de la urea pueden clasificarse en tres grupos: 1. Directos: condensacin de la urea con diacetilo para formar un cromgeno mensurable. 2. Indirectos: determinacin del amonio resultante de la accin de la ureasa sobre la urea. 3. Diversos: Entre ellos existen mltiples procedimientos que recurren a diversos principios analticos, fotomtricos o fsicos. El mtodo directo, que utiliza la diacetilmonoxima tiene una ventaja importante: no mide el NH4. Fue Fearou el primero en demostrar que la urea y otros compuestos que tenan una estructura R-NH-CO-NH-R (donde R es un H o bien un radical aliftico nico, y R no es un radical acclico) reacciona con la diacetilmonoxima en presencia de un cido fuerte y de un agente oxidante, produciendo un cromgeno. Ormsby aplic la

14

reaccin anterior a la medicin de urea en soluciones desproteinizadas obtenidas a partir de sangre y orina. Con el objetivo de intensificar el color y minimizar su fotosensibilidad se han agregado al reactivo las siguientes sustancias: cido fenilantranlico, tiosemicarbazona o glucuronolactona. Las tcnicas indirectas recurren a la enzima ureasa para descomponer la urea segn la siguiente reaccin:

UREASA
H2N-CO-NH2 + H2O + 2H+4 2NH4+ + CO2

Despus de este proceso se cuantifica, bien el amonio o bien el CO2 liberados del carbonato amnico. III. FUNDAMENTO (LAB. LICON) La urea es hidrolizada en presencia de agua y de la enzima Ureasa para producir amoniaco y bixido de carbono. El amoniaco formado, se combina con el alfacetoglutarato (-KG) y con el Dinucletido de Adenina Nicotidamina reducido (NADH + H+), en presencia de la enzima Glutamato Deshidrogenasa (GDLH), para producir L-Glutamato ms NAD+. El adenosn difosfato (ADP), se incluye como un activador y estabilizador del GLDH. La reaccin es evaluada, midiendo la disminucin de la absorbancia a 340 nm, al convertirse el NADH en NAD+.

UREASA
Urea + H2O 2NH4 + + 2HO3

GLDH
NH3 + -KG + NADH + H+ FUNDAMENTO (LAB. SPINREACT) La urea presente el suero es hidrolizada por el ortoftalaldehdo en medio cido para formar un complejo colorido de color amarillo, cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra. H+ Urea + o-Ftalaldehdo Isoindolina
(CROMGENO DE COLOR AMARILLO PAJA)

L-Glutamato + NAD+ + H2O

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS MATERIAL: 3 Tubos de 13 x 100 mm. 1 Pipeta Pasteur con bulbo

15

 2 Frascos color mbar de 250 mL. 1 Termmetro de 10 C a +110 C 3 Celdillas o fotoceldas 1 Vaso de precipitados de 500 mL. UTENSILIOS: Franela Gradilla metlica Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Parafilm Marcador de tinta indeleble Aplicadores de madera Bulbo de hule EQUIPO: Bao Mara Parrilla elctrica Centrfuga elctrica Espectrofotmetro. Pipetas semiautomticas de 1000 y 25 L. Refrigerador Cronmetro REACTIVOS (LAB. SPINREACT) Reactivo de trabajo 1. O Ftalaldehdo Reactivo de trabajo 2. Solucin borato Estndar de Urea de 50 mg/dL REACTIVOS (LAB. LICON) Reactivo de trabajo 1. Regulador de BUN Reactivo de trabajo 2. Enzima BUN Estndar de urea de 30 mg/dL PREPARACIN DEL REACTIVO DE USO: El reactivo de los laboratorios SPINREACT se encuentra listo para ser usado. Estable a temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad. El reactivo de trabajo de los laboratorios LICON, se prepara agregando 5 partes del reactivo 1 por una parte del reactivo 2 a temperatura ambiente.

16

V. PROCEDIMIENTO: Tcnica: Laboratorios LICON. 1. Marcar tres tubos de ensayo como: M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar REACTIVOS MUESTRA PATRN

Reactivo de trabajo 1.0 mL. 1.0 mL. Suero 10 L Patrn _____ 10 L 2. Despus de aadir la muestra (suero), mezclar y poner en marcha el cronmetro para leer las absorbancias a los 30 (As 1) y 60 (As 2) segundos a 340 nm, ajustando a cero con agua destilada, mientras se mantiene constante la temperatura a 37C. 3. En caso de que la segunda lectura sea la misma que la primera, realizar una tercera lectura. CLCULOS (LAB. LICON). Urea (mg /dL.) = Absorbancia/minuto de la muestra X [ Patrn ] Absorbancia/minuto del Patrn Donde: Absorbancia/minuto = Absorbancia 2 - Absorbancia 1 A1 = Absorbancia inicial A2 = Absorbancia final VALORES DE REFERENCIA: Suero: Urea: 17 a 49 mg. /dL. (2.8 - 8.0 mmol/L) Nitrgeno Ureico (BUN): 8 - 23 mg/dL Orina: Urea: 1.5 -3.4 mg/dL (0.25-0.57 mmol/L) Nitrgeno Ureico: 7 -16 g/24 h. Factor de conversin de mg/dL de Urea a BUN mmol/L = 2.14 Factor de conversin de mmol de Urea a mg/dL de Urea = 0.167 PROCEDIMIENTO: Tcnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Marcar tres tubos de ensayo como: B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar:

17

REACTIVOS Reactivo de trabajo 1 Suero Patrn de 50 mg/dL

BLANCO 1.0 mL _____ _____

MUESTRA 1.0 mL 25 L _____

PATRN 1.0 mL _____ 25 L

Mezclar e incubar 1 minuto a 37C y en seguida agregar: Reactivo de trabajo 2 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

2. Mezclar e incubar 15 minutos en bao mara a 37C. 3. Leer a 510 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. CLCULOS: Urea (mg/100 mL) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn VALORES DE REFERENCIA: Suero: 15 a 45 mg/dL (249 a 7.49 mmol/L) Orina: 20 a 35 g/24 horas INFORME DEL ALUMNO: A) B) C) D) E) F) G) H) Anotacin de datos Frmulas Clculos Resultados (con sus unidades correspondientes) Anlisis o discusin de resultados Conclusiones Cuestionario Bibliografa X [Patrn]

VI. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Qu es la urea? Cul es la funcin de la urea en el organismo? Describa la sntesis de la urea en el organismo. Enliste las anormalidades que pueden presentarse en el organismo que ocasionan aumento o disminucin de la urea. Menciona otras pruebas de laboratorio que se realizan para el diagnstico de padecimientos renales.

18

PRACTICA No 5

CUANTIFICACIN DE CIDO RICO SRICO

MTODO ENZIMTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE TRINDER MODIFICADO POR TRIVEDI Y KABASAKALIAN I. COMPETENCIA: Determina cuantitativamente la concentracin de cido rico en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. DEGRADACIN DE LAS PURINAS. En los animales superiores los nucletidos resultantes de la degradacin de las nucleoprotenas, experimentan generalmente su hidrlisis enzimtica hasta rendir finalmente las bases pricas y pirimdicas libres. Si no son recuperadas y reutilizadas, las bases libres son ulteriormente degradadas y sus productos finales excretados. En algunos vertebrados, incluidos los primates, el perro dlmata, las aves y algunos reptiles, el producto final de la degradacin de las purinas es el cido rico. La degradacin de las purinas a cido rico, producto metablico final en el hombre, ha sido objeto de intensos estudios. Las purinas principales, adenina y guanina, se convierten primero en xantina, la cual es entonces oxidada a cido rico por la compleja flavoprotena xantina oxidasa: XANTINA Xantina + H2O + O2 OXIDASA El cido rico se encuentra en la sangre, principalmente en forma de urato monosdico; tanto el cido libre como sus sales (los uratos) son relativamente insolubles en agua, lo cual provoca en algunos individuos que el cido rico se precipite y cristalice en la orina formando clculos renales y lesionando al rin. En los tejidos cartilaginosos pueden formarse tambin depsitos de cido rico provocando la enfermedad denominada gota, la cual se produce al parecer, por una superproduccin de cido rico. Esta enfermedad puede aliviarse por tratamiento con el frmaco llamado Alopurinol, que es un anlogo de la hipoxantina. El alopurinol inhibe a la xantinaoxidasa y as disminuir la formacin de cido rico. METODOLOGA: CIDO RICO Las investigaciones efectuadas sobre la metodologa de la determinacin de cido rico se han encaminado fundamentalmente a mejorar la especificacin de las tcnicas. En principio hay tres tipos de procedimientos para la separacin preliminar de CIDO RICO + O2

19

del cido rico de otras sustancias capaces de interferir en su determinacin, presentes en el suero: 1. Separacin en forma de sal de plata, de magnesio, de amonio, cuprosa o cprica. 2. Separacin mediante tcnicas de intercambio inico y 3. Precipitacin de las protenas y anlisis de los filtrados. Resultan, sin duda, ms convenientes los mtodos en los que nicamente es necesario eliminar las protenas antes de pasar al desarrollo de la reaccin coloreada. Los precipitantes proteicos ms adecuados para estos fines, son el cido tngstico, el cido tricloroactico o el cido fosfotngstico,. Una vez que se han separado las protenas, por uno u otro procedimiento, se analiza la concentracin de cido rico en el filtrado mediante alguno de los mtodos publicados a base de fosfotungstato. La mayora de los procedimientos fotomtricos se basan en la reduccin del fosfotungstato, que se lleva a cabo con el cido rico en medio alcalino, dando lugar a la formacin de un cromgeno azul, llamado azul de tungsteno. Hace ya tiempo que se recurre a la URICASA para aumentar la especificidad del mtodo, aprovechando que esta enzima oxida el cido rico a alantona, la cual a diferencia del cido rico no absorbe la luz en la zona 290-293nm. III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS SPINREACT) El cido rico presente en el suero es oxidado en presencia de la enzima URICASA para formar alantoina y perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno formado reacciona con la 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) en presencia de la enzima PEROXIDASA (POD) para formar un cromgeno de Quinoneimina de color rosa-rojizo, cuya intensidad es directamente proporcional a la concentracin de cido rico presente en la muestra.

