CUPRINS

CUPRINS.......................................................................................................................1
INTRODUCERE...........................................................................................................2
Capitolul I
Ingineria genetic. Istoric, cadru gnosologic.................................................................3
Capitolul II
ADN recombinant..........................................................................................................6
II.1 Clivarea ADN-ului..............................................................................................8
II.2. Secvenierea ADN............................................................................................13
II.3. Hibridizarea acizilor nucleici..........................................................................19
II.4 Clonarea...........................................................................................................23
Capitolul III
Izolarea i sinteza artificial a genelor.........................................................................42
/
Capitolul IV
Aplicaii ale tehnologiei ADN-recombinant la om......................................................48
Capitolul V
Cercetrile de inginerie genetic i umanitatea...........................................................66
CONCLUZII................................................................................................................69
BIBLIOGRAFIE..........................................................................................................70

INTRODUCERE

Fiecare epoc a dezvoltrii societii umane s-a caracterizat prin atenia

deosebit acordat unui domeniu sau altuia. Se cunoate de exemplu faptul c secolul
XX a fost denumit secolul electronicii datorit dezvoltrii fr precedent pe care a
cunoscut-o aceast tiin. n acelai timp ns, tot mai multe voci autorizate
consider c secolul XXI va fi secolul biotehnologiei care este cea mai nou tiin
dei bazele ei au fost puse nc din antichitate.
n sens larg, biotehnologia poate fi definit ca fiind tiina ce se ocup cu
studiul organismelor vii n scopul mbuntirii calitii umane. Biotehnologia este o
tiin de grani ce presupune mbinarea cunotinelor de biochimie, genetic,
microbiologie, ecologie, tehnologii alimentare, medicin i altele.
Un domeniu deosebit de interesant i n acelai timp cel mai recent al
biotehnologiei l reprezint ingineria genetic. Pe ct de controversat, pe att de
incitant, acest domeniu presupune o solid pregtire teoretic i practic n domeniul
geneticii, biochimiei i biologiei moleculare, iar scopul urmrit este acela de a
revoluiona n primul rnd medicina i industria alimentar.
Pn spre sfritul anilor 1970, ADN-ul a fost una din moleculele celulare
cele mai greu de analizat biochimic; astzi, ns, situaia s-a schimbat radical: dintr-o
molecul foarte greu de studiat, ADN-ul a devenit molecula cea mai uor
caracterizabil. Este posibil astzi s se excizeze regiuni specifice ale moleculei, s se
determine secvena n nucleotide a acestor regiuni i s se reproduc o cantitate
nelimitat din acestea. Prin variante ale aceleiai tehnici, o gen izolat poate fi
modificat i transferat napoi la celulele de cultur sau, mai greu, n celulele
germinale la animale.

Capitolul I

Ingineria genetic. Istoric, cadru gnoseologic.

Ingineria genetic este una dintre cele mai moderne ramuri ale biologiei,
este un produs al avntului tiinei n epoca contemporan, al revoluiei tiinifice i
tehnice. Apariia acestei ramuri a geneticii a fost determinat, n primul rnd, de
aprofundarea cunotinelor de genetic la nivel molecular, de dezvoltarea cercetrilor
privind genele, cromozomii i n general materialul genetic al vieuitoarelor, fapt care
a permis elaborarea unor metode noi de izolare i de sintez a genelor, i de transfer al
lor de la o specie la alta, uneori foarte ndeprtate din punct de vedere filogenetic, de
cultur in vitro a celulelor i de hibridare celular. n al doilea rnd, ingineria genetic
este produsul necesitilor care impun gsirea unor modaliti noi de rezolvare a unor
mari probleme a umanitii, cum sunt: nevoia crescnd de alimente i n primul rnd
de proteine, problema profilaxiei i tratamentului celor peste 2 500 maladii ereditare
umane, problema transformrii maligne a celulelor i a cauzelor sale, problema
influenei civilizaiilor industriale asupra fondului genetic al diferitelor specii de
vieuitoare.
Ingineria genetic, care s-a dezvoltat rapid n ultimii ani, poate fi definit ca
un ansamblu de metode i tehnici moderne, prin care este posibil manipularea
materialului genetic la nivel celular i molecular. Astfel, prin cultura in vitro de celule
vegetale este posibil obinerea de organisme haploide i diploide pornind de la o
singur celul, transferul de gene n celulele lipsite de peretele celular (protoplatii)
sau chiar hibridarea ntre celule vegetale i animale (Cmpeanu et al., 2000).
Ingineria genetic la nivel molecular se realizeaz prin izolarea i sinteza
artificial de gene, realizarea de ADN recombinant i transferul de gene de la un
organism la altul, uneori foarte ndeprtate din punct de vedere filogenetic. De
exemplu, s-a reuit transferul de gene de la procariote la eucariote i viceversa. n
felul acesta, prin acionarea la nivel celular i molecular se pot produce artificial
genotipuri noi cu caracteristici determinate anticipat. Pe aceast baz au aprut
noiuni noi cum sunt: chirurgia genetic, sinteza de genomuri, manipularea genetic,
hibridare celular i molecular...
Primele cercetri de inginerie genetic s-au realizat nc n anul 1944 cnd
O. T. Avery, C. M. Mac Leod i M. Mac Carty au reuit transformarea genetic la

bacterii, adic transferul artificial al unor gene de la un tip de pneumococi la altul,

prin intermediul ADN. Aceste cercetri au constituit prima experien de genetic i
biologie molecular, tiina ce studiaz ereditatea la nivel molecular. Ulterior
experiene de transformare genetic s-au realizat la alte bacterii, precum i la
organismele mai evoluate de tip eucariot (Raicu, 2002).
Un alt domeniu al ingineriei genetice n care s-au realizat unele cercetri
valoroase l constituie chirurgia cromozomial, prin care s-a reuit transferarea de
cromozomi sau segmente de cromozomi de la o specie la alta. n acest sens, n 1940,
J. G. O`Mara a elaborat o metod de combinare a caracterelor a dou specii prin
transferul unuia sau mai multor cromozomi de la o specie la alta. n urma cercetrilor
bazate pe aceast metod s-a reuit realizarea de cariotipuri sintetice att la plante ct
i la animale.
Tot de domeniu ingineriei genetice fac parte i cercetrile pentru obinerea
de himere la plante i animale. Astfel s-au obinut experimental himere vegetale i /
sau mozaicuri genetice la animale.
n principiu, apariia ingineriei genetice a fost determinat, n primul rnd,
de aprofundarea cunotinelor de genetic la nivel celular i molecular, de dezvoltarea
cunotinelor privind materialul genetic al organismelor vii, i anume:

descoperirea mecanismelor principale de transmitere a informaiei

ereditare: transformarea (A. Avery, C. Mac Leod, M. MacCarty,
1944) - prin intermediul fragmentelor de ADN; sexducia (J.
Lederberg, E. Tatum, 1946) prin conjugarea bacteriilor i trasducia
(J. Lederberg, 1952) cu ajutorul fagilor.

descoperirea structurii moleculei de ADN (J.Watson, E. Crick,

1953);

descoperirea i izolarea enzimelor de restricie i legare a

fragmentelor de ADN (H. Smith, 1970);

descoperirea fenomenului transcripiei inverse a informaie genetice

de la ARN la ADN (H. Temin, S. Mizutani, D Baltimor, 1970).

descoperirea sintezei chimice a genelor (A. Kornberg, 1967; H.

Khorana, 1970, 1976).

Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil cunoaterea

structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea
tehnologiei ADN-ului recombinat i la transferul de gene peste barierele de specie.
Schematic etapele desfurrii ingineriei genetice le putem prezenta n felul
urmtor (fig.1):

Fig.1 Etapele principale ale ingineriei genetice: inserarea ntr-o celul

eucariot a ADNrec cu ajutorul unui vector de gene, clonarea prin multiplicare
celular n cultur, obinerea proteinei de interes (dup Strachan i Read, 2001)

