KINETIKA ENZIM

Analisis Rx kimia enzimatik mempunyai beberapa

tujuan 1. Mengetahui karakteristik atau sifat-sifat enzim dalam suatu reaksi enzimatik 2. Meneliti tipe mekanisme kerja serta fungsi enzim 3. Menentukan hubungan antara enzim dengan substrat, serta hubungan antara enzim dengan zat inhibitor

KINETIKA ENZIM
Kinetika enzim merupakan cabang dari ilmu

enzimologi yang mempelajari fungsi-fungsi enzim dalam kecepatan reaksi serta faktor-faktornya. Faktorfaktor tersebut antara lain :

1. Konsentrasi enzim 2. Konsentrasi senyawa ligan termasuk di dalam nya : substrat, produk, inhibitor, aktifator 3. pH lingkungan 4. Kadar ion 5. Temperatur lingkungan

KINETIKA ENZIM
Persamaan MICHAELIS-MENTEN

: Reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim memiliki variasi kecepatan reaksi apabila substrat yang digunakan mempunyai konsentrasi yang berbeda.
Kenaikan [S] akan diikuti peningkatan kecepatan reaksi sampai pada batas tertentu, yang kemudian reaksi tersebut akan mencapai konstan dan akhirnya mencapai titk dengan kecepatan maksimum (Vmax)

Michaelis-Menten
E bereaksi dengan S membentuk kompleks ES.
Kemudian ES akan mengalami peruraian baik menjadi

E dan S kembali atau membentuk sutu produk (P). Model :

E+S

ES

E+P

E+S

k1 k2

k3

ES

E+P

rapid reversible reaction

slow irreversible reaction

Laju konversi substrat menjadi produk (S P): V = k3 [ES] (1)

 Berdasarkan reaksi di atas dapat diasumsikan bahwa

senyawa produk tidak akan berubah kembali menjadi substrat (S). Tititk tolak yang digunakan ialah bahwa laju katalisis sama dengan hasil perkalian konsentrasi kompleks ES dengan K3 V = K3 [ES] (1) [ES] harus dinyatakan dalam kuantitas jumlah yang telah diketahui. Jaju pembentukan dan laju pemecahan ES diketahui dari :

Laju pembentukan ES = K1 [E] [S] ..(2) Laju pemecahan ES = (k2+k3) [ES] (3)

 Dalam keadaan seimbang (steady state), konsentrasi

Zat antara [ES] tidak berubah, karena proses kecepatan pembentukan ES akan sama dengan proses kecepatan peruraian ES, sedangkan konsentrasi senyawa awal [S] dan konsentrasi produk [P] berubah. Dengan demikian : Laju pembentukan ES = laju pemecahan ES K1 [E] [S] = (K2+K3) [ES] (4) Dari persamaan tersebut, [ES] dapat dihitung : [E] [S] [ES] = (5) (K2+K3)/K1

 Persamaan ini dapat disderhanakan dengan

memasukkan suatu tetapan baru, yaitu Km atau tetapan Michaelis : konsentrasi substrat yang menyebabkan kecepatan reaksi sama dengan separuh kecepatan maksimum. Dirumuskan :
K2 + K3

Km =
K1

.(6)

maka [E] [S] [ES] = Km .(7)

 Jika konsentrasi enzim jauh lebih kecil dari pada

konsentrasi substrat ( [E] <<<<[S]), konsentrasi substrat yang tidak terikat [S] hampir sama d engan konsentrasi substrat seluruhnya. Konsentrasi E yang tidak terikat [E] = konsentrasi total enzim [ET] dikurangi konsentrasi [ES], maka persamaam menjadi : [E] = [ET] [ES]..(8) Maka
([ET]-[ES]) [S] [ES] = Km [S] /Km [ES] = [ET] 1 + [S]/Km .(10) .(9)

 Atau

[S]
[ES] = [ET] [S] + Km ..(11)

Jika persamaan ini dimasukkan ke dalam persamaan (1) Untuk menggantikan [ES] V = K3 [Es] [S] V = K3 [ET] ..(12) [S] + Km

