BAB I

PENDAHULUAN
Latar Belakang Masalah
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Dengan kata lain tuuan dari
!alidasi metode analisis adalah untuk mengkon"irmasi atau memastikan metode analisis yang
dipakai sesuai untuk peruntukannya. #enurut Harmita (2004), beberapa parameter analisis
yang harus dipertimbangkan dalam !alidasi metode analisis diuraikan dan dide"enisikan
sebagaimana cara penentuannya. $dapun parameter%parameter tersebut antara lain adalah
kecermatan (akurasi), keseksamaan (presisi), selekti!itas, linearitas dan rentang, batas deteksi
dan batas kuantitas, ketangguhan metode, kekuatan metode. $pabila parameter%parameter ini
dapat dipertanggungawabkan maka suatu metode analisis dapat dikatakan !alid dan dapat
digunakan untuk analisis rutin.
&eberapa penelitian tentang !alidasi metode analisis menggunakan kromatogra"i cair
kinera tinggi antara lain dilakukan oleh Vilas 'haudhari dan #ilind (bale, selain itu uga
oleh $.)akshmana *ao dan +. ,rilakshmi masing%masing menggunakan pelarut yang
berbeda.
&erdasarkan permasalahan inilah maka peneliti tertarik untuk membandingkan
!alidasi metode penetapan kadar lo!astatin mana yang paling baik dengan menggunakan
kromatogra"i cair kinera tinggi.
Tujuan Penulisan
-uuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut.
/. Validasi metode mana yang paling baik.
2. Validasi metode mana yang paling !alid.
0. $pakah !alidasi metode tersebut dapat digunakan untuk analisis rutin.
1
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Lovastatin
)o!astatin merupakan senyawa penting untuk mengatasi penyakit hiperkolesterolemia
karena akti!itasnya mampu menghambat hidroksimetilglutaril%koen1im $ (H#2%3o$)
reduktase, yang ber"ungsi sebagai katalis dalam biosintesis kolesterol ($lberts et al., /450).
H#2 3o%$ reduktase adalah en1im utama yang akan mengubah H#2 3o$ menadi
me!alonat. H#2 3o$ reduktase akan memilih berikatan dengan lo!astatin pada saat
konsentrasi lo!astatin lebih tinggi daripada konsentrasi H#2 3o$, sehingga proses
pembentukan me!alonat tidak teradi dan akibatnya proses pembentukan kolesterol terhambat
($lberts et al., /450).
)o!astatin terdapat dalam dua bentuk yaitu asam%6% hidroksi dan lakton (2ambar
/./). 7ermentasi menghasilkan lo!astatin dalam bentuk asam%6%hydroksi (asam me!alonat)
sedangkan sebagai obat, lo!astatin merupakan bentuk lakton yang tidak akti" (me!inolin). Di
dalam tubuh (in !i!o) lo!astatin diabsorpsi dari saluran gastrointestinal kemudian dibawa ke
organ hati. Dalam organ hati lo!astatin dalam bentuk lakton kembali dihidrolisis menadi
bentuk asam%6%hidroksi yang akti" (,amiee et al. 2000).
)o!astatin bersi"at semi polar, tidak larut dalam air tetapi larut baik dalam etanol,
metanol, asetonitril, etil asetat dan kloro"orm.
2ambar /./. ,truktur kimia lo!astatin dalam bentuk $. asam%6%hidroksi dan &. )akton
(,umber. www.ncbi.nlm.nih.go!).
Heber, (/444) menyatakan bahwa lo!astatin dapat menurunkan kadar kolesterol darah
sebesar //%028 dan kadar trigliserida sebesar /2%/48. +emberian lo!astatin secara rutin
2
kepada penderita hiperkolesterolemia dapat menurunkan kadar kolesterol darah hingga 008
(Voet et al., /444).
ali!asi
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis bertuuan
untuk memastikan dan mengkon"irmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk
peruntukannya (2andar, 2009).