Capitolul II

ADN recombinant
Pn la sfritul anilor 1970, ADN-ul a fost una din moleculele celulare cele
mai greu de analizat biochimic. Astzi, situaia s-a schimbat radical. Dintr-o molecul
foarte greu de studiat, ADN-ul a devenit molecula cea mai uor caracterizabil. Este
posibil astzi s se excizeze regiuni specifice ale moleculei, s se determine secvena
n nucleotide a acestor regiuni i s se produc o cantitate nelimitat din acestea. Prin
variante ale aceleiai tehnici, o gen izolat poate fi modificat i transferat napoi la
celulele n cultur sau n celulele germinale la animale.
Aceste realizri tehnice au avut un mare impact asupra biologiei celulare
permind studiul celulei i al macromoleculelor sale prin modaliti neimaginabile
pn nu demult.
Prin ADN recombinant nelegem o molecul de ADN format prin legarea
unor fragmente provenite din molecule diferite, proces ce se poate realiza spontan sau
ca urmare a unor manipulri genetice. Noiunea de manipulare genetic este
aplicabil la o varietate de tehnici utilizabile n mod egal att in vitro ct i in vivo.
Prin manipulare genetic se realizeaz producerea de combinaii inedite de material
informaional ereditar, prin inseria de fragmente variabile de acizi nucleici n
virusuri, plasmide bacteriene sau orice alt fel de vector i, apoi, transferul i
ncorporarea lor ntr-un organism gazd, astfel nct acestea s fie capabile s se
menin ca atare, s se propage i s-i etaleze funciile specifice.
Tehnologia ADN recombinant se bazeaz pe:
utilizarea endonucleazelor restrictive (enzime de restricie);
complementaritatea

aranjrii

celor

dou

lanuri

de

ADN

monocatener, complementaritate determinat de specificitatea legrii

pereche a bazelor purinice i pirimidinice (A ntotdeuna legat de T,
C ntotdeauna legat de G).
Tehnologia ADN recombinant include o serie de tehnici printre care se
numr (Covic et al., 2004):

1. clivarea specific a moleculelor de ADN cu endonucleaze de

restricie, care faciliteaz izolarea i manipularea genelor
individuale;
2. determinarea

rapid

secvenelor

de

nucleotide

(secvenierea) din fragmente purificate de ADN, ceea ce face

posibil determinarea precis a informaiei purtate de o gen;
3. hibridarea acizilor nucleici care permite gsirea precis a
anumitor secvene din ADN sau ARN, bazndu-se pe
capacitatea

de

asociere

lanurilor

nucleotidice

complementare;
4. clonarea ADN, prin care un fragment specific de ADN este
integrat ntr-un element genetic autoreplicativ (plasmid,
virus), introdus ntr-o bacterie care genereaz astfel milioane
de copii identice ale fragmentului;
5. ingineria genetic, prin care secvenele de ADN sunt
modificate pentru a se crea versiuni modificate ale genelor, i
sunt inserate napoi n celul.
Cele mai importante momente care au contribuit la dezvoltarea tehnologiei
ADN-ului recombinant au fost marcate de ctre cei mai de vaz savani (Cmpeanu et
al., 2000):
1869 Miescher a izolat pentru prima dat molecule de ADN.
1944 Avery a demonstrat c ADN reprezint moleculele care poart informaia
genetic.
1953 Watson i Crick propun structura de dublu helix a ADN, bazai pe rezultatele
cercetrilor de difracie cu raze X ale lui Franklin i Wilkins.
1957 Kornberg descoper ADN-polimeraza, enzim utilizat astzi pentru
producerea de probe marcate de ADN.
1961 Marmur i Doty descoper renaturarea ADN, stabilind specificitatea reaciilor
de hibridare a ADN.
1962 Arber pune pentru prima dat n eviden existena endonucleazelor de
restricie. Ulterior, Nathans i H. Smith utilizeaz aceste enzime pentru
caracterizarea secvenelor de ADN.
1966 Nirenberg, Ochoa i Khorana descifreaz codul genetic.

1967 Gellert descoper ADN-ligaza, enzim utilizat pentru legarea fragmentelor de

ADN.
1972-1973 Au fost descoperite tehnicile de clonare a ADN n laboratoarele de la
Universitatea Stanford i de la Universitatea California din San Francisco, de
ctre Boyer, Cohen, Berg i colaboratorii.
1975 Southern descrie hibridizarea prin transferul din gel, folosit pentru detectarea
secvenelor specifice de ADN.
1975-1977 Sanger i Barrel i respectiv, Maxam i Gilbert au descoperit metodele
rapide de secveniere a ADN.
1981.1982

Palmiter i Brinster au produs oareci transgenici; Sprandling i

Rubin au produs musculia de oet transgenic.

1985 Mullis i colaboratorii au inventat reacia de polimerizare n lan (PCR).

II.1 Clivarea ADN-ului

n perioada anterioar deceniului 7, nu au existat metode care s permit
clivarea macromoleculelor de ADN n fragmente de dimensiuni determinate.
Cercetrile privind restricia modificaia indus de gazd au relevat ns c acest
proces are loc cu intervenia unor enzime specifice endonucleaze. Astfel de enzime
au fost izolate mai nti de la E. Coli K12 (endonucleaza acestei bacterii manifestnd
un comportament deosebit de complex) i, ulterior, de la Haemophilus influenzae. Se
cunosc n prezent peste 500 de enzime de restricie cu situsurile de restricie
corespunztoare (Mange i Mange, 1990).
Tehnologia ADN recombinant actual este n ntregime dependent de
posibilitatea de clivare a ADN-ului la nivelul situsurilor specifice, utiliznd
endonucleaze de restricie. Acestea din urm, rup moleculele dublu catenare de ADN
la nivelul unor situsuri determinate de secvene specifice de nucleotide, producnd
astfel, fragmente de ADN de mrimi strict definite. Diferitele specii de bacterii
posed endonucleaze de restricie cu diferite specificiti de secven astfel c este
uor de gsit o enzim care produce fragmente de ADN ce cuprind o gen particular.
Aceste fragmente de ADN pot fi utilizate ca punct de pornire pentru purificarea genei
de interes. Mai important, aceste fragmente de ADN se folosesc ca material de pornire
pentru producia de gene nalt purificate, n cantiti nelimitate, prin tehnica clonrii
ADN.

Voi arta, n continuare, cum se folosesc endonucleazele de restricie pentru

obinerea fragmentelor de ADN specifice.
Endonucleazele de restricie sunt produse de ctre bacterii pentru a se
proteja de virusuri prin degradarea ADN viral. Fiecare tip de nucleaz recunoate o
secven specific, format din patru pn la opt nucleotide. Sistemele de restricie
permit bacteriilor monitorizarea provenienei moleculelor de ADN ptrunse n celul,
determinnd distrugerea acestora n situaia n care sunt recunoscute ca non-self.
Endonucleazele de restricie recunosc secvene specifice de baze azotate la nivelul
moleculelor de ADN ptrunse n celul, pe care le cliveaz n fragmente. Deoarece
secvene asemntoare pot exista i n propriul genom al bacteriei, ele sunt protejate
de aciunea endonucleazei corespunztoare prin metilarea A sau C din interiorul lor;
secvenele prezente n interiorul ADN strin nu sunt metilate, de aceea pot fi rupte
sub aciunea endonucleazelor de restricie.
Prima endonucleaz de restricie izolat i studiat aparine bacteriei E. Coli,
tulpina K. Izolarea acesteia a fost posibil prin fracionarea unui extract celular. Ea
este alctuit din trei subuniti: o subunitate specific care este rspunztoare de
identificarea situsului de recunoatere, o subunitate de modificare i o subunitate de
restricie. n prezena SAM (S-adenosilmetionin), enzima se cupleaz cu ADN-ul, la
nivelul unei secvene de recunoatere bipartite, indiferent dac aceasta este metilat
sau nu (n cazul enzimei de la E. Coli K AACN6GTGC). Dac secvena de
recunoatere este metilat pe ambele catene (la nivelul celei de-a doua adenine din
secvena de mai sus i la adenina din poziia complementar timinei, pe catena
opus), ATP-ul stimuleaz disocierea enzimei de la nivelul ADN-ului. Dac situsul
ete hemimetilat (este metilat doar pe o caten), ATP-ul stimuleaz i metilarea celei
de-a doua catene, cu SAM ca donator de grupare metil. Dac, ns, situsul este
nemetilat, clivarea va avea loc (Tudose et al., 2000).
Clivarea macromoleculelor de ADN are loc n felul urmtor: enzima sufer
mai nti o translocaie n lungul ADN, peste regiunea la care s-a cuplat iniial (situsul
de recunoatere). Clivarea se produce ulterior, la o distan de cteva kilobaze de
situsul de recunoatere. Procesul debuteaz cu producerea de bree n cele dou
catene i este posibil s implice dou molecule de enzim, fiecare pentru cte o
caten. Att translocarea enzimei, ct i producerea breelor (prin hidroliza legturilor
fosfodiester) necesit ATP.

