KULTUR JARINGAN & biosintesis

FAR 5222 (2 SKS)

JURUSAN BIOLOGI
FMIPA UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI

PENDAHULUAN
Potensi sel somatik = sel zigotik

Embrio Somatik Tanaman Utuh/Lengkap
(Embriogenesis Somatik)
Teknik Kultur Jaringan utk merealisasikannya
Muir Nicotiana tabacum, Steward Daucus carota
Aplikasi :
- penelitian : morfogenesis, regenerasi, fisiologis, biokimia, genetika
- bisnis : agro-industri, nursery, produksi metabolit sekunder
(farmasi)
Perbanyakan vegetatif modern
- hemat waktu, ruang, tenaga, biaya
- hasil beribu-ribu bahkan berjuta-juta
- sifat anakan pasti sama dgn induk
- memungkinkan dilakukan perbaikan sifat (pemuliaan)
Pelaku msh terbatas kalangan ilmuwan instansi terkait & akademisi
PT
PENGERTIAN
Kultur Jaringan : metode mengisolasi bgn tanaman (protoplasma, sel,
sekelompok sel, jaringan & organ), menumbuhkannya dlm kondisi
aseptik (suci hama) pd medium budidaya mprbnyk diri &
bregenerasi tanaman lengkap kembali.

PRINSIP DASAR
1. Sel bersifat autonom mampu atur rumah tangga sendiri
maksudnya melakukan metabolisme utk hidup/bereproduksi.
Schleiden & Schwan (1938)
2. Totipotensi kemampuan sel tumbuhan (baik sel somatik maupun
sel gametik) untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap
kembali, jika kondisinya sesuai.
Dibuktikan o/ White (1930) stlh ditemukan auksin (IAA)
3. Regenerasi organ & akar in vitro dikontrol scr hormonal O/ ZPT
Miller & Skoog (1957) nisbah sitokinin-auksin > 1 : pmbntkn pucuk
sitokinin-auksin = 1: pmbntkn kalus
sitokinin-auksin < 1: pmbntkn akar
- sitokinin merangsang pembentukan tunas adventif & aksiler
- auksin cenderung merangsang perakaran
4. Kompeten, dediferensiasi, determinasi
- penting dimiliki eksplan agar dpt organogenesis/embriogenesis
- kompeten : mampu merespon sinyal lingkungan & hormonal
- bntk tanggapan pemograman diri ke arah organo/embriogenesis
- prosesnya disebut jg induksi (inductive event) atau inisiasi
dimulai pmbntkn jar penutup luka (kalus).
- dediferensiasi : berubahnya sel-sel eksplan yang tadinya sudah
terspesialisasi menjadi tidak terspesialisasi dan kembali ke
kondisi meristematik (kebalikan diferensiasi).
- determinasi : sel-sel atau jaringan terus berkembang menjadi
organ atau embrio, walaupun diletakkan di lingkungan baru
yang bebas dari signal penyebab organogenesis atau
embryogenesis. Disebut jg proses development.
Eksplan : bagian kecil dari tanaman (sel, jaringan atau organ) yang
digunakan untuk memulai suatu kultur.
Syarat eksplan : hrs msh muda (parenkim korteks, empulur, tunas,
kotiledon, polen, mesofil daun.

Planlet : tanaman regenerasi hasil teknik kultur jaringan
langsung or tdk langsung (bntk kalus dulu).
Planlet dihasilkan by 2 proses :
1. Organogenesis : diferensiasi meristem unipolar hasilkan pucuk
batang (caulogenesis) atau pucuk akar (rhizogenesis). Tahap
pertama biasax caulogenesis kedua rhizogenesis.
2. Embriogenesis Somatik : diferensiasi meristem bipolar yang
berupa bakal tunas dan akar. Tahap perkembangan embrio spt
embrio zigotik globular, jantung, torpedo, kotiledon.
1
2
TUJUAN & MANFAAT KULTUR JARINGAN
1. Perbanyakan bibit
hemat waktu, ruang, tenaga, biaya, bebas hama, hasil banyak
contoh : bibit anggrek
2. Produksi metabolit sekunder
bahan baku obat sel-sel dimanipulasi mbntk met. Skndr
melakui kultur suspensi sel atau kalus
3. Dptx hibrida2 baru by silangan somatik
fusi protoplas persilangan intergenetik no problem !!!
4. Produksi tanaman haploid & double haploid (galur homozigot)
by kultur anther, ovul or mikrospora/polen tanaman mini
5. Penyimpanan plasma nutfah
by pertumbuhan minimal dan kriopreservasi
6. Penyelamatan embrio anggrek, hsl silangan intergenetik
7. Induksi keragaman somaklonal
8. Mrekayasa genetik radiasi, bhn kimia mutagen tnmn transgenik
9. Menunjang penelitian penyakit tnmn interaksi dg nematoda, fungi,
bakteri, mikoriza.
SKEMA PROSES KULTUR JARINGAN
a
b
b
c
1
2
3
Keterangan :
1 : inisiasi/induksi
2 : organogenesis
3 : aklimatisasi
a : tanaman induk
b : eksplan
c : planlet
FASILITAS & PERALATAN TEKNIS
Syarat teknik KJT:
aseptik (ruang, bahan, alat, prosedur kerja).