URICASA
cido rico + 2H2O + O2 Alantoina + CO2 + 2H2O2

POD
2H2O2 + 4 AF + DCPS Quinoneimina
(CROMGENO ROSA-ROJIZO)

(ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES)

4H2O

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUPO Y REACTIVOS. MATERIAL DE VIDRIO: 5 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. 1Pipeta Pasteur con bulbo 1Vasos de precipitados de 250 mL. 3 Celdillas o fotoceldas

20

 1 Frasco reactivo color mbar de 250 mL. 1 termmetro de + 110 C. a-10 C. UTENSILIOS: Gradilla metlica Adaptador para vacutainer Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Marcador de tinta Indeleble Bulbo de hule Escobilln chico y grande EQUIPO: Centrfuga elctrica Espectrofotmetro Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000, 20 y 25 L. MATERIAL BIOLOGICO: Suero, orina, lquido amnitico o lquido sinovial. El cido rico srico es estable durante tres das a temperatura de 4 C. y seis meses cuando el suero se congela. No usar plasma para la determinacin porque se pueden obtener resultados falsamente disminuidos. REACTIVOS. Reactivo 1. (Tampn). Reactivo 2 (Enzimas) Estndar primario de cido rico de 6.0 mg/dL (0.36 mmol/L) El reactivo de trabajo se prepara disolviendo el contenido de un vial de R2 (enzimas) en un frasco de R1 (tampn). Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido y es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. Un mes en refrigeracin (2-8C) o 10 das a temperatura ambiente. NOTA: No ingerir, evitar el contacto con la piel y ojos, si esto sucede lavar con abundante agua. El reactivo contiene azida de sodio (0.05%) el cual puede reaccionar con el cobre o plomo de la tubera, agregar abundante agua al desechar.

21

V. PROCEDIMIENTO. Tcnica: Laboratorios SPINREACT. 1. El reactivo de trabajo y las muestras debern estar a temperatura ambiente al momento de realizar la prueba. 2. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar: REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Suero ______ 25 L ______ Patrn de 6 mg/dL ______ 25 L 3. Mezclar e incubar en bao mara a 37C durante 5 minutos o 10 minutos a temperatura ambiente (15 25C). 4. Leer las absorbancias a 520 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. CLCULOS: cido rico (mg/dL) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn X [ Patrn ]

Como el sistema colorimtrico sigue estrictamente la Ley de Beer, tambin puede usarse al mtodo del factor para el clculo de los resultados: 6.0 FACTOR DE CALIBRACIN (F) = Absorbancia del patrn cido rico (mg/dL) = Absorbancia de la Muestra X FACTOR (F) El color desarrollado es estable durante 30 minutos. CIFRAS DE REFERENCIA: Suero: Hombres: 3.6 7.7 mg/dL (0.21 0.44 mmol/L) o (214 a 458 mol/L) Mujeres: 2.5 6.8 mg/dL (0.15 0.40 mmol/L) o (149 a 405 mol/L) Nios: 2.0 5.5 mg/dL (0.12 0.33 mmol/L) o (200 a 550 mol/L) Orina: Adultos: 250 a 750mg/dL /24 horas (14.9 44.6 mmol/L/24 horas) Factor de conversin de mg/dL a mol/L = 59.5 PROCEDIMIENTO: Tcnica: Laboratorios LICON. 1. El reactivo de trabajo y las muestras debern estar a temperatura ambiente al momento de realizar la prueba.

22

2. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar: REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Suero ______ 20 L ______ Patrn de 8 mg/dL ______ _____ 20 L 3. Mezclar e incubar en bao mara a 37C durante 5 minutos o 15 minutos a temperatura ambiente (15 25C). 4. Leer las absorbancias antes de 15 minutos a 520 nm ajustando a cero con el blanco de reactivos. 5. El volumen puede ser incrementado si el instrumento requiere volmenes mayores a 1 mL. (2 mL de reactivo de trabajo por 0.05 mL de muestra o patrn). CLCULOS: cido rico (mg/dL) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn CIFRAS DE REFERENCIA: Suero: Hombres: 3.4 7.0 mg/dL (0.19 0.40 mmol/L) Mujeres: 2.4 5.7 mg/dL (0.14 0.33 mmol/L) Orina: 0.5 a 1.0 g/24 horas (va a depender del contenido de purinas en la dieta). INFORME DEL ALUMNO: A. B. C. D. E. F. G. H. Datos Frmulas Clculos Resultados (con sus unidades correspondientes) Anlisis o discusin de resultados Conclusiones Cuestionario Bibliografa X [ Patrn ]

VI. CUESTIONARIO: 1. Cmo se le llama a la elevacin de cido rico en sangre? 2. Mencione tres factores que influyen en la concentracin del cido rico en el organismo. 3. Cita algunos casos en los cuales se ven alterados los valores normales de cido rico en sangre. 4. En qu consiste la enfermedad denominada gota?

23

PRACTICA No. 7

CUANTIFICACIN DE CREATININA SRICA

MTODO VISIBLE CINTICO DE PUNTO FINAL DE BONSNES Y TAUSSKY (REACCIN DE JAFF) I. COMPETENCIA. Determina cuantitativamente la concentracin de creatinina en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. La Creatinina es el producto final del catabolismo de la creatina y se puede definir como el anhdrido de la creatina, ya que se forma cuando la creatina pierde una molcula de agua. La creatina es una sustancia nitrogenada que se encuentra casi exclusivamente en el msculo (98%), tambin en encfalo y sangre, y slo trazas de ella en orina. Desempea un papel esencial en la contraccin muscular, y se excreta bajo la forma de su anhdrido, la creatinina. La fosfocreatina existe en grandes concentraciones especialmente en el msculo, donde es una forma importante de depsito de fosfato de alta energa y se puede almacenar en cartlago. En los hombres adultos, la orina slo presenta creatinina; pero en las mujeres adultas, embarazadas o en el puerperio y en los nios de ambos sexos, se encuentra normalmente cierta cantidad de creatina en la orina. La creatina slo aparece en la orina del hombre adulto en las enfermedades que se acompaan de destruccin muscular. La formacin de creatinina puede presentar un paso previo necesario para la excrecin de creatina; puesto que la creatina no es reabsorbida por los tbulos renales despus de haber sido filtrada. III. FUNDAMENTO. La creatinina presente en el plasma reacciona con el picrato alcalino (formado por cido pcrico e hidrxido de sodio) a temperatura ambiente, formando un complejo de color amarillo-rojizo (reaccin de Jaff) de Picrato de creatinina, la intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de creatinina presente en la muestra.

Creatinina srica + Picrato alcalino (cido pcrico + NaOH)

Picrato de creatinina
(CROMGENO AMARILLOROJIZO)

24

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS. MATERIAL: 3 Tubos de hemlisis de 13 x 100 mm. 1 Pipeta Pasteur con bulbo 1 Vaso de precipitados de 250 mL. 3 Celdillas o fotoceldas. 2 Frascos reactivos color mbar de 250 mL. 1 termmetro de + 110 C. a 10 C. UTENSILIOS: Gradilla metlica. Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer Torundas con alcohol. Ligadura o tubo ltex. Franela. Aplicadores de madera. Papel parafilm. Bulbo de hule. Marcador de tinta indeleble. APARATOS: Centrfuga elctrica. Bao Mara elctrico. Espectrofotmetro o fotmetro de filtros. Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000, 100 y 50 L REACTIVOS: Reactivo de trabajo 1: cido pcrico Reactivo de trabajo 2: Hidrxido de sodio Estndar de Creatinina de 2 mg/dL. El reactivo de trabajo para creatinina se prepara mezclando una parte del cido pcrico y una parte de hidrxido de sodio. PELIGRO: El cido pcrico es explosivo cuando esta seco. El reactivo contiene lcali fuerte. Evitar la ingestin y contacto con la piel, boca y ojos. No pipetear con la boca. La toxicidad del reactivo no ha sido determinada. Si se derrama, lavar las partes afectadas con abundante agua. El cido pcrico puede causar reacciones alrgicas. Los reactivos se encuentran listos para usarse y son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 a 8C.

25

V. DESARROLLO. Tcnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Suero ______ 100 L ______ Patrn de 2 mg/dL ______ _____ 100 L 2. Despus de aadir la muestra (suero), mezclar y poner en marcha el cronmetro. 3. Leer al minuto la absorbancia uno (As 1) y a los 2 minutos la absorbancia dos (As 2) despus de haber mezclado los tubos, a 492 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos mientras se mantiene constante la temperatura a 37C. 4. En caso de que la segunda lectura sea la misma que la primera, realizar una tercera lectura. CLCULOS: Creatinina (mg/dL) = (As 2 - As 1) Muestra (As 2 - As 1) Patrn X [ Patrn ]

Para obtener: Creatinina (mg/dL) = As Muestra As Patrn Factor de conversin de mg/dL a mmol/L = 88.4

[ Patrn ]

Los volmenes de reactivo y de muestra pueden ser alterados proporcionalmente para adaptarse a los diferentes requerimientos del espectrofotmetro. Las muestras de creatinina con valores mayores a 1.8 mmol/L deben ser diluidas con solucin salina isotnica y reensayadas, multiplicando los resultados por el factor de dilucin. VALORES DE REFERENCIA: Suero: Mujeres: 0.6 - 1.2 mg/dL (0.050 - 0.105 mmol/L) Hombres: 0.7 - 1.4 mg/dL (0.060 - 0.120 mmol/L) Orina: 15 a 25 mg/Kg/24h. Mujeres: de 8 a 18 mg/Kg/24h (71 a 177 mol/Kg/24h) Hombres: de 10 a 20 mg/Kg/24h (88 a 177 mol/Kg/24h) Se recomienda que cada laboratorio verifique el rango normal en su propio laboratorio.