Enzimele care manifest astfel de proprieti poart denumirea de

endonucleaze de restricie de tip I, fiind echivalente sistemelor de restricie
modificaie de tip I. Ca i alte endonucleaze de restricie, aceste enzime recunosc
secvene specifice la nivelul ADN, dar nu sunt deosebit de utile n manipularea
genelor, deoarece execut clivajul relativ ntmpltor.
Dup elucidarea proprietilor restrictazelor de tip I, a fost descoperit o
nou endonucleaz de restricie la Haemophilus influenzae tulpina Rd, enzim care a
devenit prototipul unei noi clase de endonucleaze de restricie de tip II, enzime ce
s-au dovedit eseniale n ingineria genetic. Ele efectueaz clivaje la nivelul unor
secvene foarte specifice de ADN, genernd fragmente cu lungime i secven definit
i fiind, n prezent, cele mai comune i mai utilizate enzime de restricie.
Tipul III de endonucleaze de restricie (de exemplu, EcoP1) este relativ
rar i nu este utilizat n manipularea genelor.
Datorit noilor descoperiri n genetic (restrictaza Eco57I), aceast
clasificare s-a extins pn la apariia unui nou tip IV de endonucleaze.
Tabel.1 Caracteristicile principalelor clase de endonucleaze de restricie (Wilson i
Muraz, 1991 citat de Cmpeanu et al., 2000)
Caracteristica
Tip I
Tip II
Tip III
Uniti separate, cu
Activitate de
Enzime separate,
Enzim unic,
funcie de
restricie i
cu o subunitate
multifuncional
endonucleaz sau
modificaie
comun
de metilaz
Structura
polipeptidei cu
funcie de
Trei subuniti
unic
Dou subuniti
restrictaz
cofactori
ATP, Mg2+, SAM
Mg2+
ATP, Mg2+, SAM
Secvena la nivelul
EcoB:
situsului de
TGAN*8TGCT
Secvene cu axe de EcoP1: AGACC
specificitate al
EcoK:
simetrie rotaional
EcoP15:
gazdei
AACN6GTGC
CAGCAG
Probabil randomic,
La 24-26 pb, n
la cel puin 1000 pb Forte aproape de
direcie 3 fa de
Situs de clivaj
de situsul de
situsul de
situsul de
specificitate al
specificitate
specificitate
gazdei
Translocare n
Da
nu
Nu
lungul ADN
Situsuri specifice
Situsuri specifice
Situsuri specifice
Situs de metilare
din ADN-ul gazdei din ADN-ul gazdei din ADN-ul gazdei

Marea majoritate a endonucleazelor de tip II recunosc i cliveaz ADN-ul la

nivelul unor secvene particulare, tetra-, penta-, hexa- sau heptanucleotidice,
caracterizate prin prezena unei axe de simetrie rotaional. De exemplu, punctele de
clivare caracteristice pentru E.coli sunt:
ax de simetrie

5`

G A A*

3`

C T T

A* A

G -

Aceste puncte determin apariia de capete de tipul 5`P i 3`OH. O astfel de

secven poart denumirea de secven palindromic. Structura format de ADN
cuplat cu aceast enzim a fost pus n eviden prin cristalografie cu raze X.
Dac secvena int este modificat prin metilare, astfel nct n locul celor
dou baze azotate notate cu asterix apare 6-metiladenina, situsul devine rezistent la
restricie.
Fragmentele aprute prin clivare cu EcoRI au regiuni monocatenare
nemperecheate 5`, astfel nct se pot circulariza, sau se pot cupla cu capetele unei
alte molecule ADN ce ofer regiuni terminale monocatenare complementare,
conducnd la apariia unei molecule ADN recombinate artificial. Capete de acest tip
poart denumirea de capete cozive sau adezive (engl. sticky sau cohezive-ends).(fig.2)
Unele enzime (PstI), ns, produc fragmente cu capete 3`-terminale coezive.
Altele (HaeIII), ns, determin apariia de fragmente la nivelul crora nu exist
poriuni monocatenare libere. Astfel de capete poart denumirea de capete necoezive
sau drepte (engl. blunt-ends) (Strachan i Read, 2001).
De exemplu, fenomenul de restricie const din: dou sue A i B de E. coli
sunt infectate cu fagul i etalate pe o cultur. Pe cultura corespunztoare suei A,
sunt observate plgile de liz. Pe cnd plgile de liz ale suei B nu sunt detaabile.
ADN fagilor suelor A i B sunt analizate prin tehnica Southern. i se constant c
acolo unde nu a avut loc liza ADN din fag, acesta este degradat n fragmente discrete
i reproductibile (fig. 3).

10

Asocieri intermoleculare

Asocieri intramoleculare

AATT

AATT

5`

5`
5`

5`
TTAA

TTAA
AATT
5`
5`
TTAA

A
A
T

AATT
5`

AATT

T
A
A

5`
TTAA

TTAA

Fig. 2 Capetele coezive produse la nivelul unor fragmente de ADN de ctre nucleaza
EcoRI (adaptat dup Stine, 1989)
Restrictazele reprezint instrumentul de baza al ingineriei genice , deoarece
au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci).
Prima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae
serotipul i se folosea pentru fragmentare a ADN ului virusului SV-40 i cartarea
lui (Kelly i Smith, 1970 citai de tudose, 1993).
Nu toate restrictazele se utilizeaz n ingineria genic, ci doar acele care au
urmtoarele proprieti:
pot tia molecula de ADN n fragmente discrete;
posed o specificitate de aciune nalt (taie molecula de ADN
ntr-o anumit succesivitate site-ul de recunoatere);
11

T
T

 pot forma, n rezultatul restriciei, margini lipicioase la

capetele fragmentului de ADN ( aceast proprietate nu este caracteristic tuturor
restrictazelor);
pot fi formate relativ uor n stare pur din mediul incubaional.

Fig. 3. Reprezentarea schematic a fenomenului de restricie

12

II.2. Secvenierea ADN

Astzi a devenit posibil determinarea secvenei de nucleotide a
fragmentelor de ADN de orice lungime. Deoarece volumul de informaie stocat n
secvenele de ADN ale celulelor eucariote este foarte mare, folosirea acestor tehnici
nu este posibil fr utilizarea computerului.
Secvenializarea prezint procesul de identificare a succesiunii bazelor
nucleotidice dint-o molecul de ADN sau ARN. Prima secveniere reuit a fost
efectuat de R. W. Holley&co. n 1965, pe alanin-ARNt din drojdie. Procedeul folosit
avea la baz hidroliza selectiv a legturilor internucleotidice cu fragmentarea
controlat a moleculei de ARNt. n prezent s-au impus dou tipuri de metode de
secveniere: metoda chimic (Maxam & Gilbert, 1975) i metoda enzimatic (Sanger
& co., 1975). Aceasta din urm a devenit procedura standard pentru secvenierea
ADN. Ea se bazeaz pe sinteza in vitro a ADN n prezena nuclezid-trifosfailor
inhibitori ai creterii catenei (Raicu, 2002).
Secvenializarea chimic se bazeaz pe procedee de alterare a bazelor punice
i pirimidinice, urmat de excizia acestora (depurinare, respectiv depiriminidizare) i
clivarea consecutiv specific lanului polinucleotidic. Procesul se realizeaz n patru
recipiente diferite, n fiecare din ele producndu-se clivarea la nivelul bazelor alterate;
se obin patru tipuri de fragmente corespunztoare secionrii la nivelul A, C, G, i T.
Separarea electroforetic ulterioar a fragmentelor de clivaj permite identificarea
secvenei oligonucleotidelor n molecula care ne intereseaz.
Secvenierea enzimatic (metoda dideoxi- sau metoda lanului terminal)
utilizeaz ADN monocatenar i un primer care se fixeaz la un capt al acestuia.
Lanul de ADN monocatenar ce trebuie citit servete ca matri pentru sinteza in vitro
de noi secvene de ADNc. Principiul metodei enzimatice const n urmtoarele:
(a)

ADN-ul care trebuie secvenializat este utilizat ca matri

pentru sinteza in vitro, de ctre ADN-polimeraza unei serii de replici pariale. Toate
aceste replici ncep din acelai locus, dar se termin n diferite puncte de-a lungul
catenei de ADN matri. Cheia acestei metode const n folosirea unui nucleotid
modificat care, dac este ncorporat n catena care se sintetizeaz, blocheaz alungirea
n continuare a acesteia. Dac nucleotidele normale folosite pentru sinteza lanurilor
de ADN sunt de tip trifosfat-dezoxiribonucleotide, nucleotidele modificate sunt
13

trifosfat-di-dezoxiribonucleozide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP). De exemplu,

ddATP intr n competiie cu un exces de dezoxi-ATP (dATP), astfel c alungirea
fiecrei catene de ADN care se sintetizeaz de ctre ADN-polimeraza, se blocheaz
atunci cnd, ntmpltor, se introduce un ddATP la mperecherea cu Timina (T).
Astfel se genereaz fragmente de ADN nou sintetizat de diferite lungimi, fiecare
terminndu-se cu Adenina (A). Aceste fragmente sunt apoi detectate prin folosirea
unui primer oligonucleotidic marcat (chimic sau radioactiv).
(b)

Pentru determinarea unei secvene complementare, se folosesc

patru sisteme de reacie pentru aceeai caten matri de ADN; n fiecare din aceste
reacii se folosesc cte una din cele patru nucleotide modificate. Produsele acestor
reacii se analizeaz apoi prin electroforez n patru linii de migrare alturate. Deci,
secvena de baze a fragmentului de ADN matri se poate astfel determina.
Metodele de secveniere a ADN sunt mult mai simple i mult mai rapide
dect cele utilizate pentru determinarea secvenei aminoacizilor ntr-o protein. De
aceea, determinarea secvenei de aminoacizi dintr-o molecul proteic se face prin
determinarea secvenei de nucleotide din gena acestei proteine. Pentru aceasta, se
determin secvena de nucleotide din moleculele de ADN complementar (ADNc),
sintetizate pe baza ARNm corespunztor proteinei de interes. Apoi se folosete, cu rol
de dicionar, codul genetic, pentru a se traduce secvena de nucleotide n secven de
aminoacizi (Mixich i Cruce, 1997).
Odat cu descoperirea tehnicilor de secveniere a ADN, oamenii de tiin au
dobndit posibilitatea de a determina ntreaga secven de nucleotide din moleculele
de ADN ale genomului uman (3x109 nucleotide). Aceste secvene specific toate
moleculele de proteine i de ARN care intr n alctuirea corpului uman, iar
cunoaterea lor va oferi un adevrat dicionar al corpului uman, ceea ce va
revoluiona studiile asupra celulelor i esuturilor umane.
Tehnici de secveniere a ADN. n biologia molecular, cunoaterea
complet a unei molecule de ADN const n determinarea secvenei sale nucleotidice.
Pe baza secvenei se poate determina ulterior chiar i funcia unei gene, comparnd
secvena studiat cu secvena altor gene, cu funcie cunoscut. Mai mult, n clonare,
informaiile privind secvena sunt indispensabile.