Aseptik bebas kontaminasi mikroorganisme
atau organisme yg tdk diharapkan.

Ruang kerja (lab) dibagi2 & diatur sedemikian rupa
shg, terpisah tp mash tetap saling berhub. & mudah
dicapai jg disesuaikan dg prosedur kerja.

Laboratorium tdk hrs baru tp yg terbaik pendirian lab
yg baru.
MEMILIH LOKASI LABORATORIUM
Hal-hal yg perlu diperhatikan :

Tdk berlokasi di daerah berdebu.
Tdk berlokasi di daerah berangin kencang.
Daerah tdk terlalu kering (langka sumber air).
Tdk dkt tempat pembuangan sampah.

Lokasi terbaik lingkungan bersih, bebas polusi, tanpa
keterbatasan air bersih, lengkap
sarana transportasi dan utilities (air,
gas & listrik) yg memadai.

Syarat Ruangan :

Tertutup rapat (tanpa ventilasi)
negara kita tropis banyak debu & sulit dihindari.
Dipasang pengatur temperatur udara (AC)
(25 28C).
Dipasang Exhauter utk menyedot debu dlm
ruangan.
Lantai & dinding dr porselen spy mdh dibersihkan.
Bebas hewan kecil & insekta.
Pekerja hrs bersih (alas kaki dilepas, pakai jas
lab, pakaian bersih, badan bersih).
MENDESAIN LABORATORIUM
Teknik KJT tahapan2 kerja khusus.
Desain lab diatur sedemikian rupa spy tingkatan
sterilitas ruangan sesuai dg tahapan kerja.
Penataan didasarkan :
Pdtahap-tahap prosedur & alat-alat yg dibutuhx

Tahap-tahap :
1. Persiapan
2. Inokulasi (isolasi/penanaman)
3. Inkubasi (pemeliharaan) & penyimpanan kultur
4. Aklimatisasi
RUANG PERSIAPAN
Persiapan eksplan :
Pencucian
Pemotongan/pembuangan bgn2 tnmn
yg tdk dipakai.
Perlakuan awal sterilisasi

Persiapan medium :
Penimbangan bhn kimia medium
Pembuatan larutan stok
Pengenceran & peracikan medium
Penuangan dlm wadah kultur
Sterilisasi

Persiapan alat :
Persiapan & sterilisai alat2 diseksi
(autoklaf/oven) & LAFC/entkas (UV
light atau alkohol 70%).
RUANG INOKULASI
Ruang ini mutlak hrs steril
Kegiatan meliputi :
Sterilisasi
Isolasi bagian2 tnmn
Penanaman eksplan dlm medium
Kegiatan subkultur
Sterilisasi medium dg
ultrafiltrasi
Ruangan dilengkapi :
Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Tempat cuci tangan
Pengatur suhu (AC)
Lampu ultraviolet & TL
Ruang ini hrs terisolir tp msh bs
brhub dg ruang stok, inkubasi,
mikroskop.
Pintu penghubung usahax selalu
tertutup.
RUANG INKUBASI (KULTUR)
Ruangan ini cukup besar.
Tdk mutlak steril
Hindari keluar-masuk org
Terdiri dr rak-rak kultur bertingkat.
Rak dilengkapi lampu fluorescent.
Jarak tiap tingkat 40 50 cm
Lingkungan fisik (suhu & cahaya)
diatur sedemikian rupa.
Kualitas cahaya (lampu fluorescent)
Intensitas cahaya (1000 4000 lux)
Lama penyinaran (14 16 jam) dg
alat automatic timer switch
Temperatur diatur dg AC (25
28C)
jk lbh dingin gunakan growth
chamber
RUANG MIKROSKOP
Utk pengamatan
(morfologi/anatomi) & analisa
selama kultur berjalan.

Diperlukan :
Mikroskop binokuler
(stereoscope)
Mikroskop fase kontras
(inverted)
Fluorescent microscope yg
dilengkapi fotografi.
Micro-manipulator (utk micro-
injection DNA or organel ke dlm
sel/protoplas)
Ruangan: kering, bersih, meja dr
beton utk meletakan mikroskop.
RUANG AKLIMATISASI
Aklimatisasi :
Tahapan dmn planlet/tunas mikro
dipindahx ke lingkungan luar botol
(rumah kaca, rumah plastik,
screenhouse).

Tujuan rumah kaca : utk meletakx
pot-pot bibit tanaman baik yg akan
dijadix eksplan atau bibit hasil
perbanyakan kultur jaringan yg siap
dijual or dipelihara sendiri.