26

INFORME DEL ALUMNO: A. B. C. D. E. F. G. H. Datos Frmulas Clculos Resultados (con sus unidades correspondientes) Anlisis o discusin de resultados Conclusiones Cuestionario Bibliografa

VI. CUESTIONARIO. 1. Mencione tres enfermedades en las cuales haya aumento en los niveles de creatinina en suero. 2. Explique la importancia del compuesto fosfocreatina en el organismo humano. 3. Mencione 3 enfermedades en la cual la creatinina est aumentada en la sangre por arriba de los valores normales. 4. Escriba el significado de los siguientes trminos: Creatininemia Creatininuria Hipercreatinemia 5. Mencione otros mtodos de laboratorio tiles para el diagnstico de la funcin renal. 6. Explique en que consiste la tcnica de Depuracin de Creatinina y su importancia en el diagnstico Clnico.

27

PRACTICA No 8

CUANTIFICACIN DE COLESTEROL SRICO

MTODO ENZIMTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE ALLAIN Y COLS. MODIFICADO POR ROESCHLAU (TRINDER CHOD-POD). I. COMPETENCIA: Determina cuantitativamente la concentracin de colesterol en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN: El colesterol es un alcohol esteroide (derivado del hidrocarburo tetracclico saturado llamado perihidrociclopentanofenantreno) que contiene un radical hidroxilo en el carbono 3 del anillo A y una cadena ramificada de 8 tomos de carbono en el carbono 17, lo cual le da la caracterstica de lpido, como ser insoluble en agua, pero soluble en compuestos orgnicos como ter, cloroformo, benceno y alcohol caliente. Cualquier clula del organismo, prcticamente, puede producir colesterol a partir de compuestos simples de dos carbonos (acetato). El hgado, corteza suprarrenal, ovarios y testculos, as como el epitelio intestinal, son focos especialmente activos en la sntesis de colesterol. La corteza suprarrenal los ovarios y los testculos utilizan el colesterol y sus steres para producir hormonas esteroideas. Adems de sintetizar colesterol, el hgado tambin lo esterifica, transformando parte de l en cido clico, el cual se excreta con la bilis Clnicamente es importante, ya que existe una relacin entre la concentracin del colesterol srico y la presencia de problemas cardiacos coronarios. III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS HYCEL). Los esteres de colesterol presentes en el suero son hidrolizados enzimticamente en presencia de la enzima COLESTEROL ESTERASA (CE), para formar Colesterol y cidos Grasos libres. El colesterol libre formado, incluyendo aquel que se encuentra originalmente, es oxidado en presencia de la enzima COLESTEROL OXIDASA (CO) para formar Colest4-en-3-ona y Perxido de hidrgeno. El Perxido de hidrgeno formado reacciona con el cido Hidroxibenzoico (HBA) y la 4-aminoantipirina en presencia de la enzima PEROXIDASA (POD) para formar un cromgeno de color rosa-rojizo de Quinoneimina cuya intensidad del color va a ser directamente proporcional a la concentracin de colesterol presente en la muestra. Esteres de colesterol + H2O Colesterol libre + O2

CE CO
28

Colesterol + cidos grasos Colest-4-en-3-ona + H2O2

2H2O2 + HBA + 4-aminoantipirina

(ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES)

POD

(CROMGENO ROSAROJIZO)

Quinoneimina + 4H2O

DONDE: HBA = CIDO HIDROXIBENZOICO FUNDAMENTO: Laboratorios SPINREACT. Esteres de colesterol + H2O Colesterol libre + O2 2H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona
(ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES)

CHE CHOD POD

Colesterol + cidos grasos 4 Colestenona + H2O2 Quinonimina

(CROMGENO ROSAROJIZO)

4H2O

El colesterol esterificado presente en la muestra va a ser hidrolizado en presencia de la enzima COLESTEROL ESTERASA para formar Colesterol y cidos grasos. El colesterol libre formado, es oxidado por la enzima COLESTEROL OXIDASA para formar 4-colestenona y perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno formado reacciona con el fenol y la 4-aminifenazona en presencia de la enzima PEROXIDASA para formar quinonimina, cromgeno de color rosa-rojizo, cuya intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS. MATERIAL DE VIDRIO 3 Tubos de hemlisis de 13 x 100 mm 1 Pipeta Pasteur con bulbo 1 Vaso de precipitado de 250 mL. 3 Celdillas o fotoceldas 1 Frascos reactivos color mbar de 250 mL UTENSILIOS: Gradilla metlica Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Tubos vacutainer sin anticoagulante Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Marcador de tinta indeleble Perilla o bulbo de hule

29

 Escobilln chico y grande Detergente inico de pH neutro marca Extran APARATOS: Bao mara elctrico Centrfuga elctrica Espectrofotmetro Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000 y 10 L MATERIAL BOIOLGICO; Suero o plasma.

REACTIVOS: LABORATORIOS HYCEL Reactivo de colesterol Patrn de colesterol de 300 mg/dL (7.76 mmol/L). El reactivo se encuentra listo para usarse y es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 a 8C. REACTIVOS: LABORATORIOS SPINREACT Reactivo de trabajo: Disolver suavemente el contenido de un vial de R2 de enzimas en un frasco de R1 Tampn. La estabilidad del reactivo es de 4 meses en refrigeracin de 2 a 8C 40 das de 15 a 25C. Mantener protegido de la luz. Patrn primario de colesterol de 200 mg/dL (5.2 mmol/L) NOTA: No ingerir, evitar el contacto con la piel y ojos, si esto sucede, lavar con abundante agua la zona afectada. V. PROCEDIMIENTO: 1. El reactivo de trabajo y las muestras debern estar a temperatura ambiente al momento de realizar la prueba. 2. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de Colesterol Agua destilada Patrn Suero 1.0 mL 10 L ______ ______ 1.0 mL ______ ______ 10 L 1.0 mL ______ 10 L ______

3. Mezclar e incubar en bao mara a 37C durante 5 minutos o 10 minutos a temperatura ambiente. 4. Leer las absorbancias a 500 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos.

30

Esta determinacin se puede llevar a cabo a 30C aumentando el tiempo de incubacin a 10 minutos a 25C incubando por 15 minutos, en bao mara. CLCULOS: Colesterol Total (mg/dL) = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn X [ Patrn ]

La reaccin sigue la Ley de Beer y Lambert por lo que se puede usar el mtodo del factor de calibracin para el clculo de los resultados. FACTOR DE CALIBRACIN (F) = 300 Absorbancia del patrn

Colesterol Total (mg/dL.) = Absorbancia de la muestra X FACTOR (F) VALORES DE REFERENCIA: Colesterol Total: hasta 200 mg/dL (menor de 5.2 mmol/L REPORTE DEL ALUMNO: A. B. C. D. E. F. G. H. Datos obtenidos. Frmulas. Clculos. Resultados (con sus unidades correspondientes) Discusin anlisis de resultados. Conclusiones. Cuestionario. Bibliografa

CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Explicar brevemente la biosntesis del colesterol. Mencione en una persona normal los niveles de colesterol libre esterificado. Qu cidos se encuentran presentes en el colesterol esterificado. Mencione 3 focos activos en la sntesis de colesterol. Mencione 2 enfermedades en la cual hay aumento de colesterol en la sangre. Defina que es la arterioesclerosis

31

PRACTICA No. 9 CUANTIFICACIN DE TRIGLICRIDOS SRICOS MTODO ENZIMTICO VISIBLE DE PUNTO FINAL TRINDER, DE WAKO, MODIFICADO POR McGOWAN Y FOSSATI I. COMPETENCIA:

Cuantifica la concentracin de triglicridos en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIN: Los triglicridos se producen en el hgado a partir del glicerol y los cidos grasos, y de los tristeres de estos dos componentes. Los triglicridos son lpidos que existen normalmente en la sangre y se emplean para producir la energa para el organismo. El exceso de triglicridos se almacena en el tejido adiposo. Esta prueba se usa para evaluar a los pacientes que se sospecha tienen aterosclerosis y como una indicacin de la capacidad del organismo para metabolizar las grasas. Los triglicridos aumentados, junto con el colesterol elevado, son factores de riesgo en la enfermedad aterosclertica. Puesto que el colesterol y los triglicridos pueden variar independientemente, la medicin de ambos ndices es ms significativa que la de cualquiera de ellos solo. III. FUNDAMENTO: Los triglicridos presentes en el suero son hidrolizados en presencia de la enzima LIPOPROTEINLIPASA (LPL) para formar como productos, glicerol y cidos grasos. El glicerol que no se hidroliz es fosforilado por el Adenosin-trifosfato (ATP), en presencia de la enzima GLICEROL KINASA (GK) para formar Glicerol-3-fosfato (G3P) y Adenosin-Difosfato (ADP). El Glicerol-3-fosfato es oxidado en presencia de la enzima GLICEROL FOSFATO OXIDASA (GPO) para formar Dihidroxiacetona Fosfato (DAP) y Perxido de Hidrgeno (H2O2). El perxido de Hidrgeno formado reacciona con la 4aminofenazona (4-AF) y el p-clorofenol en presencia de la enzima PEROXIDASA (POD) formando como producto final Quinonimina (complejo de color rosa-rojizo) y agua. La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de triglicridos presentes en la muestra.
LIPO PROTEIN

Triglicridos

H2O
LIPASA GLICEROL KINASA

Glicerol

cidos grasos

Glicerol

ATP

Glicerol-3-Fosfato
GLICEROL FOSFATO

ADP

Glicerol-3-Fosfato + O2
OXIDASA

Dihidroxi acetona fosfato + H2O2

32

PEROXIDASA

H2O2

4-AF + p-Clorofenol
(ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES)

Quinonimina

(CROMGENO ROSAROJIZO)

H2O

NOTA: En el mtodo de los laboratorios HYCEL, solo cambia el aceptor final de electrones (4-AAP + 3,5-DHBS) y el producto final es Quinoneimina. IV. MATERIAL UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO: 5 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm 1 Pipeta Pasteur con bulbo 2 Vasos de precipitado de 500 y 250 mL. 1 Termmetro de -10C a +110C 4 Celdillas o fotoceldas UTENSILIOS: Gradilla Equipo vacutainer Torundas Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Papel absorbente Escobilln chico EQUIPO: Espectrofotmetro Centrfuga elctrica Bao Mara Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000 y 10 L y sus puntillas correspondientes MATERIAL BIOLGICO: Suero, plasma u orina REACTIVOS: Reactivo de trabajo 1. Amortiguador. Reactivo de trabajo 2 Enzimas. Patrn de triglicridos de 200 mg/dL El reactivo de trabajo se prepara disolviendo el contenido de un vial de R2 en un frasco de R1.