 Kecepatan maksimum V max dicapai bila seluruh situs

aktif enzim jenuh dengan substrat, artinya bila [S] jauh lebih besar daripada Km. Akibatnya [S]/([S]+Km) mendekati 1 (satu), sehingga : V max = K3 [ET] .(13)
Bila persamaan (13) dimasukkan ke dalam persamaan

(12) diperoleh PERSAMAAN MICHAELIS-MENTEN Vmax. [S] V = .(14) [S] + Km

Persamaan ini menerangkan grafik ketergantungan suatu kecepatan reaksi terhadap konsentrasi substrat. Kecepatan awal V merupakan fungsi dari konsentrasi substrat [S] dari suatu reaksi enzimatik yang juga merupakan inetika Michaelis-Menten. Satuan V adalah jumlah produk yang dihasilkan (mmolatau mol, dsb.) atau jumlah substrat yang mengalami perubahan per menit. Sedang satuan [S] adalah mmol atau mol/liter

 Dari persamaan (14) bila [S] jauh lebih rendah dari Km,

maka kecepatan awal V mempunyai hubungan yang kuat dengan konsentrasi substrat [S], maka V max. [S] V = ..(15) Km Pada konsentrasi substrat yang tinggi, sehingga [S] jauh lebih tinggi dari nilai Km maka : Vmax. [S] V = .(16) [S] V = V max. .(17)

Bila [S] = Km , maka V = Vmax. (18)

 Penentuan kecepatan awal (V) Kecepatan awal suatu reaksi (V) dapat dihiunt secara kuantitatif dengan mengukur jumlah produk yang dihasilkan atau jumlah sisa substrat yang tidak bereaksi pada berbagai waktu inkubasi. Kecepatan awal merupakan koefisien arah dari garis lurus pada grafik antara konsentrasi produk atau konsentrasi sisa subsstrat dengan waktu inkubasi.
Kecepatan awal dapat dihitung dengan jalan mengambil sampel pada

waktu yang berbeda setelah penambahan enzim. Untuk mendapatkan sampel dengan variasi waktu inkubasi yang berbeda, maka reaksi enzimatik harus dihentikan seawal mungkin setelah pengambilan sampel. Reaksi dapat dihentikan dengan beberapa cara : 1) Mendidihkan 2) Menambah senyawa asam/basa 3) Menambahkan alkohol

 PENTINGNYA Km

Nilai Km memepunyai hubungan dengan konsentrasi substrat di dalam sel. Jika [S] di dalam sel <<< dari nilai Km, maka kecepatan awal (V) akan sensitif bila terjadi perubahan [S], sebalikknya jika [S]>>> dari nilai Km maka V tidak sensitif terhadap adanya perubahan konsentrasi substrat yang rendah. 2. Oleh karena nilai Km tetap, maka nilai tersebut dapat digunakan untuk membandingkan Antara enzim
1.
dari organisme berbeda Dari sel atau jaringan yang berbeda dalam satu

organisme Dari satu sel atau jaringan yang sama pada fase pertumbuhan yang berbeda

3. Perubahan nilai Km karena pengaruh suatu senyawa

ligan (ligan-induced) dapat digunakan sebagai model dalam proses pengaturan enzim 4. Dengan mengetahui niai Km,maka dapat mengetahui metode analisis berikutnya, jika konsentrasi substrat [S]>>> Km, maka dengan menghitung V max sama dengan menghitung nilai konsentrasi enzim total [ET]. Nilai Konstanta Michaelis -Menten memberikan pengertian terhadap kesesuaian antara substrat dengan enzim. Hal ini berarti bahwa substrat dengan nilai Km terendah mempunyai aktifitas tinggi terhadap enzim. Susbstrat mempunyai reaksi terbaik dengan enzim apabila rasio Vmax/Km tinggi.

