Secuencia del ADN

Qu es?

Secuenciar una molcula de ADN consiste en determinar en qu

orden se disponen los cuatro nucletidos (A, T, C y G) que
componen la molcula.

Un poco de historia

El primer mtodo diseado para secuenciar el ADN fue desarrollado por

Allan Maxam y Walter Gilbert en 1977.

Es un mtodo qumico que somete la molcula de DNA a distintos

mtodos de ruptura. Cada mtodo escinde la molcula all donde haya
un nucletido especfico.

Es un mtodo laborioso que ha sido sustituido por mtodos enzimticos

que, adems, se pueden llevar a cabo de forma automatizada.

Ms historia

El mtodo de Sanger fue diseado por Fred Sanger en 1977.

Tambin se conoce como mtodo didesoxi o secuenciacin por

terminacin de la cadena.

Mtodo enzimtico que permite determinar la secuencia del molde a

medida que se sintetiza su hebra complementaria.

Componente del mtodo de Sanger

Un ADN de cadena sencilla que acta como molde

Un cebador para iniciar la sntesis de ADN

Los cuatro didesoxirribonucletidos trifosfato (ddATP, ddGTP,

ddCTP y ddTTP) que son utilizados por la ADN polimerasa para construir
la nueva hebra. Una vez incorporados, impiden la adicin de nuevos
nucletidos.

ADN polimerasa

La secuenciacin se lleva a cabo en cuatro tubos.

Cada tubo contiene el molde, el cebador, los cuatro

desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP), la polimerasa y un
didesoxirribonucletido trifosfato (ddNTP) distinto en cada caso.

En cada tubo, cuando la ADN polimerasa incorpora aleatoriamente un

ddNTP la reaccin se detiene, de manera que se generan fragmentos
de distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP terminal.

Los diversos fragmentos se separan en funcin de su tamao mediante electroforesis

en gel de poliacrilamida.
Permite separar fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un slo nucletido.

A partir del gel se puede reconstruir la secuencia que se ha sintetizado, que es

complementaria a la secuencia del molde.

Mediante esta tecnologa, se puede determinar la secuencia de molculas de ADN de

hasta 800 nucletidos de longitud.

MEJORAS EN EL MTODO DE SANGER

Los ddNTP terminadores de cadena estn marcados

fluorescentemente.

Cada ddNTP se marca con un fluorforo distinto, que no interfiere en la

reaccin de la polimerasa y que emite luz con una longitud de onda
caracterstica.

De este modo, la reaccin se lleva a cabo en un slo tubo, no en

cuatro.

Se sustituye la ADN polimerasa por la Taq-polimerasa.

De este modo es posible automatizar el proceso como si se tratara de

una PCR.

En cada ciclo aumenta de forma exponencial el nmero de fragmentos

generados, cada uno marcado con una molcula fluorescente que
emite luz de distinto color, en funcin del ddNTP terminal.

Por eso, a este mtodo tambin se le conoce como secuenciacin

cclica.

La separacin de los fragmentos se realiza mediante electroforesis

capilar, que es ms rpida que la electroforesis en gel.

Los fragmentos de distintos tamaos llegan al final del capilar, donde

son excitados con un lser y se detecta la fluorescencia emitida por
el ddNTP terminal.

El color de esta fluorescencia determina de qu nucletido se trata.

El grfico resultante se denomina electroferograma, en el que se

observan picos de diversos colores.

Cada color indica qu nucletido ocupa cada posicin en la molcula de

ADN o, lo que es lo mismo, su secuencia.