Lokasi : di luar laboratorium tapi tdk
jauh dr laboratorium.
PENGELOMPOKKAN RUANGAN MENURUT SIFAT &
PERSYARATAN RUANG-RUANGNYA :
A. RUANG TIDAK STERIL

1. Ruang tamu
2. Ruanga administrasi
3. Runag staf
4. Kamar mandi & WC
5. Ruang ganti pakaian
6. Ruang penyimpanan bahan
kimia dan alat-alat dr gelas
7. Ruang preparasi
8. Ruang penimbangan &
sterilisasi
9. Rumah kaca (green house)
B. RUANG TIDAK MUTLAK
STERIL

Ruang ckp bersih & tdk berdebu,
lantai & dinding tdk perlu
disterilx dg alkohol.
Hrs dipasang AC, jendela trtutup
rapat & lingkngn terkontrol.
1. Ruang planlet/kultur
2. Ruang inkubator : lbh steril dr
ruang kultur u pengamatan yg
intensif.
3. Ruang shaker : utk kultur
suspensi sel dr kalus dlm media
cair.
C. RUANG MUTLAK STERIL
1. Ruang isolasi/transfer/tanam.
Ukuran kecil 2 x 3 cm
2
agar sterilisasi mudah.

Dinding dr porselen spy mdh disterilx dg alkohol 90%
Lantai dr porselen disterilx dg alkohol 90% or phenol.

2. Alat Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)
Diletakkan di salah satu sisi ruang isolasi.
Disebelah kanan LAFC ada meja utk nyimpan alat2
tanam
Sediax meja dorong utk angkut alat & media sekaligus
Pasangkan lampu UV utk sterilisasi.
Dan lampu neon utk bekerja.
Pintu dilengkapi jendela kaca.

R7
Ruang Administrasi
R1
Ruang Persiapan
R8
Ruang Cuci
R2
Ruang Timbang
R3
Ruang Stok
R5
Ruang Mikroskop
R4
Ruang Steril/transfer
R
6

R
u
a
n
g

I
n
k
u
b
a
t
o
r
/
k
u
l
t
u
r

DENAH UMUM LABORATORIUM KULTUR JARINGAN
MEDIUM KULTUR JARINGAN
Media kultur salah satu penentu keberhasilan baik
jumlah maupun perbandingan komponen2x.
Pemilihan jenis media trgantung tujuan, selera, jenis
tnmn.
Komposisi media dirancang khusus tujuan yg brbeda.
Pd dasarx tdk ada satu macam media kultur yg mampu
memberikan pertumbuhan optimal utk semua sel,
penggantian medium atau salah satu komponen medium
seringkali diperlukan.
Utk mengembangkan atau memodifikasi medium kultur
diperlukan studi literatur dan/atau brdasarx
trial and error.
KOMPONEN DASAR MEDIUM KULTUR
Tumbuhan di alam bebas bersifat autotrof memerlukan air & garam
mineral dlm tanah serta CO
2
dr udara melalui fotosintesis.
Tanaman kultur in vitro sedikit or banyak kehilangan sifat autotrofx.
Oleh krn itu nutrisi yg diperlukan jauh lebih kompleks, spt penambahan
gula, ZPT, vitamin, asam amino.
Cahaya dlm kultur hanya mengandalkan pd lampu neon.
Eksplan or tanaman dlm botol tdk or sedikit punya akar.
Penyerapan air berikut nutrisi yg terlarut di dlmnya scr difusi & osmosis
melalui sel-sel eksplan yg kontak dg permukaan media.
Media kultur tersusun atas bbrp atau seluruh komponen berikut :
a. garam-garam anorganik (makro & mikro)
b. zat-zat organik (gula, mio-inositol, vitamin, asam amino, ZPT
c. substansi organik kompleks (air kelapa, ekstrak ragi & buah-2an)
d. bahan pemadat (agar)
e. arang aktif
A. GARAM-GARAM ANORGANIK
1. Unsur Makronutrien (C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg)
Dasar pembuatan dari medium hidroponik.
Unsur-unsur hara diberikan dlm bentuk garam-garam anorganik.
Konsentrasi optimum tiap2 komponen utk capai pertumbhn
maksimum sangat bervariasi berkisar 25 60 mM (Gamborg &
Shylluk, 1981).
Unsur makro diperlukan dlm jumlah cukup besar, antara lain :
KNO
3
, NH
4
H
2
PO
4
, K
2
SO
4
, CaCl
2
.2H
2
O, MgSO
4
.7H
2
O dll
Komponen terbesar sebenarnya air (95% media).
Fungsi air : bhn pembentuk material tubuh, medium utk reaksi2
kimia & fsika, transport & distribusi zat-zat yg terlarut di dlmx.
Kualitas air hrs tinggi & murni biasanya akuades, akuabides.
Didapat dg alat penyulingan (water distilator), bisa jg dg deionizer.
Air sumur or ledeng tdk bisa krn ada kontaminasi bhn anorganik,
organik atau miroorganisme.
Nitrogen (N)
Penyusun asam nukleat, protein, klorofil, alkaloid, derivat purin,
pirimidin, hormon endogen, koenzim.
Lebih berperan pd pertumbuhan vegetatif.
Diserap dlm bentuk ion ammonium (NH
4
+
) dan Nitrat (NO
3
-
)
Konsentrasi ion NH
4
+
berkisar 2 8 mM, ion NO
3
-
( 25 40 mM).
Persenyawaan : KNO
3
, NH
4
NO
3
, Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, NH
4
Cl dll

Fosfor (P)
Dlm bntk persenyawaan : K
2
HPO
4
, NaH
2
PO
4
, NH
4
H
2
PO
4
Diserap dlm bentuk ion PO
4
-
dg konsentrasi berkisar 0,5 20 mM/l
Fungsi sbg pmbntk senyawa RNA, DNA, aktivator enzim.
Berperan terutama saat pertumbuhan benih, pembungaan,
pemasakan buah & biji.
Kelebihan unsur P dpt menghambat akibat kompetisi penyerapan dg
unsur lain spt Zn, Fe dan Cu.