#enurut (,+ 00%:72; (2009), metode analisis diklasi"ikasikan dalam 4 kategori,
yaitu.
a. 3ategori / .
3uantitas dari bahan utama atau bahan akti"
b. 3ategori 2 .
+enentuan kadar tidak murni atau produk yang telah terurai
c. 3ategori 0 .
+enetapan hasil dari karakteristik
d. 3ategori 4 .
-es identi"ikasi
+arameter !alidasi metode analisis adalah prosedur analisis yang harus di!alidasi
meliputi beberapa enis penguian, yaitu adanya pengotor, ui limit untuk
mengendalikan keberadaan pengotor, serta ui kuantitati" komponen akti" atau komponen lain
dalam produk obat%obatan. ,elain itu, terdapat 5 parameter !alidasi metode
analisis yaitu spesi"isitas, presisi<ketelitian, akurasi<ketepatan, linearitas, kisaran, limit
deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. +emilihan parameter yang akan diui tergantung
dari enis dan metode penguian yang akan di!alidasi ('han, 2004).
Akurasi
$kurasi adalah ukuran yang menunukkan deraat kedekatan hasil analis dengan kadar
analit yang sebenarnya. $kurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery)
analit yang ditambahkan. 3ecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat
sistematik di dalam keseluruhan tahapan analisis. =leh karena itu untuk mencapai kecermatan
yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti
menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik,
3
pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur (2andar,
2009).
$kurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo
recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (*iyadi,
2004). 3ecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam
keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, seumlah analit bahan murni
ditambahkan ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan
dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan
dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah
analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 508 sampai /208 dari kadar analit yang
diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan di!alidasi (*iyadi, 2004).
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu seumlah tertentu
analit yang diperiksa (pure analit<standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan
dianalisis lagi. ,elisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. +ada metode
penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. #etode ini tidak dapat
digunakan ika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang
ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar,
dll. *eco!ery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang
sebenarnya. &iasanya persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari ;8 (*iyadi,
2004).
Presisi
+resisi adalah ukuran yang menunukkan deraat kesesuaian antara hasil ui
indi!idual, diukur melalui penyebaran hasil indi!idual dari rata%rata ika prosedur diterapkan
secara berulang pada sampel%sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relati" (koe"isien
!ariasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility
(ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode ika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam inter!al waktu yang
pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap
sampel > sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, adi memberikan ukuran
keseksamaan pada kondisi yang normal (*iyadi, 2004).
4
Reproducibility adalah keseksamaan metode ika dikerakan pada kondisi yang
berbeda. &iasanya analisis dilakukan dalam laboratorium%laboratorium yang berbeda
menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. $nalisis dilakukan
terhadap sampel%sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. 3riteria
seksama diberikan ika metode memberikan simpangan baku relati" (*,D) atau koe"isien
!ariasi ('V) 28 atau kurang. $kan tetapi kriteria ini sangat "leksibel tergantung pada
konsentrasi analit yang diperiksa, umlah sampel, dan kondisi laboratorium (*iyadi, 2004).
Linieritas !an "entang
)inearitas menunukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil
penguian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi
tertentu. ,edangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit
yang sudah ditunukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas
yang dapat diterima. *entang dapat dilakukan dengan cara membuat kur!a kalibrasi dari
beberapa set larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (?rmer @ #iller 200;).
+ersamaan garis yang digunakan pada kur!a kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat
terkecil, yaitu y A a B bC. +ersamaan ini akan menghasilkan koe"isien korelasi (r). 3oe"isien
korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. +enetapan
linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. :ilai koe"isien korelasi
yang memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.4490 (D'H, /44;). )inearitas uga
dapat diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (?rmer @ #iller 200;).