33

En caso de tener como referencia el No. 1001310. Reconstituir el Reactivo de trabajo, disolviendo el contenido de un vial de R2 en 10 mL de R1. Mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estable hasta 6 semanas a 2 a 8C o una semana a 15 a 25C. V. PROCEDIMIENTO: TCNICA: Laboratorios SPINREACT 1. Marcar tres tubos de ensayo con las letras y B (Blanco), M (Muestra) y P (Patrn). Se recomienda utilizar material de vidrio rigurosamente limpio para evitar errores. 2. Adicionar: BLANCO Reactivo de trabajo Suero Patrn de 200 mg/dL 1.0 mL _______ _______ MUESTRA 1.0 mL 10 L _______ PATRN 1.0 mL _______ 10 L

3. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C en bao mara o 10 minutos a temperatura ambiente. 4. Leer a 505 nm, ajustando a cero de absorbancia con el blanco de reactivos. CALCULOS: Triglicridos (mg/100 mL.) = As de la muestra ------------------------- x [Patrn] As del Patrn

FACTOR DE CONVERSIN DE mg/dL a mmol/L = 0.0113 VALORES DE REFERENCIA: Hombres: 40 a 160 mg/dL (0.45 a 1.81 mmol/L) Mujeres: 35 a 165 mg/dL (0.40 a 1.86 mmol/L) VI. CUESTIONARIO: 1. Menciona las enzimas que intervienen, en orden de actividad, en la reaccin que se produce para la cuantificacin de triglicridos. 2. Cul es la funcin de los triglicridos en el organismo humano?. 3. Menciona 2 alteraciones que producen un aumento de triglicridos en sangre. 4. Menciona otros mtodos de laboratorio para la cuantificacin de triglicridos. 5. Quin transporta a los triglicridos a travs de la sangre? 6. Esquematiza cmo esta formado un triglicrido.

34

PRACTICA No. 10 CUANTIFICACIN DE HIERRO SRICO MTODO QUMICO VISIBLE DE PUNTO FINAL I. COMPETENCIA:

Cuantifica la concentracin de hierro srico en una muestra de suero.

II. INTRODUCCIN: El hierro srico se distribuye en el organismo de diferentes maneras, incluyendo hemoglobina, hierro tisular y mioglobina. El transporte de hierro de un rgano a otro se realiza mediante una protena transportadora llamada apotransferrina. El complejo que forma con el hierro se conoce como transferrina. La ferritina, localizada en casi todas las clulas del cuerpo, constituye una reserva de hierro disponible para la formacin de la hemoglobina y otras protenas que contienen el grupo hemo. La absorcin de hierro ocurre principalmente en el duodeno. Tanto la ferritina como la transferrina estn presentes en las clulas de la mucosa intestinal y juntas regulan la absorcin de hierro. Los mayores desrdenes del metabolismo de hierro se relacionan con su deficiencia o exceso, sin embargo, se han observado alteraciones en muchas otras enfermedades, incluyendo anemia, enfermedades cardiovasculares, hepatitis crnica, enfermedades renales e infecciones. La anemia por prdida de hierro representa uno de los trastornos orgnicos ms frecuentes, especialmente en nios, mujeres jvenes, embarazadas y ancianos. Tambin las lceras gstricas o duodenales y carcinomas de estmago, constituyen causas de anemia ferropnica. Por el contrario, el exceso de hierro se asocia con otros desrdenes, como hemosiderosis, hemocromatosis y anemia sideroblstica. III. FUNDAMENTO: El hierro srico se libera de su unin con su protena transportadora especfica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3.7 y en presencia de un reductor, el cido mercaptoactico. Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm. pH = 3.7 Hierro-transferrina + cido mercaptoactico Hierro + Piridil bis-fenil triazina sulfonato
(REACTIVO DE COLOR)

Hierro + Transferrina Complejo de color magenta

(CROMGENO)

35

IV. MATERIAL UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO: 5 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm 1 Pipeta Pasteur con bulbo 2 Vasos de precipitado de 500 y 250 mL. 1 Termmetro de -10C a +110C 4 Celdillas o fotoceldas UTENSILIOS: Gradilla Equipo vacutainer Torundas Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Papel absorbente Escobilln chico EQUIPO: Espectrofotmetro Centrfuga elctrica Bao Mara Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000 y 10 L y sus puntillas correspondientes MATERIAL BIOLGICO: Suero. REACTIVOS: Reactivo PBTS: solucin estabilizada de piridil bis-fenil triazina sulfonato 50 mmol/L. S. Estndar: solucin de iones Fe (III) equivalente a 100 g/dL. Buffer succinato: solucin de succinato 0.25 moles/L. para pH 3.7. Reductor: ampolla autorrompible conteniendo cido mercaptoactico al 70%. INSTRUCCIONES PARA SU USO: Reactivo PBTS y Standar: listos para usar. Buffer/Reductor: transferir el contenido de la ampolla del Reductor al Buffer succinato, vertindolo directamente en el frasco de Buffer y mezclando por inversin. Anotar en el rtulo la fecha de preparacin.

36

V. PROCEDIMIENTO: TCNICA: Laboratorios SPINREACT 1. Marcar tres tubos de ensayo con las letras y B (Blanco de Reactivos), D (Desconocido) y S (Standard). Se recomienda utilizar material de vidrio rigurosamente limpio para evitar errores. 2. Adicionar: B Agua bidestilada Standard (100 g/dL) Suero Buffer/Reductor 500 L. ______ _______ 2 mL. D _______ _______ 500 L. 2 mL. S _______ 500 L. ______ 2 mL.

3. Mezclar. 4. Leer a 560 nm, ajustando a cero de absorbancia con el blanco de reactivos. 5. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posicin vertical, 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los tubos a a 560 nm entre 6 y 20 minutos, llevando el aparato a cero con agua. CALCULOS: Corregir las lecturas de S y D, restndoles los Blancos correspondientes: S B = S corregida D (B + BS) = D corregida Fe (g/dL.) = D corregida x f 100 g/dL. f = -----------------S corregida

Donde:

VALORES DE REFERENCIA: Hombres: 65 a 175 g/dL (11.6 a 31.3 mol/L) Mujeres: 50 a 170 g/dL (9 a 30.4 mol/L) VI. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Cul es la funcin del hierro en el organismo humano?. Menciona 2 alteraciones que producen un aumento del hierro srico en sangre. Menciona otros mtodos de laboratorio para la cuantificacin de hierro srico. Quin transporta al hierro a travs de la sangre?

37

PRACTICA No. 11

CUANTIFICACIN DE BILIRRUBINAS SRICAS

MTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE JENDRASSICK I. COMPETENCIA: Cuantifica la concentracin de bilirrubinas en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN: La bilirrubina resulta de la rotura de la hemoglobina de los eritrocitos, es un subproducto de la hemlisis (destruccin de hemates). Es producida por el sistema reticuloendotelial. Es eliminada del organismo: por el hgado la cual la excreta hacia la bilis y da a esta su principal pigmentacin. En el suero generalmente se encuentra una pequea cantidad de bilirrubina. Se presentar un aumento en las concentraciones sricas si hay destruccin excesiva de eritrocitos o cuando el hgado es incapaz de excretar las cantidades normales de bilirrubina producida. Existen dos formas de encontrar la bilirrubina en el organismo: 1) bilirrubina indirecta o no conjugada (relacionada con las protenas), y 2) bilirrubina directa o conjugada que circula libremente en la sangre hasta que llega al hgado, donde se conjuga con la glucuronil transferasa y entonces es excretada hacia la bilis. Un aumento en la unin de bilirrubina o protenas (bilirrubina no conjugada) guarda relacin ms frecuentemente con destruccin aumentada de eritrocitos (hemlisis); un incremento de la bilirrubina que circula libre se va ms frecuentemente en una disfuncin o bloqueo del hgado. EXPLICACIN DE LA PRUEBA: La medicin de la bilirrubina es importante en la evaluacin de la funcin heptica, anemia hemoltica e hiperbilirrubinemia (en los recin nacidos). MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE LA BILIRRUBINA TOTAL Y LA DIRECTA. La mayora de los mtodos para la determinacin de la bilirrubina se basan en la diazorreaccin se presentan en los productos de reaccin de los diferentes componentes de la bilirrubina srica en la diazorreaccin implica la rotura de la molcula de bilirrubina en uno u otro lado del puente metnico (-CH2-) central, con la formacin de dos pirroles.