Kalium (K)
Diberikan dlm bntk KNO
3
, KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
, KCl, K
2
SO
4
.
Diserap dlm bntk ion K
+
berkisar 1,8 25 mM/l.
Utk memacu pembelahan sel, sintesa karbohidrat, protein,
pembuatan klorofil, mereduksi nitrat, melancarkan metabolisme.
Peranan utama sbg pengatur hidratasi sel, shg mempengaruhi
keluar masuknya nutrient ke dlm sel.

Sulfur (S)
Diberikan dlm bntk : MgSO
4
.7H
2
O, (NH
4
)
2
SO
4
, K
2
SO
4
, FeSO
4
dll
Pemberian berkisar 0,75 3 mM/l.
Diserap dlm bentuk ion SO
4
2-
Fungsi : penyusun protein, asam amino, vitamin B1, koenzim
berperan dlm pembentukan bintil akar
ketahanan & proteksi tubuh tumbuhan.
Calsium (Ca)
Diberikan dlm bentuk : Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.2H
2
O, Ca(PO
4
)
2
Pemberian ion Ca
+
berkisar antara 1 3 mM/l
Fungsi : pembentukan dinding sel (Ca pektat), sbg kation selular,
kofaktor enzim, pengaruhi hidratasi, permeabilitas & penyerapan
nutrisi, mempengaruhi tingginya pH, menetralisir racun dlm bntk Ca
oksalat.
Fungsi umum : merangsang pembentukan bulu-bulu akar,
mengeraskan batang & merangsang pembentukan biji krn Ca
bersama2 Mg memproduksi cadangan makanan.

Magnesium (Mg)
Diberikan dlm bentuk MgSO
4
.7H
2
O
Fungsi : elemen utama pmbntkn klorofil, aktivator enzim,
meningkatkan kandungan fosfat.

2. Unsur Mikronutrien : Cl, B, Mo, Mn, Zn, Cu, Fe & Co
Diperlukan dlm jumlah sedikit
Fungsi blm diketahui pasti, namun ketiadaannya menyebabkan
kelainan pertumbuhan.
Contoh : pemberian Fe dan Mn menyebabkan perkecambahan
anggrek sangat baik.
Air atau bahan kimia yg tingkat kemurniannya rendah seringkali
terkontaminasi oleh unsur hara mikro.

Besi (Fe)
Diperlukan sedikit lebih banyak drpd unsur mikro lainnya.
Diberikan dlm bentuk kelat dengan senyawa NaEDTA.
Tujuan agar tetap pd jaungkauan pH yg luas dlm jangka waktu yg
lama sehingga dpt diserap oleh jaringan.
Fungsi : sintesis klorofil, konversi energi pd fotosintesis & respirasi
(bagian dr molekul sitokrom).
Diberikan dlm bentuk : FeCl.6H
2
O, NaFeEDTA.2H
2
O, Fe(SO
4
)
3

Boron (B)
Diberikan dlm bentuk asam borak (H
3
BO
3
).
Fungsi : translokasi karbohidrat, diferensiasi seluler & perkembangan,
sbg aktivator & inaktivator zat pengatur tumbuh.
Kekurangan zat ini dpt meningkatkan ZPT yg akhirx menghambat
pertumbuhan.

Molybdenum (Mo)
Diberikan sbg sodium molibdat (Na
2
MoO
4
.2H
2
O).
Berperan dlm konversi nitrogen ke ammonia & fiksasi nitrogen, ikut
dlm metabolisme protein, sintesis asam askorbat, kofaktor enzim.

Mangan (Mn)
Dlm bentuk MnSO
4
Fungsi : sbg komponen esensial pd membran kloroplas, aktifator
enzim sbg perantara proses fosforilasi atau sbg gugus redoks Mn
2+
,
bahan pembentuk klorofil, metabolisme protein, pmbentukn vitamin C.

Cobalt (Co)
Dlm bentuk Cobalt Chloride (CoCl
2
)
Fungsi : elemen vitamin B kompleks, penting dlm fiksasi nitrogen.

Zincum (Zn)
Dlm bentuk Zinc sulfat (ZnSO4).
Fungsi : aktivator enzim, penyusun klorofil, pemacu pembentukan
ZPT terutama IAA.

Curprum (Cu)
Dlm bentuk Cupric sulfat (CuSO4.5H2O).
Fungsi : bagian dr enzim, komponen fenolase, laktase, askorbat
oksidase, ikut berperan dlm fotosintesis & reduksi nitrit.

Chlorin (Cl)
Dlm bentuk Calcium Chlorida (CaCl2)
Berperan dlm aktifitas enzim & memacu fotosintesis.

B. ZAT-ZAT ORGANIK
Senyawa yg mengandung unsur karbon.
Biasanya disintesis sendiri oleh tanaman.
Tapi krn eksplan berukuran sangat kecil tdk mampu mensintesis
sendiri shngga hrs ditambahkan pd medium kultur.