Selektivitas #S$esi%isitas&
,elekti!itas atau spesi"isitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya
mengukur 1at tertentu saa secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel. ,elekti!itas seringkali dapat dinyatakan sebagai deraat
penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung
bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa seenis, senyawa asing lainnya,
dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan. +enyimpangan hasil ika ada merupakan selisih dari hasil ui keduanya. Eika
cemaran dan hasil urai tidak dapat diidenti"ikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selekti!itas
dapat ditunukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil ui
urai dengan metode yang hendak diui lalu dibandingkan dengan metode lain untuk penguian
kemurnian seperti kromatogra"i, hhanalisis kelarutan "ase, dan Differential Scanning
5
Calorimetry. Deraat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran
selekti!itas (*iyadi, 2004).
Batas Deteksi'Limit of Detection #L(D&
&atas )imit deteksi merupakan umlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel
yang dapat dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya (D'H, 2000).
Batas Kuanti%ikasi'Limit of Quantification #L()&
&atas )imit kuantitasi adalah umlah analit terkecil dalam sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitati" pada tingkat ketelitian dan ketepatan yang baik. )imit kuantitasi
merupakan parameter penguian kuantitati" untuk konsentrasi analit yang rendah dalam
matriks yang kompleks dan digunakan untuk menentukan adanya pengotor atau degradasi
produk. )imit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan
simpangan baku intersep kur!a standar yang diperoleh (D'H, 2000).
6
BAB III
PEMBAHASAN
ali!asi Meto!e *ang Dilakukan (leh A+Laksh,ana "ao !an P+ Srilaksh,i
Pengkon!isian HPL-
7ase gerak terdiri dari asetonitril (H+)' grade), metanol (H+)' grade) dan air
(H+)' grade) sebelum digunakan disaring melalui membran 0.4;F, ditambahkan secara
perlahan secara perlahan pump yang berisi pelarut dalam rasio 94. /2. 4! < ! < ! secara
berurutan dipompa ke dalam kolom dengan lau alir /.2ml < min. Deteksi dibaca pada panang
gelombang 200nm dan dialankan selama 5 menit. Volume yang diineksikkan ke dalam loop
sebanyak 20Fl. ,ebelum larutan obat diineksi ke dalam kolom selama paling sedikit 00
menit dengan "ase gerak yang mengalir melalui sistem.
Larutan Baku
)arutan baku lo!astatin disiapkan dengan melarutkan 2;mg lo!astatin dalam labu
ukur 2;ml yang berisi 2;ml metanol , lalu larutan disonikasi selama /; menit. +ipet ;ml
dari larutan dan dipindahkan ke ;0ml !olumetrik labu dan !olume dibuat sampai tanda
dengan "ase gerak. +engenceran selanutnya dari larutan ini dibuat dengan "ase gerak untuk
mendapatkan konsentrasi dari /0%/00Fg < ml. )arutan disuntikkan ke loop 20Fl. +ercobaan
linearitas dilakukan di rangkap tiga untuk memastikan akurasi dan ketepatan #etode.
Pre$arasi .ahan
Dua merk komersial sediaan tablet yang dipilih pada penguian kesesuaian metode
yang diusulkan untuk memperkirakan kadar lo!astatin dalam bentuk sediaan tablet. Dua
puluh tablet ditimbang akurat dan digerus hingga menadi bentuk bubuk. -imbang serbuk
yang setara dengan ;0mg lo!astatin adalah ditimbang secara akurat dan dipindahkan ke labu
ukur ;0ml. #asukkan 00ml metanol dan letakkan dalam ultrasonik bath selama /; menit.
larutan ini disaring melalui membran "ilter dan !olume dibuat sampai tanda untuk
mendapatkan / mg < ml konsentrasi. Dari larutan dipipet ;ml atas adalah dipindahkan ke
labu ukur /00ml dan !olume ad sampai tanda /00ml dengan menggunakan "ase gerak.