38

III. FUNDAMENTO (LABORATORIOS SPINREACT) La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante la accin del cido sulfanlico diazotado, midindose fotomtricamente. De las dos fracciones presentes en el suero, bilirrubin-glucornido y bilirrubina libre ligada a la albmina, solo la primera reacciona en medio acuoso (Bilirrubina Directa) precisando la segunda la solubilizacin con Dimetilsulfxido (DMSO) para que reaccione (Bilirrubina Indirecta). La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de bilirrubina presente en la muestra La bilirrubina indirecta se obtiene de la diferencia entre la bilirrubina total y la bilirrubina directa. BILIRRUBINA DIRECTA cido sulfanlico diazotado + Bilirrubinas (Diazo reactivo de Erhlich) BILIRRUBINA TOTAL cido sulfanlico diazotado + Bilirubinas (Diazo reactivo de Erhlich) (suero) (suero) H+ Azobilirrubina
(CROMGENO DE COLOR ROSA-VIOLCEO)

H+ Azobilirrubina
(CROMGENO DE COLOR ROSA-VIOLCEO)

+
Acelerador (Dimetilsulfxido) IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO 8 Tubos de ensaye de 13 x 100mm. 1 Pipeta Pasteur con bulbo 6 Celdillas o fotoceldas 1 Vaso de precipitados de 250mL 1 Termmetros de 10 a +110 C. UTENSILIOS Gradilla metlica Franela Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex

39

Parafilm Marcador de tinta indeleble Aplicadores de madera Escobilln chico y grande Detergente inico de pH neutro marca Extran Espectrofotmetro Refrigerador Centrfuga elctrica Bao mara Pipetas semiautomticas de 1000, 50 y 100 L.

MATERIAL BIOLGICO: Suero o plasma no hemolizado. La estabilidad de la bilirrubina en suero, protegido de la luz, es de 4 das a temperatura 2 8C 2 meses a -20C. La presencia de hemlisis disminuye el valor de las Bilirrubinas. REACTIVOS (Laboratorio SPINREACT) Reactivo 1. (BD): cido Sulfanlico y cido Clorhdrico Reactivo 2. (BT): cido Sulfanlico, cido Clorhdrico (CIH) y Dimetilsulfoxido (DMSO) Reactivo 3. : Nitrito de Sodio Estndar (Opcional) Todos los reactivos se encuentran listos para usarse y son estables hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta cuando se almacena de 2 - 8C. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. NOTA: El cido clorhdrico es bastante irritante, irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias. En caso de contacto con los ojos, lvese inmediatamente con abundante agua y acudir a un mdico. REACTIVOS (Laboratorios STANBIO) Reactivo de Bilirrubina Total Reactivo de Bilirrubina Directa Oxidante de Bilirrubina (Nitrito de sodio) Patrn de Bilirrubina de 10 mg/Dl V. PROCEDIMIENTO Tcnica: Laboratorios SPINREACT TCNICA PARA BILIRRUBINA TOTAL Y BILIRRUBINA DIRECTA. 1. Marcar seis tubos de ensaye con las letras B (Blanco) BT (B. Total), B (Blanco) BD (B. Directa), B (Blanco) y BP (B. Patrn). Enseguida agregar:

40

REACTIVO

BLANCO

B. TOTAL

BLANCO

B. DIRECTA

BLANCO

PATRN

Reactivo 1 (D) _____ _____ 1.5 mL 1.5 mL Reactivo 2 (T) 1.5 mL 1.5 mL _____ _____ 1.5 mL 1.5 mL Reactivo 3 50 L _____ 50 L 50 L Suero 100 L 100 L 100 L 100 L Patrn 100 L 100 L 2. Mezclar y dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente. 3. Leer las absorbancias a 555 nm, ajustando a cero con agua destilada como blanco. CLCULO. Con Calibrador o patrn: Bilirrubina mg/dL = Con Factor: Bilirrubina mg/dL = As de la Muestra As del Blanco de Muestra X Factor Donde: Factor = Concentracin del Patrn As del Patrn As del Blanco del Patrn As de la Muestra As del Blanco de Muestra As del Patrn As del Blanco del Patrn X [ Patrn ]

Valor del Factor: Bilirrubina Total = 19.1 Bilirrubina Directa = 14 Factor de Conversin de mg/dL a mol/L = 17.1 VALORES DE REFERENCIA. Bilirrubina Total: Bilirrubina Directa: PROCEDIMIENTO Tcnica: Laboratorios STANBIO Hasta 1.10 mg./dL Hasta 18.81 umol/L Hasta 0.25 mg. /dL. Hasta 4.27 umol/L.

TCNICA PARA BILIRRUBINA TOTAL. 1. Marcar cuatro tubos de ensaye con las letras RB (Blanco de Reactivo), BM (Blanco de Muestra), M (Muestra) y P (Patrn). Enseguida agregar:

41

REACTIVOS

B. DE REACTIVO

B. DE MUESTRA

MUESTRA

PATRN

Reactivo de B. Total Oxidante (gotas) Agua destilada Suero Patrn

1.0 mL 1 50 L _____ _____

1.0 mL 1 _____ 50 L _____

1.0 mL _____ 50 L _____

1.0 mL 1 _____ 50 L

2. Mezclar y dejar reposar 3 minutos a temperatura ambiente. 3. Leer las absorbancias a 540 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. TCNICA PARA BILIRRUBINA DIRECTA. 1. Marcar cuatro tubos de ensaye con las letras RB (Blanco de Reactivo), BM (Blanco de Muestra), M (Muestra) y P (Patrn). Enseguida agregar:
REACTIVOS B. DE REACTIVO B. DE MUESTRA MUESTRA PATRN

Reactivo de B. Total Oxidante (gotas) Agua destilada Suero Patrn

1.0 mL 1 100 L _____ _____

1.0 mL 1 _____ 100 L _____

1.0 mL _____ 100 L _____

1.0 mL 1 _____ 100 L

2. Mezclar y dejar reposar 3 minutos a temperatura ambiente. 3. Leer las absorbancias a 540 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. La bilirrubina es estable en suero o plasma de 4 7 das a 2 -8C por 3 meses cuando se congela a -20C. CLCULOS. Bilirrubina mg/dL = As de la Muestra As del Blanco de Muestra As del Patrn X [ Patrn ]

VALORES DE REFERENCIA. Bilirrubina Total (Adultos) = 1.2 mg/dL Bilirrubina Total (Recin nacidos) = 12.0 mg/dL Bilirrubina Directa (Adultos e infantes mayores de 1 ao) = 0.5 mg/dL Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Si la Concentracin de la muestra es superior al lmite de linealidad, diluir a la mitad con Cloruro de Sodio al 0.9% y multiplicar el resultado por 2. INTERFERENCIAS La hemoglobina interfiere con el ensayo, disminuyendo falsamente los valores de bilirrubina directa. La turbidez, debida a concentraciones altas de triglicridos, puede elevar falsamente los resultados de bilirrubina total.

42

VI. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Mencione 3 diferencias entre bilirrubina directa y bilirrubina total. Mencione tres enfermedades que origina el aumento de la bilirrubina directa. Qu otro nombre reciben estas don bilirrubinas? Dentro del metabolismo de la bilirrubina que sustancias dan la coloracin a las heces y a la orina. 5. A la presencia de bilirrubina en orina se le conoce como.

43

PRACTICA No 13

CUANTIFICACIN DE PROTENAS TOTALES

POR EL MTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE BIURET I. COMPETENCIA. Cuantifica la concentracin de protenas totales en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas. Constituyen el 50% o ms de su peso seco. Todas ellas contienen los elementos C, H, O, N y algunas S. Los pesos moleculares de las protenas son muy elevados, pero con hidrlisis, las molculas proteicas dan una serie de compuestos orgnicos sencillos de bajo peso molecular llamados aminocidos, los cuales constituyen las unidades de las protenas. Los aminocidos son compuestos orgnicos estn formados por un grupo amino y un cido orgnico. Por lo comn, solamente se encuentran 20 aminocidos naturales diferentes y sus posibles combinaciones nos dan 1048 opciones. En las molculas proteicas, los sucesivos restos de aminocidos se hallan unidos covalentemente entre si mediante unas uniones amida sustituidas llamadas enlaces peptdicos, producidos por la eliminacin de una molcula de agua entre grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino del siguiente aminocido, constituyendo una cadena polipeptdica. Las cadenas polipeptdicas de, las protenas poseen una especfica composicin qumica, un peso molecular y una secuencia ordenada de sus aminocido estructurales y una forma tridimensional. Las principales protenas que se encuentran en el plasma son la albmina, las globulinas y el fibringeno. Las globulinas pueden dividirse todava en variedades alfa 1, alfa 2, beta y gamma; el fibringeno y casi todos los factores de coagulacin tambin son globulinas. Las protenas plasmticas son producidas por el hgado; pero las inmunoglobulinas provienen en parte de las clulas plasmticas y probablemente tambin del tejido linfoide. III. FUNDAMENTO. Las protenas presentes en suero o plasma reaccionan con el reactivo de Biuret en un medio alcalino, formando un complejo de color violeta azulado en presencia de sales de cobre, contiene yoduro como antioxidante, cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de protenas presentes en la muestra.

44

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO 6 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm. 1 Vaso de precipitados de 250 mL. 2 Frascos reactivos de 500 mL. color mbar 2 Tubos vacutainer sin anticoagulante 1 Pipeta Pasteur con bulbo UTENSILIOS: Gradilla metlica Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Marcador de tinta indeleble Perilla o bulbo de hule Escobilln chico y grande Detergente inico de pH neutro marca Extran APARATOS: Centrfuga elctrica Espectrofotmetro Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000, 50 y 5 L. MATERIAL BIOLOGICO: Suero o lquidos (pleural, sinovial), no hemolizado ni lipmico. REACTIVOS: Reactivo de trabajo para Protenas Totales Reactivo de trabajo para Albmina No. 1. Patrn de Protenas Totales (7 g/dL). Es estable a temperatura ambiente. Reactivo de Biuret: CuSO4 Tartrato doble de Na y K Yoduro de K NaOH 2.5 N H2O c. b. p.
45

1.5 g. 6.0 g. 1.0 g. 300 mL. 1000 mL.

