Immuno-afinitas Pemurnian Sel Serangga yang diambil dari Glycoprotein Virus Rabies

menggunakan konformasi spesifik antibodi monoklonal

Abstrak
Rabies adalah penyakit sistem saraf yang dapat menyebabkan ensefalitis dengan hasil
fatal. Epitop bertanggung jawab pada glikoprotein (G) virus rabies (RV) untuk menginduksi
antibody virus yang pada akhirnya diperlukan untuk mendapatkan perlindungan yang lengkap
dari tantangan virus. Oleh karena itu, kemampuan teknik kromatografi diperlukan untuk
memurnikan rekombinan glikoprotein virus rabies (rRVG) tanpa mengubah imunogenik
epitopnya. Penelitian ini menekan pada kemurnian dari rRVG yang menggunakan konformasi
RVG yang spesifik, seperti mAb, M5B4, dimana ikatannya dari ikatan G asli yang terlipat. mAb
menunjukkan interaksi kinetik yang signifikan dengan RVG. Immobilis mAb bergerak ke NHS
untuk mengaktifkan Sepharosa 4 aliran cepat yang digunakan untuk pemurnian rRVG oleh
immuno-afinitas kromatografi (IAC). Ikatan rRVG dielusi didalam IAC menggunakan 0,1 M
glisin dengan pH 2,5 dan identitas dimurnikan protein dikonfirmasi oleh MALDI-TOF.
Kemurnian rRVG oleh IAC diinduksi oleh respon antibodi dan 83% tikus yang diimunisasikan
diproteksi melawan virus rabies intra-serebral. Hasil menunjukkan bahwa mAb adalah metode
berbasis IAC yang dapat menjadi teknik pemurnian yang efektif untuk merancang rRVG dengan
tingkat kemurnian yang signifikan.

PENDAHULUAN

Rabies adalah salah satu penyakit zoonosis utama dan masih merupakan masalah
kesehatan masyarakat terpenting pada Negara berkembang. Penyakit ini disebabkan oleh virus
rabies (RV) dan ditandai dengan progresif akut ensefalitis. Envelop glikoprotein (G) dari RV,
adalah antigen utama yang bertanggung jawab untuk patogenesitas virus dan merupakan satu-
satunya target untuk menetralisir antibody. (Dietzchold et al, 1978;. Badrane dan Tordo 2001).
Kemajuan dalam teknologi rekombinan telah menimbulkan perkembangan subunit dan Vaksin
DNA berdasarkan glikoprotein virus rabies (RVG) (Yelverton et al, 1983;. Fu et al, 1993.; Xiang
et al, 1994;. Sakamoto et al, 1999;. Biswas et al, 2001;, Ramya et al,. Gupta et al, 2005.. 2011).
Dengan demikian, pemurnian RVG tanpa konformasi epitop sangat diperlukan untuk
mendapatkan perlindungan terhadap tantangan virus. Padahal, ada banyak metodologi
kromatografi untuk pemurnian RVG yang tersedia.
Kromatografi afinitas immuno-(IAC) melibatkan pergerakan biologis atau sintetis ligan
ke resin inert dan menghasilkan biospecific adsorben yang akan memiliki afinitas tinggi untuk
senyawa tunggal. Teknik IAC menggunakan antibodi monoclonal (mAbs) yang cocok untuk
pemurnian protein dari berbagai zat biologis (Santucci et al., 1990). Protein rekombinan
dimaksudkan untuk tujuan vaksinasi dan tidak boleh mengandung setiap tag afinitas dan dengan
demikian, metode IAC dapat menjadi alternatif yang cocok untuk pemurnian tagfree RVG
rekombinan (rRVG) untuk digunakan sebagai calon vaksin. Santucci et al. (1990) telah
melaporkan bahwa IAC menggunakan antibodi antipeptide sebagai metode spesifik dan sensitif
yang tinggi untuk pemurnian.
Dalam penelitian ini, pemurnian sel serangga dinyatakan dan dievaluasi dengan
menggunakan sebuah RVG situs III yang spesifik. Imunogenisitas dan efektivitas terhadap
perlindungan dari IAC dimurnikan rRVG dievaluasi pada tikus.
Material dan Metode
Sel, Virus, Antibodi, dan Binatang
Derivat sel vero, beta propiolakton (BPL) merupakan antigen virus (PV strain)
tidak aktif yang diperoleh dari Human Biologicals Institute. Udhagamandalam, India
menggunakan untuk mengisolasi RVG asli. Challenge virus standard (CVS) yang
diperoleh dari Federal Vaccine Institute telah diujikan pada tikus. Strain RV CVS 11
yang diperoleh dari Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments, Francis dan
Sel Neuro-2a diperoleh dari ATCC, USA telah digunakan dalam Rapid fluorescent focus
inhibition Test (RFFIT) untuk menentukan respon antibodi. Sebuah sel Spodoptera
frugiperida (Sf9) diperoleh dari Ingenasa, Spanyol yang telah digunakan untuk
memproduksi rRVG. Sisi RVG III spesifik untuk mAb, M5B4 (Nagarajan et al.,2006)
yang digunakan dalam IAC dan ELISA.
Tikus albino swiss (berat 12-15 g) dengan dua jenis kelamin, diperoleh dari
National Institute of Nutrition (NIN), Hyderabad, India digunakan untuk menilai
imunogenisitas dan kemampuan protektifnya. Tantangan percobaan yang dilakukan di
Biosafety tingkat II pada fasilitas percobaan untuk bintang kecil, Indian Immunologicals
Limited (IIL), Hyderabad, India mengikuti pedoman Komite Etik Institute Hewan.