Gula
Kultur in vitro blm sempurna dlm berfotosintesis shg perlu tambahan
gua dlm medium kultur.
Fungsi : sumber energi, bahan pembangun struktur tubuh, penjaga
keseimbangan potensial osmotik dlm medium.
Diberikan dlm bentuk sukrosa (gula pasir), gluktosa, maltosa,
fruktosa tp harga sangat mahal dg hasil tdk selalu lbh baik dr
sukrosa.
Konsentrasi yg diperlukan sekitar 1 5% (10 50 g/l).
Sukrosa lebih berpengaruh dlm perkembangan kalus.
Maltosa lebih baik utk kultur mikrospora krn dpt memicu
embriogenesis.
Myo-Inositol
Gula alkohol (heksitol).
Terbukti mampu merangsang pertumbuhan jaringan yg dikulturkan.
Berperan pula dlm bbrp reaksi metabolik yg berhubungan dg pembelahan
sel, sbg perantara pd perubahan glukosa menjadi asam galaktironat yg
mrpkn prazat utk pektin & penyusun dinding sel.
Digunakan pd kisaran konsentrasi 100 5000 mg/l.

Vitamin
Fungsi : mempercepat pertumbuhan & diferensiasi kalus, sbg kofaktor atau
bagian kofaktor dr reaksi2 enzimatis penting, sbg senyawa protektif
(antioksidan).
Thiamin : mempercepat pembelahan sel, konsentrasi 0,1 30 mg/l
Nicotinic acid : prekursor bbrp alkaloid.
Asam askorbat (antioksidan): mencegah pencoklatan pd permukaan irisan
jaringan akibat oksidasi polifenol menjadi kuinon yg berwarna coklat.
Vitamin E (tocopherol) : merangsang pembentukan kalus friabel dlm kultur
embrio jagung, merangsang dispersi sel pd kultur suspensi sel kedelai.
Asam-asam Amino
Sumber N organik yg lebih cepat diambil sel drpd N-anorganik dlm
medium yg sama.
Jenisnya : glutamin, glisin, L-sistein, L-arginin, L-metionin dll.

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT)
Diperlukan sbg komponen pertumbuhan, perkembangan &
diferensiasi.
ZPT aktif pd konsentrasi rendah, diproduksi sendiri dlm sel
(endogen).
Perimbangan ZPT endogen dg eksogen turut menentukkan arah
perkembangan suatu kultur.
Tanpa ZPT pertumbuhan keksplan sangat lambat bahkan mungkin
tdk tumbuh sama sekali.
Dikelompokkan dlm bbrp grup :
auksi, sitokinin, gibberelin, absscisic acid & ethylene.
Auksin

Peranan : mempengaruhi pemanjangan sel, pembelahan sel,
diferensiasi jaringan faskuler, inisiasi pembentukan akar dll.
Lokasi sintesis : primordial daun (apeks pucuk), daun muda &
kecambah.
Prekursor : asam amino triftopan.
Pengangkutan : dr sel ke sel scr basipetal (dr pucuk ke akar).
Ada Auksin alami : IAA (Indol Acetic Acid)
kelemahan : mudah rusak oleh cahaya, oksidasi enzimatik &
pemanasan pd proses sterilisasi.
Ada auksin sintetik : 2,4-D, NAA, IBA.
Pemilihan jenis auksin tergantung :
1. Pertumbuhan yang dikehendaki
2. Level auksin endogen
3. Kemampuan jaringan mensintesa auksin
4. Golongan zat tumbuh lain yg ditambahkan
Sitokinin

Sitokinin akan aktif apabila ada auksin.
Peranan : memacu pembelahan sel & morfogenesis, memicu
pertumbuhan kuncup lateral (mematahkan dominasi apikal),
perkembangan daun, menghambat penuaan daun, mempengaruhi
perkembangan kloroplas.
Prekursor : adenin
Lokasi sintesis : ujung akar & biji yg sedang tumbuh.
Pengangkutan : kebalikan auksin (akropetal) melalui xilem.
Jenis sitokinin : alami spt kinetin dan zeatin.
sintetik spt BAP (6-benzylaminopurin), Thidiazuron.
Manipulasi rasio auksin : sitokinin dpt mempengaruhi organogenesis
auksin/sitokinin tinggi pembentukan akar
auksin/sitokinin seimbang pembentukan kalus
auksin/sitokinin rendah pembentukan tunas

Gibberellin (GA)
Gibberellin banyak macamnya (34) tp yg biasa dipakai GA3.
Disintesis : pd embrio, jaringan muda tunas, biji yg brkecambah.
Prekursor : asam mevalonat.
Pengangkutan : dlm xilem dan floem.
Peranan : pertumbuhan batang, pembesaran& pembelahan sel, induksi
perkecambahan biji, produksi enzim selama perkecambahan &
pembungaan, memicu pembentukan akar krn GA memicu produksi auksin
endogen.