Disolver en el orden indicador en unos 500 mL. de agua destilada, calentando para facilitar la dilucin, agregar la solucin de NaOH, agitar, y agregar agua destilada hasta la seal del aforo. Guardar el frasco mbar, de preferencia entre +2 y +8 C. No. 4. Amortiguador. Consrvese entre +2 y +8 C. de preferencia. No 5. Verde de Bromocresol. Consrvese entre +2 y +8 C. de preferencia. Los reactivos estn listos para su uso. V. PROCEDIMIENTO PARA PROTENAS TOTALES Tcnica: Laboratorios SPINREACT 1. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de trabajo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Patrn de 7 g/dL ______ ______ 25 L Suero ______ 25 L ______ 2. Mezclar e incubar en bao mara durante 5 minutos a 37C o 10 minutos a temperatura ambiente (15 25C). 3. Leer las absorbancias a 540 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos. El color es estable por 30 minutos CLCULOS: Protenas Totales g/dL. = Absorbancia de la muestra Absorbancia del patrn FACTOR DE CALIBRACIN = X [ Patrn ]

7 Absorbancia del patrn

Protenas Totales g/dL. = Absorbancia de la muestra X FACTOR (F) LINEALIDAD: La reaccin es lineal hasta la concentracin de 12 g/100 mL. Para valores superiores, diluir la muestra con solucin salina fisiolgica y hacer nueva determinacin multiplicando el resultado por el factor de dilucin. VALORES DE REFERENCIA: Protenas totales: 6.6 a 8.3 g/dL. REPORTE DEL ALUMNO: A. Datos obtenidos B. Frmulas C. Clculos
46

D. Resultados E. Discusin o anlisis de resultados F. Conclusiones. G. Cuestionario H. Bibliografa VI. CUESTIONARIO. 1. Mencione tres funciones que realicen las protenas plasmticas. 2. Anote en orden progresivo de mayor a menor las diferentes protenas plasmticas as como el peso molecular de cada una. 3. Explique brevemente en que consiste la tcnica de Electroforesis. 4. Mencione la importancia clnica que tiene determinar las protenas totales en suero. 5. Esquematice un proteinograma indicando el nombre de cada una.

47

PRACTICA No 14

CUANTIFICACIN DE ALBMINA SRICA

POR EL MTODO VISIBLE DE PUNTO FINAL DE VERDE DE BROMOCRESOL I. COMPETENCIA. Cuantifica la concentracin de albmina en una muestra de suero. II. INTRODUCCIN. Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas. Constituyen el 50% o ms de su peso seco. Todas ellas contienen los elementos C, H, O, N y algunas S. Los pesos moleculares de las protenas son muy elevados, pero con hidrlisis, las molculas proteicas dan una serie de compuestos orgnicos sencillos de bajo peso molecular llamados aminocidos, los cuales constituyen las unidades de las protenas. Los aminocidos son compuestos orgnicos estn formados por un grupo amino y un cido orgnico. Por lo comn, solamente se encuentran 20 aminocidos naturales diferentes y sus posibles combinaciones nos dan 1048 opciones. En las molculas proteicas, los sucesivos restos de aminocidos se hallan unidos covalentemente entre si mediante unas uniones amida sustituidas llamadas enlaces peptdicos, producidos por la eliminacin de una molcula de agua entre grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino del siguiente aminocido, constituyendo una cadena polipeptdica. Las cadenas polipeptdicas de, las protenas poseen una especfica composicin qumica, un peso molecular y una secuencia ordenada de sus aminocido estructurales y una forma tridimensional. Las principales protenas que se encuentran en el plasma son la albmina, las globulinas y el fibringeno. Las globulinas pueden dividirse todava en variedades alfa 1, alfa 2, beta y gamma; el fibringeno y casi todos los factores de coagulacin tambin son globulinas. Las protenas plasmticas son producidas por el hgado; pero las inmunoglobulinas provienen en parte de las clulas plasmticas y probablemente tambin del tejido linfoide. III. FUNDAMENTO. Las protenas presentes en suero o plasma reaccionan con el reactivo de Biuret en un medio alcalino, formando un complejo de color violeta azulado en presencia de sales de cobre, contiene yoduro como antioxidante, cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de protenas presentes en la muestra.

48

IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO 6 Tubos de ensaye de 13 X 100 mm. 1 Vaso de precipitados de 250 mL. 2 Frascos reactivos de 500 mL. color mbar 2 Tubos vacutainer sin anticoagulante 1 Pipeta Pasteur con bulbo UTENSILIOS: Gradilla metlica Adaptador para vacutainer Tubo para vacutainer sin anticoagulante Agujas para vacutainer No. 21 (verde) Torundas con alcohol Ligadura o tubo ltex Franela Aplicadores de madera Papel parafilm Marcador de tinta indeleble Perilla o bulbo de hule Escobilln chico y grande Detergente inico de pH neutro marca Extran APARATOS: Centrfuga elctrica Espectrofotmetro Refrigerador Pipetas semiautomticas de 1000, 50 y 5 L. MATERIAL BIOLOGICO: Suero o lquidos (pleural, sinovial), no hemolizado ni lipmico. REACTIVOS: Reactivo de trabajo para Albmina No. 2. Patrn de Albmina (3.8 g/dL). Es estable a temperatura ambiente Reactivo de Biuret: CuSO4 Tartrato doble de Na y K Yoduro de K NaOH 2.5 N H2O c. b. p. 1.5 g. 6.0 g. 1.0 g. 300 mL. 1000 mL.

49

Disolver en el orden indicador en unos 500 mL. de agua destilada, calentando para facilitar la dilucin, agregar la solucin de NaOH, agitar, y agregar agua destilada hasta la seal del aforo. Guardar el frasco mbar, de preferencia entre +2 y +8 C. No. 4. Amortiguador. Consrvese entre +2 y +8 C. de preferencia. No 5. Verde de Bromocresol. Consrvese entre +2 y +8 C. de preferencia. Los reactivos estn listos para su uso. V. PROCEDIMIENTO PARA ALBMINA Tcnica: Laboratorios SPINREACT. 1. Marcar tres tubos de ensaye con las letras B (blanco), M (muestra) y P (patrn). Enseguida agregar: REACTIVO BLANCO MUESTRA PATRN Reactivo de Albmina 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Patrn de 5 g/dL ______ ______ 5 L Suero ______ 5 L ______ 2. Mezclar bien y dejar en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Leer las absorbancias del patrn y de la muestra a 630 nm o con filtro rojo ajustado a cero con el blanco de reactivos. El color es estable por 3 horas. CLCULOS: Albmina (g/100mL.) = Absorbancias de la muestra Absorbancia del patrn FACTOR DE CALIBRACIN = X [ Patrn ]

5 Absorbancia del patrn

Concentracin de Albmina (g/100 mL) = Absorbancia de la muestra X Factor. LINEALIDAD: La reaccin es lineal hasta la concentracin de 5.6 g/100 mL.; para valores superiores diluir la muestra con solucin salina fisiolgica, proceder a nueva determinacin y multiplicar el resultado por el factor de dilucin. El valor de la globulinas (g/100 mL. ( se obtiene restando de las protenas (g/100ml), el valor de la albmina (g/100ml). La reaccin A/G (Albmina/Globulina). Se obtiene dividiendo la concentracin de la albmina entre la concentracin de las globulinas. EJEMPLO: Protenas totales = 7.0 g/100mL. Albminas = 4.0g/100mL. Globulinas = 3.0 g/100mL.

50

Relacin A/G = 4.0 = 1.3 3.0 VALORES DE REFERENCIA: Albmina: 3.5 a 5.5 g/dL. REPORTE DEL ALUMNO: A. B. C. D. E. F. G. H. Datos obtenidos Frmulas Clculos Resultados Discusin o anlisis de resultados Conclusiones. Cuestionario Bibliografa

VI. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Mencione tres funciones que realiza la albmina. Anote el peso molecular de la albmina. Explique brevemente en qu consiste la tcnica de Electroforesis. Mencione la importancia clnica que tiene determinar la albmina en suero.