 Menentukan nilai Km (konstanta Michaelis dan

Vmax
Gambar grafik dari data V pada beberapa konsentrasi

substrat [S] akan membentuk grafik dengan tipe hiperbola. Melalui gambar tersebut ternyata mengalami kesukaran dalam menghitung nilai Vmax dan kecepatan awal V saat (pada) kondisi konsentrasi substrat sama dengan Vmax, pada titik tersebut sering dikenal sebagai nilai Km. dengan demikian untuk mempermudah perhitungan nilai konstanta pada reaksi enzimatik, data yang didapat sebaiknya diplotkan dengan didasarkan pada persamaan garis lurus. Perubahan ini diperoleh dengan membalikkan kedua ruas daripersamaan (14)

Vmax .[S]

=
[S] + Km

1 KM 1 1 vo Vm ax [ S ] Vm ax

y = m x + b
Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2007.) Biochemistry. (6th ed.) New York: W.H. Freeman and Company.

Penghambatan aktifitas enzim oleh inhibitor

Inhibitor Kompetitif yang menempel pada renzim menghasilkan reaksi
E S ES E P
k 1 k 2 k1 k2

E I EI
k3

k3

Penambahan EI menurunkan konsentrasi enzim bebas :

[ E ]tot [ E ] [ ES ] [ EI ]
[ E ]tot [ ES ] [E] 1 K I [I ]
20

Compared to the formula for the unihibited enzyme

k 2 [ E ]tot [ S ] vmax[ S ] d [ P] v k 2 [ ES] k k 2 [S ] K M dt [ S ] 1 k1

v m ax k 2 [ E ]tot
KM k 1 k 2 k1

the apparant KM increases: k 2 [ E ]tot [ S ] vmax[ S ] d [ P] v k 2 [ ES] k k2 [I ] [I ] dt ) [ S ] 1 (1 ) [ S ] K M (1 KI k1 KI

Tradditionally, KI is defined as a dissociation constant
KI k 3 k3

21

Competitive inhibitors compete with the substrate for an enzymes active site.

Figure 7.08 Competitive enzyme inhibition.

INHIBITOR KOMPETITIF MENGUBAH KM TETAPI TIDAKMENGUBAH Vmax

A LineweaverBurk plot for competitive inhibition.

Competitive inhibitor alters KM but not Vmax

Figure 7.10.

Enzyme Inhibition
product, dead-end substrate inhibited enzyme Competitive inhibition (C): A competitive inhibitor is a substance that combines with free enzyme in a manner that prevents substrate binding. Thats, the inhibitor and the substrate are mutually exclusive, often because of true competition for the same site. 1/

[I]

1/A Slope change only Vmax is the same

Competitive inhibition (C):

Active site of enzyme

Substrate

Inhibitor

Products

Substrate and inhibitor can bind to the active site

Inhibitor prevents binding of substrate

Mixed inhibition, where the inhibitor does not compete with the substrate for the active site, but binds elsewhere on the enzyme, causing a conformational change that makes the active site less efficient.

A mixed inhibitor typically alters both Vmax and KM.

Figure 7.12.

Enzyme Inhibition
Uncompetitive inhibition (UC): A classical UC inhibitor is a compound that binds reversibly to the enzyme-substrate complex yielding an inactive ESI complex. The I does not bind to free enzyme. K1 K2 K3

1/

E + S

ES + I

P + E

[I] KI 1/S Intercept change Slope is the same ESI

NO REACTION

Enzyme Inhibition
Noncompetitive inhibition (NC): A classical NC inhibitor has no effect on substrate binding and vice versa, S and I bind reversibly, randomly and independently at different sites.

1/

[I] 1/S Slope change Intercept change

Active site

Noncompetitive inhibition (NC):

Binding of inhibitor distorts the enzyme Inhibitor site

In the absence of inhibitor, products are formed

Substrate and inhibitor can bind simultaneously

The presence of the inhibitor slows the rate of product formation

Effects of Inhibitors on Michaelis-Menten Reactions

Type of Inhibition Michaelis-Menten Equation Lineweaver-Burk Equation Effect of Inhibitor

None

VmaxA
Km + A VmaxA Km + A VmaxA Km+ A VmaxA Km+ A

Km
VmaxA

1
Vmax

None

Competitive

Km VmaxA

1 Vmax

Increase Km
Decrease Km and Vmax Decrease Vmax; may increase or decrease Km

Uncompetitive

Km VmaxA

Vmax

Noncompetitive

Km VmaxA

Vmax

= 1 + [I]/KI

= 1 + [I]/K'I