Asam Absisat (ABA) & Etilene
Prekursor ABA: asam mevalonat, disintesis pd daun2 tua.
Peranan ABA: respon thd stress air, penutupan stomata & transpor
fotosintat ke arah biji yg sedang tumbuh.
Transpor : melalui floem menuju akar, kembali ke pucuk by xilem.
Etilen berupa gas, prekursor dr metionin, disintesis dlm jaringan yg alami
penuaan, pengangkutan scr difusi.
Peranan : membebaskn dormansi, pembentukan akar adventif, diferensiasi
tunas, pemasakan buah, induksi pembungaan.
C. SUBSTANSI ORGANIK KOMPLEKS
Antara lain : pepton, casein
hydrolisat, ekstrak ragi, ekstrak
macam2 tanaman (air kelapa,
endosperm jagung, tomat, pisng,
kentang dll).
Komposisinya belum diketahui scr
pasti.
Peranan : sumber gula, vitamin,
ZPT, asam amino.
Kadar yg terlalu tinggi timbulkan
penghambatan, shg hrs ada uji
pendahuluan dg interval 1 5 g/l.
Air kelapa 2 5% .
Zat-zat ini dihindarkn utk penelitian
krn kadar tdk jelas, respon tnmn
tidak pasti, hasil tdk dpt diulang.
D. BAHAN PEMADAT
Berupa agar-agar (7 10 g/l), baik yg biasa, agarose atau gelrite
(polisakarida dr bakteri).
Jangan terlalu padat sbb akan mnghambat difusi senyawa jg terlalu
encer sbb eksplan akan tenggelam.
Keuntungan pemakaian agar :
1. agar membeku pd suhu 45C dan mencair pd 100C.
2. Tdk dicerna oleh enzim tanaman.
3. tdk bereaksi dgn senyawa2 penyusun media.
Kelemahan pemakaian bahan pemadat :
1. Hanya sebagian eksplan kontak dg medium
2. Terjadi gradien nutrisi yg tdk sama
3. Mobilitas hara kurang baik
4. Terjadi akumulasi zat-zat toksik yg dikeluarkn oleh eksplan.
E. ARANG AKTIF
Arang aktif adl arang yg sdh dipanaskan selama beberapa jam dgn
menggunakan uap atau udara panas.
Memiliki daya absorpsi yg kuat.
Dpt ditambahkan pd media inisiasi, regenerasi, atau perakaran.
Kisaran konsentrasi 0,5 6 % trgantung tujuan.
Fungsi :
1. Mengadsorpsi senyawa2 toksik dlm media (fenolik).
2. Mengadsorpsi ZPT shgga mencegah pertumbhn kalus yg tdk
diinginkn, membantu emriogenesis kultur dlm media tanpa auksin
dg cara menarik auksin endogen, merangsang perakaran dgn
cara mengurangi tingkat cahaya.
Tambahan Penting :
pH yg dibutuhkan dlm media kultur sekitar 4,5 5,8, diatur dg pH
meter atau kertas indikator dgn penambahan NaOH 1M dan HCl
1M, dilakukan sblm sterilisasi media
BEBERAPA JENIS MEDIUM DASAR
Jenis-jenis medium dasar diberi nama sesuai nama penemunya
1. Medium Murashige & Skoog (MS) thn 1962
medium paling populer, bisa digunakan utk hampir semua jenis
tanaman terutama herba. Punya kandungan garam2 yg tinggi.
2. Medium Gamborg (B5) thn 1968, utk kultur suspensi sel kedelai,
alfalfa & legume lain.
3. Medium White (W63) thn 1963, utk kultur akar memiliki kandungan
garam2 dg konsentrasi rendah.
4. Medium Vacint & Went (VW) thn 1949, utk kultur embrio anggrek.
5. Medium Nitsch & Nitsch, utk kultur mikrospora & sel pd tembakau.
6. Medium N6 (Chu) thn 1978, utk kultur jaringan serealia terutama
padi.
7. Medium WPM (Lloyd & McCown) thn 1980, utk tanaman berkayu.
8. Medium Kao & Michayluk 1975, utk kultur protoplas Cruciferae,
Graminae, Leguminosae.
TEKNIK ASEPTIK
SYARAT KJT : aseptik bebas bakteri, jamur, yeast & jasad renik
Kontaminasi faktor pembatas penentu keberhasilan
- selama prosedur
- selama kultur dipelihara
Sumber Kontaminasi :
1. Eksplan, baik eksternal maupun internal
2. Organisme kecil yg msk ke dlm media (semut)
3. Botol kultur, media or alat-alat tanam yg kurang steril
4. Lingkungan kerja & ruang kultur yg kotor (spora di udara)
5. Kecerobohan dlm pelaksanaan
Kontaminasi o/ mikroorganisme masalah serius
- Nutrisi dlm Media cpt habis oleh mikroba
- Jaringan tnmn mati krn kekurangan hara & keracunan senyawa toksik
hasil metabolisme mikroba
Kontaminasi bs terjadi pd setiap tahap pelaksanaan KJT
Prosedur Aseptik utk menanggulanginya :
1. Sterilisasi ruang kerja
2. Sterilisasi medium & alat-alat
3. Sterilisasi eksplan
4. Kebersihan peneliti & kerja peneliti