)arutan sampel diineksi pada H+)' yang telah dikondisi dan hasil kromatogram akan
tercatat. Eumlah lo!astatin dalam tablet "ormulasi ditentukan dengan membandingkan puncak
7
daerah dari larutan baku. Hasil dapat dilihat pada -abel /. Hasil dan penggunaan metode
yang sudah di !alidasi dengan dua merk yang berbeda dapat dilihat pad -abel 2.
ali!asi Meto!e *ang Dilakukan (leh ilas -hau!hari !an Milin! U.ale
Kon!isi kro,atogra%i
,istem kromatogra"i (,ystronic) menggunakan kolom dengan panang 2;0 mm dan
diameter dalam 4,G mm yang berisi "ase diam =ctadecyl silane Dnertsil =D, '/5 dengan
ukuran partikel ; mikro dan ukuran pori /00 $. )au pengeluaran "ase gerak diatur menadi
/ml<menit, dengan !olume ineksi 20 Hl dan panang gelombang 200 nm.
/ase gerak
'ampuran dapar (:aH
2
+=
4
/g dan garam asam /%ocatansul"onat dalam /000 ml
aIuadest), methanol dan acetonitril dengan perbandingan ;; . 25 . /9 !<!<!. 3eseluruhan "ase
gerak disaring dengan nylon berpori 0,4; Hl dan kemudian dilakukan proses degassing.
Pre$arasi larutan stan!ar!
)o!astatin dibuat dengan konsentrasi /00 ppm kemudian dicampurkan dengan pelarut
acetonitril dan air /./.
Pre$arasi sa,$el
+reparasi dilakukan sama dengan preparasi pada larutan standard.
Meto!e ali!asi 0
8
Kesesuaian siste,
Dilakukan ; kali replikasi dengan mengineksikan asam, basa dan larutan oksidati"
terdegradasi dan *,D dari rasio luas area, resolusi, "aktor tailing dan tehoritical plates.
Presisi
3eterulangan dilakukan sebanyak G kali pengeraan. Hasilnya mengindikasikan
keterulangan dari metode ini.
Akurasi
$kurasi dibuat dalm 0 le!el yaitu 50 8, /008, /208. 3emudian dihitung persen
perolehan kembali dari masng%masing le!el.
Kali.rasi !an linearitas
ui linearitas dibuat dalam G konsentrasi yang diui dari le!el 508 hingga /208.
)arutan standard mengandung 50 %/20 ppm untuk masing%masing le!el. Dilakukan 0 kali
replikasi untuk ui linearitas.
9
Sta.ilitas larutan analit
,tabilitas larutan standard dan larutan sampel diui dengan inter!al waktu 24, 45 dan
92 am. 3emudian hasil dicocokkan dengan larutan yang standard yang yang baru
dipreparasi.
Per.an!ingan !ua vali!asi ,eto!e 1ang !igunakan
ALIDASI
Akurasi
+ada metode yang pertama didapatkan hasil recovery . kedua urnal 8reco!erynya bagus
karena mendekati /008 semua dan ada didalam range tabel dibawah ini, tetapi dipilih urnal
/ karena dilihat dari 8reco!erynya lebih mendekati /008
-abel /. $cceptable *eco!ery +ercentages
Presisi
- 8*,D . diantara kedua urnal, urnal dua menghasilkan hasil yang yaitu 0,44.
,edangkan urnal satu, *,D nya tidak dilakukan, sehingga urnal satu tidak dapat
diketahui keseragaman presisinya.
Linieritas
- 3oe"isien relasi . diantara kedua urnal, koe"isien relasi urnal dua lebih bagus
daripada urnal satu, hal tersebut dikarenakan hasil koe"isien relasi dari urnal dua
lebih mendekati / (0,4449) daripada hasil dari urnal satu yaitu (0,444G0). ,elain itu,
pembuatan range konsentrasi dari urnal dua uga lebih besar dari pada urnal / (/0%
10
/00 ppm) hal tersebut lebih bagus daripada urnal 2 (50%/208), pembuatan range
yang lebih besar menghasilkan hasil yang lebih sensiti!e.