Pengukuran Afinitas Konstan mAb-M5B4 dengan BIAcore
Afinitas konstan mAb (M5B4) dengan RVG asli telah diukur pada suhu ruang
(23-25
o
C) menggunakan BIAcore 3000 SPR biosensor (GE, Swedia) seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Kim et al., 2003;2006). Singkatnya, carboxymethylated dextran
matrix (CM-5 chip) diaktifkan dengan mencampur 1-etil-3-(3-dimetillaminopropil)
carbodilamid (EDC;0,05 M) dan N-hidroksisukinimid (0,2 M). RVG di imobilisasi ke
permukaan aktif dektran menggunakan 10 mM sodium asetat pada pH 4-5,5 dengan
kecepatan alir 10 l/min. mAb (M5B4) terdilusi (diencerkan) dalam PBS sampai
konsentrasi 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM dan 1 M dan dinjeksikan satu persatu dengan
kecepatan alir 30 l/menit (Gil et al., 2002). Antigen terkait (yeast (ragi) diekspresikan
sebgai HBsAg) dimobilisasikan ke dalam kontrol saluran bawah pada kondisi yang sama
untuk menormalkan instrument dan penyangga artefak (artifacts buffer). Disosiasi dan
konstanta laju asosiasi diperoleh dari analisis statistik data menggunakan Evaluasi
Sofware BIAcore (BIAevaluation versi 4.1) yang disediakan oleh pabrik/produser.

Penyiapan Resin Afinitas-Imunitas
Pengkoplingan mAb dengan resin mAb (M5B4) diimobilisasikan ke dalam NHS-
aktif Sepharose 4 fas flow TM (GE Healthcare, Sweden) mengikuti prosedur yang
direkomendasikan oleh pabrik/produsen dengan sedikit modifikasi (Gallant etal., 2008).
Singkatnya, mAb didialisis terhadap kopling penyangga (0,2 M sodium bikarbonat, 0,5
M NaCl, pH 8.3). Kovalennya digabungkan dengan resin satu per satu secara hati-hati,
pencampuran pada suhu 25
o
C selama 4 jam dan pasangan matrik dikemas dalam sebuah
kolom kosong. Efisiensi pengkoplingan (), ditentukan dengan metode tidak langsung
seperti yang dijelaskan oleh Hernandez et al. (2001) dengan rumus; % = / x 100,
dimana adalah jumlah pasangan protein yang ditentukan sebagai perbedaan antara
jumlah ligan sesungguhnya atau mAb dan adalah jumlah yang terdeteksi dalam fraksi
pembilasan setelah pengkoplingan. Kolom disimpan pada suhu 2-8
0
C dalam 20 % etanol
sampai digunakan lebih lanjut.