A. STERILISASI RUANG KERJA

Sumber kontaminan serangga kecil, spora jamur & bakteri
Lantai dibersihkan setiap pagi dgn desinfektan
Udara disterilisasi dgn lampu ultraviolet (UV)
Dlm ruang kerja ini terdapat LAFC atau Steril Box (entkas)
LAFC kotak dilengkapi blower & lampu UV utk menanam
eksplan dlm kondisi steril.
Steril box lebih sederhana terbuat dr kotak bhn kaca, kayu dll
Cara sterilisasi lampu UV min 30 menit dan semprot or lap dgn alkohol
70%, utk entkas bisa pakai tablet formalin yg diuapkan.
B. STERILISASI MEDIA & ALAT-ALAT
Alat-alat logam & gelas Menggunakan autoklaf
Autoklaf :
Sederhana (pakai kompor gas)
Programmable autoclave (menggunakan energi listrik), wkt, suhu &
tekanan diatur otomatis.
Alat-alat spt scalpel,pinset, petridish, cork borer, pipet alat gelas,
gunting, kertas saring dll dibungkus kertas coklat dulu.
Botol stlh dicuci ditutup alumunium foil atau plastik & karet yg tahan
panas, botol dgn tutup berulir jgn terlalu rapat.
Temperatur 121C, tekanan 15 17 psi, waktu 15 40 menit
trgantung banyaknya media.
Sterilisasi Media dgn autoklaf punya bnyk kelemahan :
1. Sukrosa terurai jd fruktosa & glukosa
2. Terbentukx caramel gula berwarna coklat & beracun.
3. pH media akan berubah (menurun)
4. Pengendapan garam & depolimerisasi agar.
Bahan termolabil (GA
3
, Thiamin-HCL) dgn cara ultra filtrasi (milipore
filter) pd suhu ruangan.
C. STERILISASI EKSPLAN
Eksplan dr lapangan biasanya lebih banyak mengandung kontaminan
Sebaiknya ditanam dulu di rumah kaca.
Ditangani dgn sterilisasi permukaan.
Beberapa punya kontaminan internal yg sulit diatasi dg sterilisasi
permukaan shg perlu diberi antibiotik or fungisida.
Tingkat kontaminasi berbeda tergantung :
1. Jenis tanamannya
2. Bagian tanaman yg digunakan
3. Morfologi permukaan (brbulu or tdk)
4. Lingkungan tumbuhnya
5. Musim wkt mengambil (kemarau or hujan)
6. Umur tanaman (seedlings or dewasa)
7. Kondisi tanamannya (sakit or sehat)
Oleh krn itu sulit or tdk ada prosedur standar semua hrs melalui
percobaan pendahuluan.
Dilema : kontaminan & eksplan sama2 jasad hidup,kontaminan hrs
dihilangkan tanpa mematikan eksplan
Eksplan in vitro
Eksplan dr lapang
Bahan pensteril : Calsium hypoklorit, sodium hipoklorit, merkuri
klorida (HgCl
2
), alkohol, betadin dsb.
Konsentrasi & waktu bervariasi
Biasa jg dipakai dua macam pensteril
Setelah perlakuan hrs dicuci dg akuades krn pensteril bersifat toksik
Daya penetrasi pensteril ditingkatx dg 1-2 tetes agen pembasah yg
dpt menambah tegangan permukaan eksplan (Tween 20) or dibantu
pompa vakum.
Pra-sterilisasi penting jg dg cr mencuci aksplan dg sabun dn dibilas
di air mengalir 15 30 menit utk memecah koloni kontaminan agar
lebih peka thd pensteril.
Utk kontaminan internal pemberian antibiotik dilakukan terlebih dulu
selama 4 - 5 jam lalu sblm sterilisasi lbh lanjut. Atau bs jg dg
menambah antibiotik dlm media tumbuh.
Antibiotik yg termolabil ditambahkan pd media yg sdh steril scr
ultrafiltrasi dgn mikro-filter dg pori 0,2 m
D. KEBERSIHAN PENELITI & KERJA PENELITI
Tubuh, pakaian, hrs bersih,tdk berkeringat dan berdebu.
Sepatu diganti sandal yg khusus utk di lab.
Cara kerja jg hrs bersih tdk sembrono, ceroboh atau jorok melainkan
hati-hati, teliti, bersih, tepat, sabar, tdk tergesa-gesa.