14

Secvena nucleotidic a unui fragment de ADN poate fi determinat fie

printr-o procedur chimic, pus la punct de Alan Maxam i Walter Gilbert, fie printro tehnic enzimatic dezvoltat de Fred Sanger; aceast din urm metod (numit i
metoda dideoxinucleotidic) este cea mai frecvent utilizat n laboratoare.
a)

secvenierea

ADN

prin

metoda

dideoxinucleotidelor:

dideoxinucleotid reprezint o molecul produs artificial, lipsit de gruprile

hidroxil, aflate n mod normal la nivelul carbonului 2` i 3` ale moleculei de
dezoxiriboz. n contrast, o dezoxiribonucletid natural prezint o grupare hidroxil la
nivelul carbonului 3` al subunitii glucidice.
n timpul replicrii normale, o nucleozid-trifosfat natural este legat, prin
gruparea sa 5`- P, la gruparea 3`-OH al ultimei nucleotide adugate catenei de
cretere. n cazul n care ultima nucleotid ataat este o dideoxinucleotid, sinteza de
ADN este blocat, deoarece formarea legturii fodfodiesterice, necesar atarii
urmtoarei nucleotide , nu mai este posibil.
n principiu, primul pas n secvenierea ADN-ului prin aceast metod, este
reprezentat de mperecherea complementar a unei oligonucleotide sintetice cu un
segment predeterminat al catenei de ADN a vectorului de clonare, n apropierea
situsului de inserie a ADN-ului clonat. secvena oligonucleotidic va funciona ca
primer, oferind gruparea 3`-OH necesar iniierii sintezei ADN-ului.
Proba de ADN cuplat cu primerul, este distribuit apoi n patru tuburi de
reacie diferite. Fiecare tub conine cte patru deoxinucleotide (dATP, dCTP, dGTP i
dTTP), una dintre acestea fiind radiomarcat, precum i una dintre cele patru
dideoxinucleotide, diferit i specific n fiecare tub de reacie (ddATP, ddCTP,
ddGTP i ddTTP) (Simon i Shneider, 1998).
Concentraia fiecrei dideoxinucleotide, n fiecare tub de reacie, este aleas
cu grij, pentru a asigura ncorporarea acesteia n orice situs posibil. Condiiile
experimentale sunt aceleai n fiecare tub. Consecutiv sintezei enzimatice, n care este
implicat ADN-polimeraza, fiecare tub de reacie va conine un mic set de
oigonucleotide, fiecare incluznd secvena primerului.
Reaciile de sintez sunt blocate prin adugarea de formamid, care va
mpiedica formarea de legturi complementare ntre catenele de ADN sintetizate, iar
moleculele de ADN sunt apoi separate prin electroforez, n gel de poliacrilamid.

15

Aceast separare permite diferenierea fragmentelor de ADN care difer ca

lungime doar printr-o singur nucleotid. Ulterior se efectueaz autoradiografia
gelului, care va prezenta doar fragmentele de ADN marcate, produse n timpul etapei
de sintez enzimatic; fiecare din cele patru fronturi (benzi) din gel corespunde unui
tub de reacie, care conine una din cele patru dideoxinucleotide utilizate.
Secvena unui segment de ADN clonat este determinat notnd ordinea
benzilor, ct mai corect posibil, de la partea inferioar spre cea superioar a
autoradiogramei.
b) utilizarea bacteriofagului M13 pentru obinerea de ADNmc. Una
dintre cele mai moderne strategii de depistare a secvenei complete a unei molecule
de ADN este cea bazat pe folosirea bacteriofagului M13 (caracteristic pentru E. coli)
ca vector.
Bacteriofagul M13 este n prezent folosit ca un sistem combinat, utilizabil
att n clonarea, ct i secvenierea ADN-ului. n mod obinuit, ADN-ul ce urmeaz a
fi investigat (sub 500 pb), este introdus la nivelul unui situs multiplu de clonare
(MCS), plasat n secvena modificat a genei lacZ, inserat la rndul su n molecula
dublu catenar ce reprezint forma replicativ a fagului M13.
ADN-ul astfel pregtit este introdus ntr-o cultur competent de E. coli.
Dup nsmnare i incubare, att coloniile albe, ct i cele albastre
(coninnd fagul) se dezvolt pe mediul coninnd ca substrat X-gal, care se
descompune ntr-un precipitat albastru cnd este hidrolizat de ctre -galactozidaza
recombinat, produs al genei lacZ.
Coloniile albe, productoare de particule M13, conin segmentul de ADN
cercetat, inserat la nivelul genei lacZ, care determin incapacitatea celulelor de E.coli
de a sintetiza -galactozidaz i implicit de a descompune X-gal. Coloniile albastre,
cu gena lacZ funcional, nu conin ADN-ul inserat (Rogoz i Perciulac, 2002).
Particulele M13, produse de coloniile albe, sunt izolate i folosite ulterior ca
surs de ADNmc, pentru secveniere(fig.4). n acest scop se folosete un primer
oligonucleotidic , care poate hidroliza ADN-ul mc M13, n apropierea situsului de
inserie a ADN-ului clonat. Ulterior se aplic protocolul de secveniere cu
deoxinucleotide, iar secvena ADN-ului inserat va fi citit pe autoradiograma gelului.

16

Situs multiplu de clonare

lacZ
lacI

Secven clonat de
ADN
lacI

lacZ

OH

OH

P1

P1

Fig.4. Utilizarea bacteriofagului M13 ca vector de clonare i secveniere

(dup Rogoz, 2002)
c) secvenierea prin metoda extensiei primerului (primer walking). Pentru
segmentele de ADN de dimensiuni foarte mari (de peste 500 pb), sistemul de
secveniere bazat pe bacteriofagul M13, deosebit de eficient n alte situaii, devine
nepracticabil i consumator de timp, datorit necesitii producerii unui numr imens
17

de vectori M13, care s includ secvenele suprapuse din care s se poat reconstrui
fragmentul ce urmeaz a fi secveniat.
Pentru a depi acest inconvenient, au fost puse la punct strategii de clonare
bazate pe plasmide de ADNdc, care nu necesit etape intermediare de subclonare. n
aceste protocoale, plasmida de ADN ce conine secvena ce urmeaz a fi investigat, a
crei secven de baz este complementare a unei catene a vectorului, la nivelul unei
regiuni alturate situsului de inserie a ADN-ului clonat. n continuare se recurge la o
secveniere prin metoda dideoxinucleotidic, determinndu-se ordinea i identitatea
primelor 250 - 350 nucleotide ale insertului de ADN. Pe baza acestei analize, se va
sintetiza apoi un al doilea primer oligonucleotidic, care s fie complementar celor cca
300 nucleotide, plasate imediat dup regiunea de legare a primerului sintetizat iniial.
Cel de-al doilea primer, va fi folosit apoi n secvenierea dideoxinucleotidic, pentru
stabilirea identitii i ordinii urmtoarelor 250 350 de nucleotide. Procedeul va fi
repetat pn ce ntreaga secven de ADN este cunoscut.
Metoda a primit denumirea de secveniere prin extensia primerului.
n cazul laboratoarelor angajate n secvenierea unor fragmente cu
dimensiuni de mii de perechi de baze, au fost puse la punct, recent, procedee
automate de secveniere (in silico). n multe din protocoalelor aplicate, primerii sunt
cuplai cu diferii markeri fluoresceni, cu emisie diferit atunci cnd sunt excitai cu
lumin cu o lungime de und specific. n acest fel, benzile care se formeaz n gel, n
urma electroforezei vor putea fi scanate cu un laser, fiecare rspuns fluorescent, fiind
identificat cu precizie de un computer, care va furniza n final, secvena ADN-ului
analizat (Covic, 2004).