Evaluasi Kebocoran Ligan
Jumlah kebocoran ligan atau kepadatan kopling diukur oleh dimediasi antibodi
pada ELISA (Subramanian et al., 1994). Plat polistirena dilapisi dengan antigen murni
dari PV strain RV (500 ng / well) pada suhui 2-8
o
C. Plat dicuci dan disumbat dengan 1 %
bovine gelatin dalam PBST dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Plat dicuci lagi
dan fraksi dibersihkan dari pasangan matrik (yang mungkin mengandung mAb tidak
berpasangan). Plat diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37
0
C. Selanjutnya dicuci lagi dan
ditambahkan goat anti-mouse IgG-HRPO. Reaksi ini dikembangkan menggunakan
substrat kromogen aktif (TMB) dan peningkatan warna diukur dengan detector ELISA
pada panjang gelombang 450 nm.

rRVG untuk Pemurnian Imuno-Afinitas
rRVG ini dinyatakan dalam sel Sf9 dan kuantitas dari rRVG yang terdapat dalam
fraksi larut diukur dengan menggunakan immunocapture (IC)-ELISA sebagaimana
dijelaskan sebelumnya (Ramya et al., 2011). Secara singkat, sel-sel Sf9 yang terinfeksi
dengan baculovirus rekombinan memiliki kaset ekspresi RVG pada MOI dari 4. Sel-sel
yang dipanen 72 jam pasca infeksi dan dicuci tiga kali dengan PBS. Sel pellet itu lisis
menggunakan buffer lisis diformulasikan dengan 50mM Tris-HCl, 150mm NaCl, 4mm
EDTA (pH 7,4), 10% DMSO dan 0,6% CHAPS deterjen. Campuran itu kemudian
diinkubasi selama 30 menit pada tahap akhir pada suhu 23-25
o
C. Akhirnya, lisat tersebut
dijernihkan, disaring dan didialisis dengan PBS (pH 7,2).

Optimasi kondisi penyangga elusi untuk IAC dengan ELISA
Elusi penyangga untuk pemulihan optimal rRVG terikat ditentukan dengan
menggunakan metode ELISA. Pelat microtitre dilapisi dengan konsentrasi yang diketahui
berlabel mAb-M5B4 dan diinkubasi selama di 2-8
0
C. Sumur dicuci tiga kali dengan
PBST dan diblokir selama 1 jam pada suhu 37
0
C dengan menggunakan 1% gelatin sapi di
PBST. Dilarutkan rRVG ke dalam sumur dan membuat dua seri pengenceran. Acuan
baku di rumah (IRS) dengan konten G dikenal juga termasuk dalam ELISA. Plate
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
0
C. Sumur dicuci tiga kali dengan PBST dan
diinkubasi dengan berbagai reagen elusi:
a. 0,1 M glisin-HCl, pH 2,5
b. 0,2 M glisin HCl, pH 3,5
c. 0,1 M natrium bikarbonat, pH 8.0
d. 8 M urea, pH 7,0
e. PBS, pH 7,0 (kontrol negatif) selama 15 menit pada suhu 37
0
C. Sumur dicuci
tiga kali dengan PBST dan diinkubasi dengan terbiotinilasi mAb-M5B4
selama 1 jam pada suhu 37
0
C. Hal ini diikuti dengan penambahan
streptavidin-peroksidase konjugasi dan mengeram selama 1 jam pada
37
0
C. Reaksi warna enzimatik dikembangkan menggunakan larutan kromogen
dan absorbansi dibaca pada ELISA dengan panjang gelombang 450 nm. RVG
yang terikat dielusi dari berbagai kelompok perlakuan dan dihitung
menggunakan kurva standar yang diperoleh untuk IRS. Jumlah RVG
recorvered setelah perawatan penyangga diperkirakan dengan
membandingkan jumlah RVG terikat pada kontrol negatif (PBS). Elusi
penyangga IAC dipilih dari buffer yang menunjukkan persentase yang lebih
tinggi dari recovery protein yang terikat.