Metode KJT dilhat dr macam media tanam:
1. Metode padat
Tujuan : induksi kalus, diferensiasi akar serta tunas lalu jadi planlet.
Menggunakan agar-agar khusus or kemasan kertas utk rumah tangga
atau agar batangan.
Tidak boleh terlalu padat atau sebaliknya terlalu cair.
Terlalu padat, nutrisi sulit diserap eksplan.
Terlalu cair, eksplan akan tenggelam dan akhirnya busuk.
Beberapa eksplan justru hrs lembek spt mikrospora, helaian daun tipis.
Kegunaan metode padat ini : utk kloning, meregenerasikan protoplas yg
telah diisolasi atau yg sdh fusi, menumbuhkan planlet dr protokormus
stlh dipindah dr suspensi sel.
2. Metode Cair
Disbt jg kultur suspensi sel, kultur dr sel-sel bebas di dlm medium cair
Tujuan :
1. memecah kalus jd single cell
2. memperbanyak kalus dg sub kultur berulang
3. menumbuhkan protokormus atau plb (protocorm like body)
Pembuatan media lebih mudah krn tanpa agar shg tdk perlu
dimasak.
ZPT yg digunakan biasanya 2,4-D sebanyak 2 ppm.
Dipelihara di atas shaker dgn kecepatan 120 rpm.
Sub kultur dilakukan dlm wkt 1 2 minggu, jika terlambat terjadi
embryogenesis atau pencoklatan dan berhenti tumbuh.
Sub kultur ada 2 cara : memecah biomasa mnjadi 2 bagian yg
msng2 ditambah media baru dg volume sama, atau biomasa tetap
tp dlm wadah yg lebih besar dgn jumlah media ditambah 2 kali lipat.
Utk skala besar biasa digunakan fermentor.
Kalus yg difermentasi utk berbagai keperluan : produksi metabolit
sekunder, sumber protoplas, sumber kultur sel.
Metode KJT dilihat dr bahan atau eksplan yang dipakai :
Kultur meristem, antera, pollen, endosperm, suspensi sel,
protoplas, embrio, pucuk/tunas, akar dll.
Metode KJT dilihat dr cara pemeliharaan :
Pemeliharaan dilakukan dgn memindahkan eksplan atau kalus ke
media baru, jk terlambat maka pertumbuhan berhenti, terjadi
browning lalu terjadi kontaminasi jamur atau bakteri.
Ada 3 macam cara pemeliharaan :
1. Cara satu langkah (one step methode)
dikehendaki eksplan langsung jadi kalus lalu planlet dlm satu
macam medium. Media dasar dpt berbagai macam : MS, WPM,
VW, dll tetapi dgn penambahan gula yg cukup tinggi 20 60g/l
dan tambahan KNO3, hormon auksin 2,4-D, NAA.
2. Cara dua langkah (two step methode)
Pertama induksi kalus, lalu dipindah ke media diferensiasi utk
pembentukan tunas dan akar.
3. Cara tiga langkah (three step methode)
pertama menumbuhkan kalus, kedua dipindah ke media
pembentuk tunas dan ketiga, pembentukan akar.
PELAKSANAAN KULTUR JARINGAN
A. STERILISASI EKSPLAN
1. Sterilisasi eksplan secara mekanis
utk eksplan keras, berdaging dgn cara membakar di atas lampu
spirtus 3 kali sambil digoyang2 sampai apinya padam.
misal : biji, buah salak, buah anggrek, umbi bawang dll.
2. Sterilisasi eksplan secara kimiawi
utk eksplan lunak (jar. Muda) spt tangkai daun, daun, anther dll.
caranya : - eksplan yg sdh dicuci dipotong kecil2
- direndam dlm fungisida atau antibiotik
- dibawa ke dlm LAFC lalu direndam dlm alkohol 70%
- direndam dlm natrium hipoklorit (bayclin) + TWEEN 20
- dibilas 3X dlm akuades steril.
- bahan diambil dg pinset diletakan pd petri dish yg di
alas kertas saring di dlmnya.
- siap ditanam
B. MENABUR/MENANAM EKSPLAN

Dilakukan di dlm LAFC dgn kondisi aseptik.
Caranya:
- Lepaskan gelang, cincin, jam tangan.
- Gunakan masker penutup hidung & kepala jika perlu;
- Basahi tangan sampai lengan dgn alkohol 70%.
- Matikan lampu UV, nyalakan blower & lampu neon, semprot meja
laminar dg alkohol, semprot dg alkohol semua alat & media yg akan
masuk laminar.
- Buka penutup botol kultur, letakkan eksplan yg sdh dipotong dgn
pola & ukuran yg tepat pada media tumbuh. Usahakan permukaan
yg teriris menyentuh media. Kerjakan dekat dg api.
- Ingat!!! Pinset, scalpel sblm memegang eksplan hrs dibakar dulu
lalu di celup ke akuades steril.
- Tutup kembali botol kultur dg alumunium foil.
- Simpan di ruang kultur.
- Bereskan semua alat2, lap kembali dgn alkohol permukaan laminar,
matikan blower & neon, tutup laminar, nyalakan lampu UV.
C. MELAKSANAKAN SUB-KULTUR

Sub kultur upaya mengganti media tanam dengan media baru shg
nutrisi utk kebutuhan eksplan (kalus or plb) tetap terpenuhi.

1. Sub Kultur pd media cair
- Nutrisi pd media cair cpt habis oleh plb or kalus.
- sub kultur setiap 4 hari sekali, secara aseptik.
- pengambilan media dgn pipet.
- pengambilan plb or kalus dgn pinset.
- dari satu erlenmeyer biasa menjadi 7 erlen meyer.
2. Sub kultur pd media padat
- dengan meletakkan eksplan (kalus or koloni tunas) dlm petridish
lalu dipotong-potong or dipisah-pisah setelah itu ditanam lagi pd
media baru.
D. Menumbuhkan Planlet
Komposisi media dasar biasanya separuh dr media induksi kalus.
ZPT 2,4-D atau NAA dihilangkan sbb akan mbentuk kalus terus.
ZPT yg dianjurkan sitokinin (kinetin) dan auksin (IAA) dengan
perbandingan tertentu.
Utk induksi pucuk maka sitokinin diperbanyak komposisinya,
sebaliknya utk akar diperbanyak auksinnya.