II.3. Hibridizarea acizilor nucleici

Tehnicile de hibridizare a acizilor nucleici se bazeaz pe dou din
proprietile eseniale ale acestora:

Denaturarea

ruperea

legturilor

dintre

bazele

complementare cu disocierea rapid a duplexului ADN n

dou lanuri monocatenare;

18

Renaturarea

(hibridizarea)

capacitatea

lanurilor

monocatenare de a forma / reface helix-ul bicatenar prin

legarea de un lan monocatenar complementar.
Reaciile de hibridizare se pot produce ntre lanuri de ADN sau ARN cu
formarea de hibrizi ADN/ARN, ADN/ADN sau ARN/ARN.
Folosirea tehnicilor de hibridizare n vederea obinerii de informaii despre
moleculele de ADN sau ARN care ne intereseaz implic folosirea unei sonde
(molecul monocatenar de ADN sau ARN, marcat chimic sau radioactiv,
complementar total sau parial moleculei de analizat).
Astfel, n 1975, Grunstein i Hogness, au pus la punct un procedeu care
permite detecia unei secvene de ADN la nivelul unor colonii transformate, prin
hibridizare in situ, cu sond de ARN, marcat radioactiv. Astfel se obine o
identificare rapid a coloniilor purttoare a secvenelor respective, printre multe alte
multe colonii. O modificare a metodei permite screening-ul coloniilor cu o densitate
foarte mare.
Coloniile ce vor fi supuse screening-ului vor fi mai nti replicate pe un
filtru de nitroceluloz n vederea inoculrii lor pe plci agarizate. Se pstreaz setul
original de colonii sau placa-master.
Filtrul cu colonii se ndeprteaz de pe plac i se trateaz cu soluii alcaline
n vederea lizrii celulelor i denaturrii ADN-ului. Se aplic un tratament cu
proteinaz K pentru ndeprtarea proteinelor i pstrarea ADN-ului denaturat ataat la
filtrul de nitrocelulz (pentru care prezint o nalt afinitate). Se obine astfel
amprenta ADN a coloniilor. ADN-ul este ireversibil fixat la filtru, prin incubare la
80C. Ulterior, filtrul este expus la ARN radiomarcat, iar rezumatul este evaluat
autoradiografic. Coloniile care se prezint la autoradiografie ca avnd amprenta
pozitiv, pot fi replicate de pe placa-master.
Marele avantaj al metodei este universalitatea sa, n sensul c secvena
genic nu trebuie n mod necesar s se exprime. Metoda se poate aplica virtual
oricrei secvene, cu condiia existenei unei sonde potrivite pentru aceasta.
Metoda screening-ului prin hibridizarea acizilor nucleici este extrem de
util, cu condiia existenei unei sonde. Problema izolrii unei gene est6e deci
echivalent cu problema obinerii unei sonde potrivite. Exist cteva soluii pentru
rezolvarea acestei probleme:

19

n anumite esuturi i celule specializate, un tip de ARNm particular

este abundent, sau chiar super-abundent. Clonele de ADNc
corespunztoare se pot obine prin screening-ul unui numr mic de
recombinani, direct prin secveniere. Aceste sonde de ADNc vor fi
apoi utilizate pentru identificarea secvenei din ADN-ul genomic;

secvenele de acizi nucleici ce codific anumite proteine sunt relativ

bine conservate, astfel nct hibridizarea interspecific a acizilor
nucleici este pe deplin posibil. Exemple de astfel de sonde
heterologe (strine) sunt genele pentru histone, actin, factorul de
cretere al neuronilor etc. Secvena genic izolat de la un organism
va fi la fel util pentru a fi folosit ca sond pentru genele
corespunztoare de la alte organisme;

oligonucleotidele (14 20 nucleotide lungime), care corespund

parial secvenei codificatoare a proteinei de interes, pot fi sintetizate
chimic. n sintetizarea unor astfel de sonde trebuie ns inut cont de
caracteristica de degenerare a codului genetic, fiind necesar s fie
cunoscut secvena parial a proteinei pentru care se caut secvena
codificatoare.

Dac moleculele de ADN aflate n soluie sunt expuse la temperatura de

100C sau la un pH foarte ridicat (>13), perechile de baze complementare care in
legate cele dou catene ale dublului helix de ADN, sunt rupte, ducnd la disocierea
moleculelor n lanuri monocatenare. S-a crezut iniial c acest proces, numit ADNdenaturare, este ireversibil. n 1961, s-a observat c lanurile monocatenare
complementare se pot reasocia n dublu helix dac sunt inute mai mult timp la 65C.
Acest proces a fost numit ADN-renaturare sau hibridizare. Asemenea reacii de
hibridizare pot avea loc n orice lanuri monocatenare de acizi nucleici, cu condiia ca
secvena lor nucleotidic s fie complementar (Covic et al., 2004).
Posibilitatea de a diviza o molecul de ADN n fragmente reproductibile
permite analiza ulterioar a secvenei lor n nucleotide. Ceasta este posibil prin
determinarea fragmentelor de restricie care hibridizeaz cu o secven specific
cunoscut de ADN, numit prob. Tehnica se numete Southern blot, dup numele
celui care a elaborat-o Edward Southern. Fragmentele de restricie de ADN din proba
de analizat sunt separate prin gel-electroforez, iar distribuia lor n benzi este

20

prezervat prin denaturarea i transferul lor pe o membran de nitroceluloz (blotting)

care reprezint un substrat solid i cu suprafa negativ. Membrana de nitroceluloz
este apoi expus la o secven specific cunoscut de ADN sau ARN marcat
radioactiv (proba). Secvenele de ADN complementare hibridizeaz cu aceast prob
marcat i pot fi identificate pe membrana de nitroceluloz prin aoutoradiografie.
Aceast tehnic este att de sensibil nct permite detectarea unei secvene de ADN
care apare doar o singur dat n genomul uman, dintr-o cantitate doar de 5 g de
ADN (cantitate echivalent cu coninutul a doar 106 celule). Acest test este astzi
frecvent utilizat pentru studiul genetic al indivizilor umani pentru stabilirea gradului
de nrudire al membrilor unei familii. Indivizii din populaia uman manifest un
polimorfism genetic. Aceste variaii genetice sunt, printre altele, indicate de prezena
sau absena unor situsuri de restricie particulare de ADN.
Tehnica Northern blot, numit aa datorit aplicrii sale dup tehnica
Southern blot, este utilizat pentru detectarea unor secvene specifice de ARN. Pentru
aceasta moleculele de ARN dintr-o prob sunt denaturate i amestecate cu un agent
care previne formarea de zone dublu-catenare intramoleculare (formaldehida).
Probele de ARN sau chiar ntregul ARN izolat din celule, se separ dup mrime prin
gel-electroforez, la fel ca n tehnica Southern blot, i apoi se transfer pe membrane
de nitroceluloz, la care moleculele de ARN denaturate i extinse ader. Membranele
sunt apoi expuse la probe de ADN marcate i supuse autoradiografiei. Probele astfel
preparate arat prezena, cantitatea i mrimea moleculelor de ARNm dintr-o prob
studiat, procedura fiind frecvent utilizat pentru compararea cantitii de ARNm din
celule n anumite condiii.
O alt tehnic a crei denumire se aseamn cu cea descris mai sus, este
tehnica Western blot. n aceast procedur, o prob de proteine separate prin
electroforez sunt transferate pe membrane de nitroceluloz. Aceste membrane sunt
apoi expuse la anticorpi radioactivi elaborai mpotriva proteinelor de interes,
autoradiografiate i examinate.
Acizii nucleici, la fel ca i celelalte macromolecule, ocup poziii precise n
celul. Extracia lor face ca informaia privind aceast localizare, uneori foarte
preioas s se piard. De aceea au fost elaborate tehnici n care probele de acizi
nucleici sunt utilizate pentru localizarea precis a secvenelor particulare de ADN in
situ (la fel ca i utilizarea anticorpilor fluoresceni pentru localizarea proteinelor).
Tehnica se numete hibridizare in situ. Ea poate fi utilizat pentru localizarea n celul
21

att a ADN, ct i a ARN. Probele de acizi nucleici marcate, pot fi hibridizate direct
pe cromozomi, dup ce acetia au fost expui pentru scurt timp la valori foarte
ridicate de pH, ceea ce produce desfacerea ADN n cele dou catene complementare.
Regiunile cromozomiale care leag proba sunt apoi vizualizate. Iniial, vizualizarea sa realizat prin folosirea unor probe puternic marcate radioactiv, prin autoradiografie.
Ulterior, s-a constatat c rezoluia spaial a acestei tehnici poate fi mult mbuntit
prin marcarea chimic a probelor. Pentru aceasta probele se sintetizeaz cu nucleotide
care conin radicali chimici modificai (Mixich i Cruce, 1997).
Metodele de hibridizare in situ pot fi folosite i pentru evidenierea
distribuiei n celule a moleculelor specifice de ARN. n acest caz, celulele nu sunt
expuse la valori ridicate de pH i astfel, ADN-ul rmne dublu catenar, neputnd lega
proba. Pentru evidenierea ARN, esutul se fixeaz, proces n urma cruia moleculele
de ARN sunt reinute n structuri i se pot hibridiza cu o prob complementar de
ADN sau ARN. n acest fel se pot evidenia genele care se exprim activ.