51

PRCTICA No. 15

EXAMEN GENERAL DE ORINA

EXAMEN FSICO Y QUMICO I. COMPETENCIA: Realiza el anlisis cualitativo de la orina (exmenes fsico y qumico) II. INTRODUCCIN: La orina es un lquido excretado por el rin y su examen es de gran utilidad en el diagnstico de varios padecimientos, en los que se modifican sus caracteres fsicos y/o qumicos, aumentan los elementos celulares que normalmente se encuentran en pequea cantidad. Respecto a la muestra que se emplea para el examen, es conveniente efectuar el estado de la orina eliminada durante 24 horas. En ocasiones se prefiere la primera orina de la maana con abstencin en la ingesta de lquidos de la noche anterior a la colecta, ya que esto trae como consecuencia una orina ms concentrada y evita las complicaciones de recolectar la muestra durante el da. El examen general de la orina comprende tres aspectos principales: El examen fsico, El examen Qumico y el Examen Microscpico del sedimento urinario. EXAMEN FSICO: VOLUMEN. La cantidad de orina eliminada en 24 horas est sujeta a diversas influencias segn la edad, el peso la temperatura, la dieta, etc. Por lo comn un sujeto adulto elimina entre 1200 a 1400 mL. en 24 horas. Los nios entre 6 y 12 aos orinan un volumen casi igual a la mitad del de los adultos. La poliuria es el aumento anormal del volumen urinario de 24 horas y puede provocarla el aumento de la ingestin de lquidos, el descenso de la temperatura ambiental, factores nerviosos o emocionales, alteraciones metablicas como la Diabetes Mellitus (DM). La oliguria es la disminucin anormal del volumen urinario y se produce en casos de gran sudoracin o restriccin acentuada de la ingesta de lquidos; procesos infecciosos agudos: trastornos cardiacos que afectan la circulacin renal, hemorragias, diarreas, vmitos etc. COLOR: Casi siempre la orina es de color amarillo, de tonalidad variable entre el tono ambarino y el amarillo paja. Este color se debe a la presencia de pigmentos como el urocromo, la uroeritrina, la urobilina y la hematoporfirina. A mayor volumen eliminado y

52

por ms bajo peso especfico, corresponde un color amarillo ms plido. En general la orina cida es ms oscura que la alcalina. En condiciones anormales, sean patolgicas o provocadas por la ingesta de alimentos o medicamentos pueden aparecer diversas coloraciones en la orina. OLOR: El olor de la orina normal es caracterstico, algo aromtico, y puede variar en diversas circunstancias. As, la ingestin proteica abundante acenta el olor urinario. La cetonuria produce el olor acetnico caracterstico. ASPECTO: En general la orina de miccin reciente es lmpida y transparente; al poco tiempo de estar estacionada aparecen enturbiamientos que originan un sedimento ms o menos abundantes, provocados por mucus, clulas epiteliales, leucocitos, etc. DENSIDAD: La densidad urinaria vara entre 1.015 y 1.025 por lo general existe una relacin inversa entre el volumen y la densidad influida por la ingestin de lquidos, la sudoracin excesiva u otras formas de prdidas hdricas, como la diarrea o el vmito persistente. EXAMEN QUMICO: PROTENAS: Normalmente la orina no contiene cantidades demostrables de protenas (salvo en la proteinuria ortosttica o postural). En las enfermedades del rin se pierde protenas plasmticas, sobre todo albminas cuyas molculas son de menor tamao. ACETONAS Y CUERPOS CETNICOS: Cuando el metabolismo de la glucosa est trastornado como en la diabetes mellitus no tratada, las fiebres, la diarrea, y otros vmitos, el ayuno, etc., se excretan en la orina cantidades excesivas de productos intermediarios del metabolismo de las grasas, sobre todo cido betahidroxibutrico y cido acetoactico (cido diactico). En esta ltima substancia se transforma lentamente en acetona cuando la orina se deja reposar a la temperatura ambiente. UROBILINA Y UROBILINGENO. El urobilingeno, la urobilina, el estercobilingeno y la estercobilina son productos de descomposicin de la bilirrubina que est normalmente presente en las heces. Cuando el hgado aumenta su excrecin de bilis como la ictericia hemoltica, etc. tiene lugar una mayor absorcin intestinal de estas substancias, que luego se excretan con la orina.

53

BIBIRRUBINA: La orina normal casi no tienen bilirrubina. Este cuerpo se elimina por la orina en la ictericia obstructiva, pero no en la hemoltica. GLUCOSA. De ordinario se eliminan por la orina cantidades pequesimas de glucosa no determinables por mtodos usuales. En determinadas circunstancias puede aparecer una glucosuria transitoria como ocurre en el hpertiroidismo, en traumatismos craneanos, en ciertos estados emotivos, etc. La glucosuria persistente ocurre en traumatismos craneanos que afectan el piso del 4 ventrculo; en denominada glucosuria renal y por fin el la diabetes mellitus. III. FUNDAMENTO. La orina es un lquido excretado por el rin en una cantidad que vara entre 800 y 1500 mL. en 24 horas. Algunos padecimientos renales, de las vas urinarias y extrarenales modifican la orina en: Sus caracteres fsicos: volumen, densidad, y pH. Su composicin con la aparicin de compuestos que normalmente no contiene: glucosa, protenas, hemoglobinas, cuerpos cetnicos, bilirrubinas o con el aumento de la cantidad de compuestos normales, como el urobilingeno. Los elementos morfolgicos del sedimento pueden aumentar, como los leucocitos, eritrocitos o bien aparecer como cilindros. IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO: Portaobjetos Cubreobjetos Pipetas serolgicas de 5.0 mL. 1 Urodensmetro de 1.000 a 1.045 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm 1 Probeta graduada de 50 mL. 1 Pipeta pasteur con bulbo UTENSILIOS Gradilla metlica Franela Detergente inico de pH neutro marca Extran Marcador de tinta indeleble Parafilm Bulbo de hule

54

 Escobilln chico y grande EQUIPO Microscopio Centrfuga elctrica MATERIAL BIOLOGICO: Orina reciente (primera de la maana) REACTIVOS: Tiras reactivas para uroanlisis Colorante de Sternheimer-Malbin (solucin diluida) PREPARACIN DEL REACTIVO: SOLUCIN A: Cristal violeta Alcohol etlico 95 Oxalato de amonio Agua destilada SOLUCIN B: Safranina Alcohol etlico Agua destilada 3 gr 20 mL. 0.8 gr 80 mL. 0.25 g 10 mL. 100 mL.

COLORANTE DILUIDO: Se mezclan 3 volmenes de la solucin A con 97 volmenes de la solucin B y se filtra, estable durante 3 meses. V. PROCEDIMIENTO: EXAMEN FSICO: COLOR: Se describe el color de la orina. Normalmente debe ser amarillo paja. OLOR: Al abrir el frasco, se describe el olor de acuerdo a las caractersticas que presente la orina. VOLMEN: Se mide el volumen total de la orina, normalmente en una muestra de 24 horas. Vara de 800 a 1200 mL./24 horas. ASPECTO: Se observa la orina y se describe el aspecto, que normalmente debe ser claro y transparente DENSIDAD: Se determina de dos formas, la primera, se coloca en una probeta aproximadamente 40mL de orina se introduce el densmetro cuidando que no toquen las paredes del recipiente y se le da un jiro, observando en que lugar de la escala coincide con el menisco que forma la orina y se toma la lectura. La segunda, a travs de la tira reactiva comparndolo con los colores que trae el frasco. La densidad normal de la orina vara de 1.015 a 1.025.

55

EXAMEN QUMICO. El examen qumico consiste en medir semicuantitativamente la concentracin de una serie de sustancias que aparece en la orina en ciertos padecimientos o que si existen normalmente pueden sufrir una elevacin en su concentracin. El examen se efecta con una tira reactiva de plstico e la que se encuentran colocadas unas reas de papel filtro que contiene reactivos especficos para determinar una sustancia. Las sustancias que comnmente se miden son: Protenas, Bilirrubina, Glucosa, Cetona, Sangre, Leucocitos y Urobingeno, adems de la medicin de pH y Densidad. Algunas tiras traen otras reas para medir la reduccin de nitratos a nitritos (reaccin de Griesse), cuando la orina esta contaminada con bacterias. El examen se efecta de la siguiente manera: Colocar, aproximadamente 8mL de orina en un tubo de ensaye. Sumergir la tira en la orina durante unos segundos cuidando de que se humedezcan todas las reas reactivas, sacar la tira eliminado el exceso de orina. Comparar la coloracin de las reas respectivas, con la escala anexa, cuidando que no pasen ms de 30 segundos antes de tomar la lectura. Fig. 1, 2, 3 y 4. Reportar las lecturas que normalmente deben ser las siguientes: pH de 4.0 a 6.5 Protenas: Negativo Bilirrubina: Negativo Glucosa: Negativo Acetona: Negativo Sangre: Negativo Densidad: Normal Urobiliongeno: Normal Nitritos: Negativos.

56

INFORME DEL ALUMNO. ANLISIS GENERAL DE LA ORINA: A) EXAMEN FSICO COLOR: _________________ OLOR: ___________________ DENSIDAD: _______________ VOLMEN: ________________ ASPECTO: _________________ B) EXAMEN QUMICO PROTENAS: _______________ GLUCOSA: ________________ CETONAS: _______________ BILIRRUBINA: ______________ UROBILINGENO: __________ NITRITOS: _________________ SANGRE: __________________ pH: _______________________ VI. CUESTIONARIO. 1. 2. 3. 4. Cules son los tres factores principales que influyen en la composicin de la orina? Cul es la importancia del examen general de orina en la clnica? Describa la tcnica de recoleccin de la orina para un examen general de orina Mencione los casos en que cursa la glucosuria con la hiperglucemia.

57

PRCTICA No. 16

EXAMEN GENERAL DE ORINA

EXAMEN QUMICO Y MICROSCPICO I. COMPETENCIA: Realiza el estudio qumico y microscpico del sedimento urinario. II. INTRODUCCIN: La orina es un lquido excretado por el rin y su examen es de gran utilidad en el diagnstico de varios padecimientos, en los que se modifican sus caracteres fsicos y/o qumicos, aumentan los elementos celulares que normalmente se encuentran en pequea cantidad. Respecto a la muestra que se emplea para el examen, es conveniente efectuar el estado de la orina eliminada durante 24 horas. En ocasiones se prefiere la primera orina de la maana con abstencin en la ingesta de lquidos de la noche anterior a la colecta, ya que esto trae como consecuencia una orina ms concentrada y evita las complicaciones de recolectar la muestra durante el da. EXAMEN MICROSCPICO DEL SEDIMENTO URINARIO. De ser posible, los sedimentos urinarios deben examinarse antes de que hayan transcurrido 8 horas desde su obtencin, de preferencia en un plazo de una a dos horas. En el sedimento urinario se encuentran 3 elementos principales: clulas, cilndricos y cristales (incluyendo precipitados amorfos). CLULAS CLULAS EPITELIALES: CLULAS EPITELIALES ESCAMOSAS: Son clulas grandes, con ncleos pequeos redondos u ovales, que provienen de los urteres, la vejiga y la uretra. CLULAS EPITELIALES POLIDRICAS: Son clulas pequeas y redondas, un poco mayores que los leucocitos, y clulas epiteliales piriformes, menores que las clulas escamosas, con un apndice terminal. Provienen principalmente de las vas altas. GLBULOS ROJOS: En las orinas hipertnicas, los glbulos rojos pueden ser detentados, de un tamao inferior al normal. En las orinas hipotnicas, se hinchan y se vuelven mayores que normalmente, perdiendo su aspecto tpico en doble anillo. La presencia de glbulos rojos en la orina indica sangrado en algn lugar de las vas urinarias. LEUCOCITOS: La eliminacin normal de leucocitos por la orina es del orden de 3mm 3, o sea 3000 por mL.