Optimalisasi Kromatografi Immunoaffinity
Lisat sel akan melewati matriks immunoadsorbent dengan laju alir 1 ml/menit
yang diikuti dengan waktu tinggal 30-60 menit. Sampel diaplikasikan dua kali dan
protein yang terikat dikumpulkan melalui aliran. Kolom dicuci dengan volume kolom 5-
10 dari PBS pada tingkat aliran 2ml/menit. Ikatan rRVG dielusi dengan 0,1 M glisin, pH
2,5 dengan laju alir 1 ml / menit dan elusi dinetralkan dengan 1/10 th volume 1 M Tris-
HCl, pH 8.6. Kolom kemudian dicuci dengan 10 volume kolom PBS dan disimpan dalam
etanol 20% pada 2-8
0
C sampai digunakan lebih lanjut.
Analisis pemurnian immuno afinitas rRVG
Elusi fraksi dari IAC diuji untuk rRVG kuantitas dengan IC-ELISA. The rRVG di
elutes dikumpulkan dihitung menggunakan IC-ELISA. Kemurnian protein dianalisis
dengan SDS-PAGE. Ligan yang kebocoran selama elusi juga dianalisis oleh antibodi
dimediasi ELISA seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Imunogenisitas dan efektivitas pelindung dari IAC dimurnikan rRVG
Imunogenik milik IAC dimurnikan oleh rRVG dan dianalisis pada tikus albino Swiss (12
sampai 15 g berat badan). Tikus diimunisasi dengan 0,4 mikrogram dari algel adjuvanted IAC
dimurnikan rRVG oleh intraperitoneal rute dua kali pada hari ke-0 dan hari ke-14. Tikus pada
kelompok kontrol diinokulasi dengan formulasi plasebo.
Tujuh hari pasca imunisasi booster, serum dikumpulkan dan RV dan menetralisir antibodi
(RVNA) titer ditentukan oleh RFFIT. Secara singkat, berbagai pengenceran uji dan referensi sera
(Standar rabies immunoglobulin, SRIG, NIBSC, UK) dicampur dengan 50 FFD50 dari CVS-11
strain RV dan diinkubasi pada 37
0
C dengan adanya 5% CO
2
selama 90 menit. Setelah dalam
masa inkubasi, sel Neuro-2a ditambahkan ke campuran dan diinkubasi lagi selama 20 jam pada
37
0
C dengan 5% CO
2
. Lembar sel kemudian difiksasi dengan aseton dan menggunakan anti-RV
nukleokapsid mAb terkonjugasi dengan FITC (Chemicon, USA). Berdasarkan keberadaan virus
unneutralized di berbagai pengenceran, titer dinyatakan sebagai kebalikan dari pengenceran yang
menetralkan 50% dari virus ditambahkan. Titer antibodi dari sampel serum dinyatakan sebagai
IU / ml dibandingkan dengan titer titik akhir 50% diperoleh untuk NIBSC standars serum.

Efektivitas perlindungan dari rRVG dimurnikan dianalisis dengan menantang tikus
percobaan intracerebrally (i / c) pada hari ke-28 pasca imunisasi dengan 30 LD 50 dosis CVS
strain RV. tikus diamati untuk perkembangan gejala khas rabies setiap hari selama 14 hari pasca
tantangan. Kematian tikus dalam 48 jam pertama setelah inokulasi dianggap non-spesifik dan
mereka tikus dihilangkan dari penelitian. Akhirnya, perlindungan persentase dihitung untuk
semua kelompok eksperimental

HASIL

analisis BIAcore

mAb yang mengikat RVG native yang terlipat di site antigenik III (M5B4) akan digunakan
dalam penyiapan adsorben immuno untuk memurnikan rRVG. afinitas konstan mAb
dievaluasi menggunakan BIAcore immunoassay dan mAb memiliki nilai KD 2,06 x 10-7 M,
ini menunjukkan interaksi signifikan antara kinetic dengan antigen pada konsentrasi nanomolar
(Gambar 1).

Immuno-afinitas pemurnian rRVG

mAb digerakkan pada konsentrasi protein 10 mg / ml pada NHS yang diaktifkan oleh Sepharosa
4 Aliran cepat dan pada pH 8.3. Jumlah antibodi yang tidak berpasangan(pasca-coupling dan
memblokir) dan peluluhan dari gabungan mAb selama proses pemurnian diukur menggunakan
antibodi yang diperantarai oleh ELISA. Sekitar 93-95% dari antibodi adalah gabungan dari
matriks yang diaktifkan dan dari peluluhan mAb dalam kolom whases dan elusi yang diukur
dengan ELISA minimal. Komposisi buffer elusi dipilih dari berbagai buffer dan efisiensi yang
dianalisis dengan cara mengukur unrecovered terikat rRVG menggunakan IC-ELISA. Hasilnya
telah menunjukkan bahwa 0,1 M glisin (pH 2,5) dan 0,2 M glisin (pH 3,5) telah dielusi sekitar
80% dan 40% dari masing-masing rRVG terikat. Sedangkan 0,1 M natrium bikarbonat (pH 8,0)
dapat mengelusi hanya 10% dari rRVG terikat. Lubang sumuran ditambah urea 8M
menunjukkan OD ELISA yang sangat rendah sebagai urea, ini mungkin karena denaturasi dari
rRVG terikat (Gambar 2). Sepuluh pemurnian yang berbeda berjalan dengan berbagai
konsentrasi rRVG konten yang dilakukan dalam tiga volume tempat yang berbeda dari pasangan
gel untuk mengevaluasi konsistensi dalam kinerja. Pada rata-rata, tingkat pemulihan > 90%
diperoleh dengan dinamis mengikat kapasitas resin menjadi 40g dari rRVG per ml