II.4 Clonarea
Plasmidele vehicule de clonare. Plasmidele reprezint una dintre cele mai
importante categorii de vehicule de clonare. Ele sunt uniti de tip replicon, stabil
transmise de a o generaie celular la alta, n stare extracromozomial. Evident, nu
orice material genetic extracromozomial reprezint o plasmid, dar definiia dat se
aplic acelor elemente caracterizate prin omogenitate genetic, stare monomeric
constant i capacitatea de a se replica independent de cromozomul bacterian.
Definiia include i profagii fagilor temperai de tip P1, care pot fi meninui n celul
ca material extracromozomial i nu integrat n mod necesar n cromozomul bacterian.
Tot aici se ncadreaz i formele replicative ale colifagilor filamentoi, care codific
producerea i eliberarea continu de particule fagice, fr liza celulei gazd.
Cele mai multe plasmide exist sub form de molecule de ADN de circulare.
Dac ambele catene de ADN reprezint cercuri intacte, se poate vorbi despre ADN
circular nchis covalent sau CCC ADN (Covalently Closed Circles). Dac una dintre
catene este intact, iar cealalt conine o bre, este vorba despre un cerc deschis
OC ADN ( Open Circle).

22

Cnd este izolat din celule, ADN CCC prezint o deficien de rsucire.
Datorit diferenelor de structur, macromoleculele de ADN CCC i ADN-ul circular
deschis (fig.5) pot fi separate prin electroforez n gel de agaroz. Adiia unui
colorant de intercalare (cum este bromura de etidiu) provoac dezrsucirea ADN-ului
plasmidial superrsucit. Excesul de bromur de etidiu va determina ns restabilirea
superrsucirii, dar n direcie opus. Acest comportament este exploatat n metodele
de izolare de ADN plasmidial.
ADN superrsucit

ADN giraza

Endonucleaz

Topoizomeraza

Endonucleaza

ADN ligaza

ADN relaxat, circular,

nchis covalent

ADN circular, deschis

Fig.5 Interconversia conformaional a moleculelor de ADN (dup Rogoz,

2002)
n ultimii ani au fost izolate i plasmide cu structur neobinuit, de la o
serie de bacterii. Un exemplu l constituie plasmidele ADNdc liniare de la Borrellia
sp.. Ambele tipuri de plasmide au o greutate i structur molecular care le apropie de
virusurile animale.

23

Plasmidele sunt larg rspndite la procariote, avnd o greutate molecular

cuprins ntre 1 x 106 200 x 106 daltoni (Stine, 1989).
O parte dintre caracterele fenotipice conferite prin prezena plasmidelor sunt
prezentate n tabelul 2. n cazul plasmidelor la care nu este cunoscut expresia
fenotipic, se aplic expresia de plasmid criptic.
Tabel 2 Caractere fenotipice controlate de gene plasate la nivelul plasmidelor
Rezistena la antibiotice
Producerea de antibiotice
Degradarea unor compui aromatici
Producerea de hemolizin
Fermentarea unor glucide
Producerea de enterotoxine
Rezistena la metale grele
Producerea de bacteriocine
Inducerea formrii de tumori la plante
Producerea de hidrogen sulfurat
Restricia i modificaia controlat de ctre gazd
Se deosebesc dou mari tipuri de plasmide conjugative i nonconjugative, n funcie de prezena sau absena unui set de gene implicate n
transferul de material genetic (genele tra), care controleaz conjugarea la bacterii.
Clasificarea plasmidelor se bazeaz i pe capacitatea lor de a fi meninute
sub form de unic copie sau copii multiple n celule. Plasmidele multipl copie se
mai numesc plasmide cu control relaxat, n timp ce plasmidele meninute ntr-un
numr redus sau n unic exemplar n celul se mai numesc i plasmide cu control
stringent.
n general, plasmidele conjugative au o greutate molecular mare i se
gsesc n celul n numr de 1-3 copii / cromozom, n timp ce plasmidele
neconjugative sunt mult mai mici, iar numrul de copii / cromozom poate fi mare
(tabel. 3).
O etap esenial n clonarea realizat cu ajutorul plasmidelor este reprezentat de
purificarea ADN-ului plasmidial. Cu toate c au fost izolate, pn n prezent, o larg
serie de plasmide ADN, metodele ridic nc o serie de probleme. Etapa critic de
izolare este liza celulei gazd, deoarece liza complet a acesteia conduce la scderea
drastic a randamentului de recuperare a ADN-ului plasmidial. n mod ideal, celula ar
trebui lizat parial, de aa manier nct s permit plasmidei (plasmidelor) s se

24

elibereze, fr a se contamina cu ADN cromozomial. Dac liza este efectuat n

condiii blnde, cea mai mare parte a ADN-ului cromozomial va avea greutate
molecular foarte mare i va putea fi uor ndeprtat, mpreun cu resturile celulare,
prin intermediul centrifugrii de mare vitez, ceea ce va conduce la obinerea unui
lizat clar. Dintr-un astfel de lizat se va izola ulterior ADN-ul plasmidial.
Tabel.3: Proprietile unor plasmide conjugative i non-conjugative, de la
microorganisme Gram-negative (dup Rogoz, 2002).
Numrul de
Plasmida
Dimensiunea
Conjugativ
copii ale
Fenotipul
(Mda)
plasmidei /
celul
ColE1
4,2
Nu
10 15
Producerea de
colicin E1
RSF 1030

5,6

Nu

20 40

Rezisten la
ampicilin

clo DF13

6,0

Nu

10

Producerea de
cloacin

R6K

25,0

Da

13 38

Rezisten la
ampicilin i
streptomicin

62,0

Da

12

Mediaz conjugarea

RI

62,5

Da

36

Rezisten multipl la
antibiotice

Ent P 307

65,0

Da

1-3

Producerea de
enterotoxin

Una dintre primele metode de purificare a ADN plasmidial a fost pus la

punct de Radloff i colab., n 1967. Aceast metod implic centrifugarea izopicnic a
lizatului clar ntr-o soluie de CsCl coninnd bromur de etidiu. Bromura de etidiu
are proprietatea de a se intercala ntre perechile de baze azotate ale ADN-ului,
provocnd dezrsucirea acestuia. O molecul de ADN plasmidial circular nchis
covalent, nu prezint ns capete libere, astfel nct dezrsucirea sa este limitat, ca i
cantitatea de bromur de etidiu cu care se poate cupla. Pe de alt parte ns, ADN-ul
cromozomial fragmentat se gsete sub form liniar i se va cupla cu mult mai multe

25

molecule de bromur de etidiu. Deoarece densitatea complexului ADN bromur de

etidiu scade odat cu creterea numrului de molecule de bromur de etidiu, iar pe de
alt parte, la moleculele liniare de ADN se leag mai mult bromur de etidiu dect la
cele circulare, este evident c ADN-ul plasmidial CCC va avea o densitate mai mare
ntr-o soluie saturat de bromur de etidiu. n aceste condiii, ADN CCC (plasmidele)
se vor putea separa prin ultracentrifugare de ADN-ul cromozomial liniar (Israil,
2000).
n mod obinuit, metoda curent de extracie i purificare a ADN-ului
plasmidial este cea propus de Birboim i Doly (1979). Aceast metod se bazeaz pe
observaia existenei unei benzi de pH foarte redus (12,0-12,5) la care ADN-ul liniar
denatureaz, n timp ce ADN CCC rmne intact. Celulele coninnd plasmide sunt
tratate cu lizozim, pentru labilizarea structurii peretelui celular, i ulterior sunt lizate
cu hidrixil de sodiu i SDS (dodecil sulfat de sodiu). ADN-ul cromozomial cu
greutate molecular mare denatureaz. Dup neutralizarea cu acetat acid de sodiu,
ADN-ul cromozomial renatureaz i formeaz o reea insolubil. n paralel, acetatul
de sodiu, la concentraie mare, provoac precipitarea complexelor SDS proteine i a
ARN-ului de greutate molecular mare. Dac etapa de denaturare alcalin este atent
controlat, ADN CCC rmne n stare nativ i va fi izolat prin centrifugare i
concentrare prin precipitare cu etanol.
Purificarea se mai poate realiza i prin electroforez, utilizndu-se agaroz
cu punct de topire redus, ceea ce faciliteaz extracia ADN-ului plasmidial din gel.
Un vehicul de clonare ideal ar trebui s se prezinte trei caracteristici
eseniale (Covic, 2004):

greutate molecular mic;

capacitatea de a conferi un caracter marker uor selectabil celulei

gazd n care a fost introdus;

situsuri unice pentru un mare numr de endonucleaze de restricie, de

preferin la nivelul unor gene a cror expresie fenotipic se distinge
uor.