58

ESPERMATOZOIDES: Pueden concentrarse espermatozoides en la orina del hombre despus de la eyaculacin, o en la mujer contaminada por secrecin vaginal despus del coito. Son fciles de identificar. BACTERIAS: La orina normal no contiene bacterias. La contaminacin es muy frecuente cuando la orina se recoge con sonda, y si permanece a temperatura ambiente por algn tiempo, los microbios se multiplican con rapidez. No tienen significacin, salvo cuando la orina ha sido obtenida por sonda y recogida en envase estril. CILINDROS: Hay mucha variedad de cilindros: se deben a solidificacin de protenas en el tbulo de la nefrona y contienen a veces clulas, grnulos etc. Cilindros hialinos Cilindros granulosos Cilindros leucocitarios Cilindros hemticos Cilindros grasosos Cilindros creos Cilindros de insuficiencia renal Cilindroides Filamentos mucosos

CRISTALES: Normalmente no hay cristales en la orina fresca y se forman al enfriarse la muestra. En general los cristales urinarios no tienen significado, salvo si son de sulfonamidas, cistina, oxalatos en sujetos con historial de clico uretral o formacin de clculos y quiz en los enfermos de gota. CRISTALES EN LAS ORINAS CIDAS: Oxalato de calcio cido rico Uratos Cistina Tirosina

CRISTALES EN LAS ORINAS ALCALINAS: Fosfato amorfo Fosfatos triples Carbonato de calcio

59

III. FUNDAMENTO. La orina es un lquido excretado por el rin en una cantidad que vara entre 800 y 1500 mL. en 24 horas. Algunos padecimientos renales, de las vas urinarias y extrarenales modifican la orina en algunos elementos morfolgicos del sedimento, los cuales pueden aumentar, como los leucocitos, eritrocitos o bien aparecer cilindros, bacterias, clulas epiteliales. IV. MATERIAL, UTENSILIOS, EQUIPO Y REACTIVOS: MATERIAL DE VIDRIO: Portaobjetos Cubreobjetos Tubos de ensaye de 13 x 100 mm 1 Pipeta Pasteur con bulbo UTENSILIOS Gradilla metlica Franela Detergente inico de pH neutro marca Extran Marcador de tinta indeleble Parafilm Bulbo de hule Escobilln chico y grande EQUIPO Microscopio Centrfuga elctrica MATERIAL BIOLOGICO: Orina reciente (primera de la maana) REACTIVOS: Colorante de Sternheimer-Malbin (solucin diluida) PREPARACIN DEL REACTIVO: SOLUCIN A: Cristal violeta Alcohol etlico 95 Oxalato de amonio Agua destilada SOLUCIN B: Safranina Alcohol etlico Agua destilada 3 gr 20 mL. 0.8 gr 80 mL. 0.25 g 10 mL. 100 mL.

60

COLORANTE DILUIDO: Se mezclan 3 volmenes de la solucin A con 97 volmenes de la solucin B y se filtra, estable durante 3 meses. V. PROCEDIMIENTO: EXAMEN MICROSCPICO DEL SEDIMENTO URINARIO. Homogenizar bien la orina y colocar 8 mL de orina en un tubo de ensaye. Centrifugar a 2000rpm durante 5 a 10 minutos Decantar de golpe todo la orina. Resuspender el sedimento con la orina que escurre de las paredes del tubo. Colocar una gota de sedimento sobre un portaobjetos y enseguida colocarle un cubreobjetos. Observar el microscopio con el objetivo seco dbil (10X) con el fin de ver que la distribucin del sedimento sea uniforme. Cambiar al objetivo seco fuerte (40X) y contar los elementos celulares y cilindros que se observen en el campo. Identificar los diferentes tipos de cristales que pueda poseer la orina.

TINCIN DEL SEDIMENTO URINARIO. Al remanente del sedimento en el tubo de ensaye, agregarle una gota del colorante de Sternheimer-Malbin. Agitar y dejar reposar dos a tres minutos. Colocar una gota del sedimento teido entre portaobjetos y cubreobjetos. Seguir el procedimiento anterior a partir del penltimo paso.

El objeto de la tincin es ayudar a la identificacin de elementos celulares y cilindros. Los leucocitos se tien de color anaranjado a prpura; los leucocitos del parnquima renal de azul plido o son incoloros; los cilindros hialinos de rosado o prpura; Trichomonas de azul plidos: los ncleos de las clulas de epitelios vesical y vaginal se tien de azul y prpura respectivamente. El reporte del sedimento urinario se hace de la siguiente manera. Los elementos celulares se cuentan al igual que los cilindros, y se saca un promedio por campo; los cristales se reportan de acuerdo a su abundancia o escasez (mencionando stos trminos o por cruces) INFORME DEL ALUMNO. A) SEDIMENTO URINARIO DATOS GRALES DEL PACIENTE NOMBRE: _____________________ EDAD: ________________________ SEXO: ________________________

LEUCOCITOS: _________________ ERITROCITOS: ________________ CILINDROS: ___________________

61

CRISTALES: ___________________

FECHA: _______________________

CL. E. RENALES: _____________ PRACTICO EXAMEN:___________ TRINCHOMONAS: ______________________ ESPERMATOZOIDES: ___________________ OTROS: ___________________________________________________________ NOTA: REALIZAR LOS ESQUEMAS DE LOS ENCONTRADOS EN EL SEDIMENTO URINARIOA. ESQUEMAS DEL SEDIMENTO URINARIO DIFERENTES ELEMENTOS

LEUCOCITOS

LEUCOCITOS

CLULAS EPITELIALES

CLULAS EPITELIALES

CILINDRO GRANULOSO

CILINDRO GRANULOSO

62

CILINDROS ERITROCITARIOS

CILINDROS LEUCOCITARIOS

CRISTALES DE CIDO RICO

CRISTALES DE URATO AMORFO

CRISTALES DE FOSFATO AMNICO

CRISTALES DE CISTINA

CRISTALES DE OXALATO DE CALCIO

CRISTALES DE CIDO HIPRICO

63

CRISTALES DE FOSFATO TRIPLE

LEVADURAS Y BACTERIAS

AGUJAS DE TIROSINA Y LEUCINA

CRISTALES DE FOSFATO AMORFO

VI. CUESTIONARIO. 1. Cuales son los tres factores principales que influyen en la composicin de la orina? 2. Cual es la importancia clnica del Examen General de Orina? 3. Menciona las indicaciones para la recoleccin de orina para el examen de la misma. 4. Menciona los casos en que cursa la glucosuria con la hiperglucemia. 5. En caso de la glomrulonefritis, nefrosis, y padecimientos de parnquima renal, diga qu tipos de estructuras se observan en el sedimento urinario?

64

BIBLIOGRAFIA: 1. Iovine-Selva. El Laboratorio en la Clnica, 2 edicin, editorial Pamanericana, Argentina 1979, pag. 342, 343 y 344. 2. Manual de practicas del curso de Anlisis Qumico. Responsable: Q.F.B. Estela Cevallos Ferriz 1989. 3. Lynch, y Cols., Mtodos de Laboratorio, Ed. Interamericana. 2 edicin, Mxico 1972, pginas, 71a73, 105 a 109, 215 a 225, 386 a 396 4. Todd-Sanford, Diagnstico Clnico por el Laboratorio, Ed. Salvat, 6 edicin, Barcelona Espaa 1978, pgina 513 a 529, 579 a 604, 625 y 653. 5. W. Tietz, Norbert, Qumica Clnica Moderna, Ed. Interamericana, 1 edicin, Mxico 1972, pgina 86 a 96. 6. Willard-Merrit, Anlisis Instrumental, Ed. C.E.C.S.A. 7. Salve, Mara Luisa, et., al. Bioqumica, Editorial Interamericana, 1 edicin, Barcelona, Espaa 1994. 8. Lehninger. Bioqumica, 2 Edicin, editorial Omega, Barcelona 1985, pags. 9. J. Henry/D.C. Cannon/J.W. Winkelman. Qumica Clnica, Tomo I, 2 Edicin, editorial Jims, paginas, 528,529,530 y 531. 10. 11. Iovine Selva. El laboratorio en la clnica, editorial Alhambra, Madird Espaa 1985. Apuntes de Qumica clnica, elaborados por el Q. B .P. Alberto Len Hernndez.

WEBGRAFA: 1. http://www.medicodirecto.com/~temasalud/s01_203.htm#index3 2. http://www.botanica.cnba.uba.ar:80/cgibin/i/monografias/sedimento/images/sto_004.j pg 3. http://es.wikipedia.org/wiki/Colesterol#Estructura_qu.C3.ADmica 4. http://www.urologia.tv/icua/es/diseases.aspx?cod=12 5. http://www.umm.edu/esp_ency/article/001559.htm 6. http://quimicosclinicosxalapa04.spaces.live.com/blog/cns!204AC1C68E772D5!711.en try#category

65