L(D 2 L()
Hasil. Eurnal /(Vilas 'haudhari dan #ilind (bale)
Hasil. Eurnal 2 ($.)akshmana *ao dan +. ,rilakshmi)
Dari kedua tabel diatas dapat dilihat bahwa )=D )=J dari urnal satu lebih baik. Hal
tersebut dikarenakan pada urnal 2, )=D A 0,048 dan )=J A 0,508 lebih besar dari pada
urnal satu. )=D )=J yang lebih kecil menandakan penelitian tersebut lebih sensiti" dalam
menetapkan kadar lo!astatin.
+ada urnal 2 ($.)akshmana *ao dan +. ,rilakshmi), tidak dilakukan presisi dan
robustness.
BAB I
KESIMPULAN
Eadi, berdasarkan perbandingan dari hasil akurasi, presisi, linearitas, )=D dan )=J dan
kelengkapan data maka dapat dinyatakan bahwa urnal / (Vilas 'haudhari dan #ilind (bale)
yang memiliki !alidasi metode yang lebih baik, !alid, dan dapat digunakan sebagai analisa
rutin.
BAB
SA"AN
11
,ebaiknya pada urnal 2 ($.)akshmana *ao dan +. ,rilakshmi) melakukan presisi dan
robustness agar dapat diketahui secara pasti apakah !alidasi metode yang dilakukan dapat
memberikan hasil yang baik. ,elain itu uga sebaiknya urnal / (Vilas 'haudhari dan #ilind
(bale) di perbaiki lagi dalam pembuatan linearitasnya, dengan cara memperbesar range dan
nilai r nya di buat lebih bagus lagi.
BAB I
DA/TA" PUSTAKA
$lbert DE, Kalsh #), Eonik *H. /440. ggression in humans! "hat is its biological
foundation# :eurosci &iobeha! *e! /9.40;%2;
'han, '. ',. )am, Herman. )ee, L. '. and Mhang, Nue%#ing. 2004. nalytical $ethod
%alidation and &nstrument Performance %erification. Eohn Kiley @ ,ons. 'anada.
?rmer, E.H. and #iller, #c&. 200;. #ethod %alidation in Pharmaceutical nalysis. 'uide
to (est Practice. Kiley%Vch. Verlag 2mbH @ 'o. 32a$. Keinheim.
'and)ar, D. 2., dan *ohman, $. *++,. -imia .armasi nalisis. Cetakan &&. Logyakarta.
+ustaka pelaar
Heber, D. /444. Cholesterol /o"ering 0ffects of Proprietary Chinese Red 1east Rice
Dietary Supplement. $merican Eournal o" 'linical :utrition G4 (2). 20/%20G.
Dnternational con"erence on harmoni1ation (D'H) Harmoni1ed -ripartite 2uideline. /44;.
&C2 3* 4R5) %alidation of nalytical Procedures! 6e7t and $ethodology. )ondon .
'anary Khar"t.
Dnternational con"erence on harmoni1ation (D'H). 2000. %alidation of nalytical Procedures!
6e7t and $ethodology 3*4R5) %alidation of nalytical Procedures! 6e7t and
$ethodology. )ondon . 'anary Khar"t.
*iyadi, Kahyu. 2004. %alidasi $etode nalisis. 'hem%Ds%-ry
,amiee, ,.#., :.#oa1ami, ,. Haghighi, 7.$. #ohseni, ,.#irdamadi, @ #.*. &akhtiari.
2000. Screening of lovastatin production by filamenteous fungi. Dranian &iomedical Eournal.
12
(nited ,tates +harmacopeia 'on!ention. 2009. 8nited States Pharmacopoeia 9ational
.ormulary, 8SP :+;9. *<. -winbrook +arkway. (nited ,tates +harmacopeial
'on!ention.
Voet, D., E.2. Voet, and '.K. +ratt. /444. .undamentals of (iochemistry. &risbane. Eohn
Killey and ,ons.
13