Gambar. 1. Sensorgram assay BIAcore menunjukkan kinetik mengikat kurva RVG dengan
konsentrasi yang berbeda dari mAb-M5B4 (2 nM, 4 nM, 6nm, 8 nM dan 1M) ditunjukkan oleh
warna yang berbeda. The mAb telah menunjukkan afinitas konstan 2.06 x 10-7 M pada
kesetimbangan.



Gambar. 2. pemulihan rRVG dengan buffer elusi yang berbeda ditunjukkan oleh IC-ELISA.
rRVG itu diambil pada
Plat ELISA menggunakan mAb, M5B4 dan berbagai buffer elusi yang diuji untuk kemampuan
mereka masing masing untuk mengelusi antigen terikat. Persentase pemulihan rRVG terikat
dihitung berdasarkan pengurangan dalam jumlah rRVG dibandingkan dengan kontrol PBS. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa 80% dari rRVG terikat dielusi dengan 0,1 M glisin (pH 2,5). The
8M urea (pH 7,0) telah benar-benar merubah aktivitas ELISA karena denaturasi

Analisis immunoaffinity pemurnian rRVG

elusi protein dinetralkan oleh penyangga yang cocok pada pH basa untuk menghindari denaturasi
protein yang diinduksi oleh asam dan reaktivitas spesifik dinetralisir oleh rRVG yang telah
diverifikasi menggunakan IC-ELISA. Hasil IC-ELISA menunjukkan bahwa Strategi pemurnian
tidak mengubah konformasi rRVG. Ketika pemurnian IAC, rRVG dianalisis menggunakan SDS-
PAGE, sekelompok protein ~ 55 kDa, yaitu sesuai dengan ukuran RVG yang diamati (Gambar
3). band protein yang menjadi sasaran MALDI-TOF dan identitas protein telah dikukuhkan
sebagai protein G PV strain RV . Dengan demikian, RVG yang terikat pada kolom terletak pada
pH netral dan eluted pada pH 2.5. Ini hasil yang sesuai dengan laporan sebelumnya (Lai, 1981;.
Santucci et al, 1990).

Imunogenisitas dan efektivitas pelindung dari IAC pemurnian rRVG

Imunogenisitas IAC pemurnian rRVG dinilai dengan cara inokulasi tikus secara intraperitoneal
pada hari 0 dan 14 dengan immuno-afinitas pemurnian rRVG. titers RVNA diukur dari serum
yang dikumpulkan pada hari ke-21 pasca imunisasi dan persentase tikus menunjukkan lebih dari
0,5 IU / ml
(minimum RFFIT titer protektif seperti yang direkomendasikan oleh WHO) telah dihitung.
Sekitar 67% dari tikus diinokulasi dengan IAC pemurnian rRVG menunjukkan titer protektif
pada hari ke 21 pasca vaksinasi dengan Rata-rata titer 1,46 1,4 (mean SD) dan 83% dari tikus
yang diimunisasi dilindungi terhadap ancaman intraserebral yang dilakukan pada hari ke-28
pasca imunisasi. Semua tikus yang belum diimunisasi mengembangkan gejala spesifik rabies dan
meninggal.