Exist mai multe avantaje oferite de greutatea molecular mic a unui

vector, n primul rnd acela c, plasmidele mici sunt mai uor de manipulat, fiind mai
rezistente la fragmentare mecanic i, de asemenea, mai uor de izolat din celula
gazd. Greutatea molecular mic favorizeaz prezena mai multor copii ale

26

plasmidei n celul. Totodat un vector de dimensiuni reduse va avea, n mod evident,

mai puine situsuri de restricie.
Dup ce fragmentul de ADN strin este inserat n vector, structura primar
care rezult va trebui introdus, prin transformare, ntr-o celul gazd potrivit.
Deoarece eficiena transformrii este destul de redus, este esenial ca himera s poat
determina un fenotip uor detectabil la nivelul gazdei, n condiiile n care
transformarea a avut loc cu succes. n general, un astfel de fenotip este reprezentat de
rezistena la antibiotice, codificat de gene aparinnd vectorului, dar exist i situaii
cnd markerul este o gen de la nivelul ADN-ului inserat.
O prim etap n clonaj este reprezentat de clivajul ADN-ului vectorului i
a ADN-ului strin cu ajutorul aceleiai endonucleaze, pentru generarea aceluiai tip
de capete, la nivelul fragmentelor generate. Este avantajos ca inseria ADN-ului strin
s provoace (dup ligare i formarea moleculei himere) inactivarea unei gene marker
a vectorului, ceea ce se transpune ntr-un fenotip uor identificabil. Evident,
inactivarea prin inserie nu este esenial atunci cnd vectorul i ADN-ul insert sunt
supui ligrii prin metoda cozilor homopolimerice, sau dac ADN-ul strin confer
un nou fenotip celulei gazd.
n continuare vom prezenta cteva exemple de plasmide utilizate n clonare.
Denumirea de plasmid natural este aplicabil acelor vehicule care nu sunt
constituite in vitro, cu scopul unic de a fi utilizate n clonare. O astfel de plasmid
natural este ColE1 care codific sinteza de bacteriocine, respectiv colicina E1.
Plasmida este, de asemenea, purttoare de gene care confer imunitate fa de colicina
E1 a celulei bacteriene.
Plasmida RSF2124 reprezint un derivat al plasmidei ColE1, purttoare a
unei secvene aparinnd unui transpozon i specific rezistena la ampicilin.
O alt plasmid, a crei origine a fost mult timp neclar, este pSC101. Se
tie astzi c aceast plasmid aparine speciei Salmonella panama, fiind anterior
denumit SP-219. Detalii privind aceste plasmide sunt prezentate n tabelul 4.
n scopul clonrii de ADN cu ajutorul pSC101, att moleculele de ADN
plasmidial, ct i ADN strin trebuie supuse restriciei cu EcoRI, i ulterior puse n
comun, ntr-un mediu coninnd ADN-ligaz. Molecula hibrid obinut va fi apoi
utilizat pentru transformarea unei gazde care poate exprima rezistena la tetraciclin.

27

Tabel.4: Proprietile unor plasmide naturale, utilizate n clonarea ADN-ului

Plasmida

Dimensiunea
(Mda)

pSC101

5,8

ColE1

4,2

RSF2124

7,4

Situsuri unice
pentru
endonucleaze
XhoI, EcoRI
PvuII, HincII
HpaI
HindIII,
BamHI
SalI
EcoRI
EcoRI, BamHI

Markerul
pentru selecia
transformanilor
rezisten la
ampicilin

Imunitate la
colicina E1
Rezisten la
ampicilin

Inactivarea
inserional a
genei

rezisten la
tetraciclin
Producerea de
colicin E1
Producerea de
colicin E1

ColE1 i plasmidele derivate din aceasta prezint cteva avantaje fa de

pSC101. n primul rnd, ele sunt meninute n celul sub form de copii multiple
numrul lor putnd fi crescut dac bacteriile sunt cultivate pe un mediu coninnd
cloamfenicol. Cnd acest antibiotic este adugat n mediul de cultur al unei tulpini
de E. coli purttoare de ColE1, aflat n faz tardiv de log, replicarea cromozomilor
acestor celule va nceta, datorit necesitilor celulare de sintez proteic continu.
Aceast necesitate nu afecteaz ns replicarea plasmidei ColE1, astfel nct dup 1012 ore, 50% din ADN-ul celular va fi reprezentat de ADN plasmidial. Prin aceast
metod se pot obine ntre 1000 i 3000 de copii ale acestei plasmide / celul, rezultat
care evideniaz necesitatea etapei de mbogire cu cloramfenicol a mediului de
cultur (Rogoz, 2002)..
Cu toate c sunt extrem de utile, att plasmida pSC101, ct i ColE1 i
RSF2124, prezint o serie de dezavantaje pentru experimentele de clonare. Din acest
motiv, au fost ntreprinse importante eforturi pentru construirea, in vitro, a uni vector
de clonare, superior plasmidelor naturale.
Cel mai versatil i folosit vector de clonare este n prezent plasmida
artificial pBR322. Aceasta conine determinanii Apr i Tcr provenii de la RSF2124
i respectiv pSC101, alturi de elemente necesare replicrii, provenite de la pMB1,

28

plasmid similar ColW1 (fig.6).

Originea acestei plasmide precum i a

predecesoarei sale pBR313 este extrem de complex (Coprean, 1999).

29

4363/1

Regiunea derivat din

pRSF2124

Regiunea derivat din

pSC101
Apr

Tcr

Origine

3147

1763

Regiunea derivat din

pMB1
Fig.6: Plasmida pBR322 originea regiunilor componente (Coprean, 1999).
n prezent secvena ADN-ului pBR322 este complet descifrat. Secvena
publicat iniial cuprindea 4362 pb. Aceasta a fost ulterior revizuit, prin includerea
unei perechi de baze CG n poziia 526, ceea ce a condus la creterea dimensiunilor
sale la 4362 pb.
Descifrarea complet a secvenei pBR322 este deosebit de util, pentru c a
permis cunoaterea precis a situsurilor de clivaj pentru endonucleazele de restricie,
i de asemenea, a lungimii exacte a fragmentelor generate prin clivaj. Aceste
fragmente pot astfel servi drept markeri pentru orice alt fragment, a crui lungime
poate fi comparat cu acestea.
Exist peste 20 enzime de restricie cu situs unic de clivaj la nivelul
pBR322. Situsul int pentru apte dintre aceste enzime este chiar la nivelul genei Tcr,
iar situsurile de clonaj a nc dou nucleaze se afl la nivelul promotorului acestei
gene.
Exist, de asemenea, trei situsuri unice de clivaj a trei endonucleaze, situsuri
aflate la nivelul secvenei genei Apr. Este evident c, n cazul clonrii n pBR322 a
uni fragment de ADN strin, cu folosirea uneia dintre cele 12 enzime amintite, se va
produce inactivarea uneia (sau a ambelor) gene Apr i Tcr.
Dac se efectueaz transformarea celulelor de E. coli cu vector
recircularizat n urma ligrii cu ADN strin, celulele purttoare de plasmid la care
30

gena marker Tcr a fost inactivat inserional, pot fi deosebite de celelalte celule,
aceasta constituind dovada cert a prezenei insertului. Aceste celule vor fi Ap r / Tcs
(rezistente la ampicilin i sensibile la tetraciclin) n timp ce celulele la care insertul
lipsete din structura vectorului vor fi Apr / Tcr. n practic, transformanii se
selecteaz pe baza rezistenei lor la ampicilin, culturile fiind replicate pe mediu cu
tetraciclin, situaie n care, de pe plcile master se pot izola coloniile formate din
celule sensibile la tatraciclin.
Celulele transformate cu plasmida pBR322, la care a fost inactivat
inserional markerul Apr pot fi identificate chiar mai uor. Detecia se bazeaz pe
capacitatea -lactamazei, produs de celulele Apr de a converti penicilina la acid
peniciloic, ce reacioneaz cu iodul. Transformanii se selecteaz pe mediu complet,
coninnd amidon solubil i tetraciclin. Cnd coloniile de pe plci sunt expuse la iod
n iodur de potasiu (scufundate sau acoperite), coloniile Ap r vor clarifica soluia
indicator, n timp ce coloniile Aps nu.
Plasmida pBR322 este cel mai utilizat vehicul de clonare. n plus, ea este
larg folosit ca sistem model n cercetrile asupra transcripiei la procariote precum i
n investigaii asupra efectelor modificrile topologice la nivelul ADN. Toate datele
privind structura i funcia pBR322 au condus ns i la alte direcii de cercetare,
legate de detaliile structurii pBR322 i semnalele pentru transcripie, replicare,
amplificare, stabilitatea i mobilitatea n timpul conjugrii.
Bacteriofagi i cosmide vectori de clonare la Escherichia coli. Cel mai
cunoscut bacteriofag este bacteriofagul . Acesta este un sistem genetic deosebit de
complex i intens studiat, fiind un virus care infecteaz celulele de E. coli. Investigat
nc din primele faze ale manipulrii genetice, bacteriofagul a nceput de curnd s
fie utilizat i ca vehicul de clonare, fiind modificat pentru a deveni vector.
ADN , n forma n care este izolat din particula fagic, este o molecul de
cca. 48,5 kb. Secvena integral este cunoscut (Sanger i colab., 1982).
Fiecare capt al moleculei prezint extensii 5`-mc, de cte 12 pb,
complementare, astfel nct molecula se poate circulariza dup injectarea sa n celula
infectat. n forma natural, ADN prezint deci capete coezive, care se asociaz
formnd aa-numitul situs cos.
Genele nrudite funcional ale fagului sunt poziionate alturat, excepie
fcnd genele pozitiv reglatoare N i Q. Genele din partea stng a hrii genetice
liniare, convenionale (fig.7) codific proteinele capsidei i cozii particulei fagice.
31