DISKUSI
vaksin rabbies berisi virus rabies yang dilemahkan dan vaksin ini diproduksi dengan
menumbuhkan virus dalam skala besar secara kontinu dengan menggunakan garis sel primer.
Oleh karena itu, langkah-langkah bio-keamanan yang sangat ketat diterapkan dalam fasilitas
manufaktur vaksin. menciptakan dan memelihara prosedur biosekuriti membutuhkan
pengeluaran besar. karyawan yang bekerja di fasilitas manufaktur vaksin rabies yang berbasis sel
juga berisiko untuk terkena infeksi. sub-unit vaksin rekombinan bisa menjadi alternatif dalam
penanganan virus rabies yang ada di fasilitas manufaktur vaksin. RVG sendiri dapat
menginduksi respon antibodi terhadap virus rabies dan sub-unit vaksin yang dikembangkan
menggunakan RVG, telah dibuktikan kesuksesannya dalam mendorong respon antibodi dan
mencegah tikus melawan intra-serebral tikus sendiri. RVG hadir dalam bentuk trimerik dan RVG
diekspresikan dengan transmembran domain (TMD) karena penting untuk mempertahankan
struktur Trimetric nya. Karena banyak epitop yang ternetralisasi konformasi RV, ekstraksi
membran harus dilakukan dengan hati-hati untuk melindungi properti imunogenik dari
glikoprotein.
protein rekombinan yang ditujukan untuk hewan atau untuk vaksinasi manusia harus
memenuhi persyaratan peraturan. karenanya, metode yang cocok sangat diperlukan untuk
pemurnian membran yang terikat dan afinitas RVG tanpa mengubah konformasi imunogeniknya.
sebuah penelitian yang dilakukan untuk mengembangkan metode kromatografi immuno-afinitas
untuk pemurnian rRVG yaitu dengan menggunakan mAb, M5B4, yang mengikat ke situs
antigenik III RVG.
Afinitas dari mAb yang merupakan factor antigen terpenting yang digunakan untuk IAC.
Kelemahan afinitas mAbs yaitu menurunkan kapasitas ikatan target antigen padahal dalam
menaikan afinitas mAbs diperlukan kondisi elusi yang sangat keras. Jadi, mAbs dengan medium
afinitas yang tinggi dianggap pilihan yang terbaik untuk pemurnian imuno-afinitas. Untuk IAC
dibutuhkan Afinitas yang konstan, 2.06 x 10
-7
M agar mAbnya seimbang. sebuah elusi penyangga
yang ideal untuk IAC harus efektif melepaskan protein tanpa mengurangi fungsi protein. antara
buffer elusi diuji, 0,1 M glisin dengan pH 2,5 bisa mengelusi 80% protein yang terikat.
penggunaan pH rendah pada buffer elusi tidak mempengaruhi aktivitas pengikatan mAb, M5B4,
ketika elusi diverifikasi di IC-ELISA, hasil ini sesuai dengan laporan sebelumnya.
pemurnian berbasis IAC dari RVG menggunakan mAb diajukan terhadap tetrapeptide
sintetis glikoprotein. Strategi pemurnian ini menjadi metode yang sangat spesifik dan sangat
sensitif dalam pemurnian RVG tanpa denaturasi protein. dalam penelitian ini juga, tingkat
kemurnian rRVG yang diperoleh, ditunjukkan pada SDS-PAGE (gambar 3) dan konformasi
pemurniannya juga tidak berubah ketika diperiksa di mAb (M5B4) dengan menggunakan IC-
ELISA. di samping itu, hasil dari percobaan in-vivo tikus, juga menegaskan bahwa
imunogenisitas rRVG itu tidak berubah setelah pemurnian dan 83% dari tikus yang diimunisasi
bebas dari intra-celebral. rRVG dengan kemurnian yang cukup dianggap menguntungkan karena
prosedurnya menghindari penanganan sampel secara berlebihan. Penggunaan mAb yang
mengikat bentuk trimerik dari protein, tidak hanya membantu untuk mencapai pemurnian tetapi
juga untuk selektif dalam memperkaya molekul imunogenik dari berbagai campuran bentuk
rRVG.
Hasil ini menunjukkan bahwa mAb berbasis IAC bisa menjadi teknik yang diandalkan
untuk pemurnian dari RVG tanpa mengubah konformasi asli dan properti imunogenik.

UCAPAN TERIMA KASIH
penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Abhinay, Srikanth, Sivakumar, Balaobulapathy,
Katyayani, Chandrasekar reddy dan Shailender sahu untuk bantuan teknis mereka. kami
berterima kasih kepada Madhurarekha dan monica kannan untuk Analisis Biacore dan MALDI-
TOF.