Genele regiunii centrale sunt implicate n recombinare i procesul de lizogenizare, n

care genomul circularizat, se integreaz n genomul gazdei, perpetundu-se sub form
de profag.
Cap

Coad
xis

Capt AWB DEFZ

coeziv
stng
%

10

20

30

att
int

red
gam

40
50
60
Regiune neesenial

cro
N cl OP

70

80

Q SR

90

100

Fig.7: Harta genetic a cromozomului

Cea mai mare parte a regiunii centrale nu este esenial creterii fagului i
poate fi deletat sau nlocuit, fr consecine serioase asupra ciclului infecios al
fagului . Aceast caracteristic prezint n consecin o importan crucial n
construcia de vectori de clonare derivai de la genomul acestui fag.
n partea dreapt a regiunii centrale se gsesc plasate gene reglatoare i gene
de imunitate la suprainfecii (N, cro, cl), urmate de genele care controleaz replicarea
ADN (O i P), reglajul funciilor tardive (Q) i liza celulei gazd (S i R).
Moleculele de ADN pot fi mpachetate eficient n condiiile n care
situsurile cos (substratul pentru mpachetarea clivaj-dependent) au cca 37-52 kb
fiecare (75% din ADN-ul fagului nativ). Cercetrile au artat c, n realitate, doar o
foarte mic secven, plasat n proximitatea situsului cos, este absolut necesar
pentru mpachetare (Butnaru et al. 1999).
Au fost construite plasmide coninnd un fragment din ADN-ul , incluznd
situsul cos. Aceste plasmide au primit denumirea de cosmide i sunt larg folosite ca
vectori de clonare n conjuncie cu sistemele de mpachetare ale ADN, in vitro. n
figura ce urmeaz este reprezentat schema unui experiment de clonare n care este
folosit o cosmid.

32

Cosmid
Ap

cos

Situs int pentru

endonucleaza de
restricie

Fragment strin de
ADN de restricie

Endonucleaz
de restricie

ADN-ligaz (concentraie crescut de ADN)

etc.

cos

cos

37 52 kb
mpachetare
in vitro

Absorbie i
injectare

Transducia
particulei ce conine
ADN recombinant
Selecia clonei
Apr
ADN circularizat
dup injectare
Fig.8: Reprezentarea schematic a unui experiment de clonare
n care este utilizat o cosmid

33

Utilizarea vectorilor de tip cosmid impune o selecie atent a fragmentelor

inserate, n funcie de dimensiunile lor. Cu un vector cosmid de dimensiunea de 5
kb, se pot clona fragmente de ADN de 32-47 kb, deci cu mult mai mult, dect se
poate clona ntr-un vector fagic de tip . Mai mult, dup mpachetarea in vitro,
particulele obinute pot fi folosite pentru infecia unei gazde bacteriene potrivite.
ADN-ul recombinant al plasmidei se va recirculariza dup injectare, la fel ca
ADN-ul oricrui bacteriofag i se va putea, de asemenea, replica precum o plasmid
obinuit, fr a exprima ns nici o funcie fagic. Celulele transformate vor putea fi
selectate pe baza unei gene marker de rezisten la antibiotice, aparinnd cosmidei.
Toate caracteristicile prezentate au consacrat cosmidele n rolul de vehicule
de clonare preferate n experimentele n care se urmrete inseria unui fragment de
ADN strin de dimensiuni mari. Ele sunt n mod special folosite n scopul producerii
de bnci genomice (colecii de cosmide avnd inserate fragmente mari de ADN
genomic).
Vectorii de tip cosmid folosii n prezent aparin seriilor pWE i sCos i
prezint o serie de caracteristici comune cum ar fi:

MCS pentru ligarea cu uurin a unor fragmente netriate

dimensional;

promotori fagici care flancheaz situsul de clonare;

situsuri unice NotI, SacII sau SfiI (pentru clivri rare);

posibilitatea de ndeprtare a insertului ADN (datorit regiunilor

care flancheaz situsul de clonare), sub forma unui singur fragment;

module de expresie mamaliene, care codific markeri selectabili

dominani, n situaiile, cnd se intenioneaz transferul n celulele
de mamifer.

Exist i o alt categorie de combinaie ntre o plasmid i o secven

genomic a fagului , utilizat n clonare, oferind avantajele fiecrui tip de vector n
parte. Aceast combinaie const ntr-un vector plasmidial purttor al uni situs de
ataare (att) i a primit denumirea de fasmid. Fasmidele conin origini de
replicare funcionale, att de la fagul ct i de la plasmid, avnd n consecin,
capacitatea de a se propaga, fie ca fag, fie ca plasmid, n tulpini potrivite de E. coli.
Fasmidele pot fi folosite n diverse tipuri de experimente: de exemplu,
ADN-ul poate fi clonat ntr-un vector plasmidial, printr-o metod convenional

34

pentru ca ulterior, plasmida recombinant s fie transformat n fag. Particulele fagice

sunt uor de meninut, avnd o durat de via practic infinit.
Alternativ, o fasmid poate fi folosit ca vector de clonare, din care, ulterior,
va putea fi obinut o plasmid recombinant. Ultimul tip de vector de tip fasmid
construit este ZAP, care conine secvene aparinnd fagilor , M13, T3 i T7.
Oricare experiment de clonare a ADN decurge n patru etape eseniale:

aplicarea unei metode potrivite de generare a fragmentelor ADN;

reacii care s permit reunirea ADN-ului strin cu un vector

adecvat;

aplicarea unei metode care s permit introducerea moleculei

recombinant ntr-o celul gazd, n care aceasta s se poat replica;

selecia sau screening-ul clonelor celulare care posed molecula de

ADN recombinant.

Toate aceste etape, cu diferitele lor variante sunt reprezentate n fig.9.

Toate acestea depind de tipul clonei care se intenioneaz a se obine: de
ADNc sau de ADN genomic.
O banc de gene (gene bank sau gene library) reprezint o colecie complet
de fragmente de ADN din genomul haploid din genomul unui organism, meninute n
vectori de clonare corespunztori. Scopul principal al alctuirii unei bnci de gene
este acela de a avea la dispoziie n orice moment, un numr suficient de gene ale
unor secvene de ADN genomic de interes n vederea studiului structurii i funciei
acestora, ct i a prelucrrii lor interioare, prin mijloace specifice ale tehnologiei
ADN recombinant.
Realizarea unei bnci de ADN genomic uman, de exemplu, parcurge, n linii
generale, urmtoarele etape (Covic, 2004):

separarea ADN-ului celular total pe cale fizico-chimic;

clonarea ADN-ului separat cu o endonucleaz de restricie (ex.

EcoRI);

inseria i ligarea fragmentelor rezultate ntr-un vector de clonare

adecvat (ex. fagul );

screening-ul ADN-ului recombinant obinut, n vederea seleciei

clonei dorite.

35

Fragmente
de ADN

digestie cu
endonuclea
z de
restricie

fragmentare
mecanic

sinteza
duplexului
de ADN

sintez
chimic
direct

Jonciunea cu
vectorul

producerea
de cozi
homopolim
erice

ligarea
capetelor
coezive

ligarea
capetelor
boante
(fr
linker)

molecule
linker

Introducerea
n celula
gazd

Selecia sau
screening-ul

transfecie cu
ADN fagic
recombinant

genetic

transformare cu
ADN plasmidial
recombinant

imunochimic

hibridare
de acizi
nucleici

mpachetare in
vitro n capsida
fagic; transducie cu fagi
recombinani sau
cosmide

recombinaional

prin
Southwestern

Fig. 9: Schema general a cilor de clonare a ADN-ului la Escherichia coli (adaptat

dup Cmpeanu, 2000)
Aceast din urm etap este deosebit de laborioas innd cont de
dimensiunea informaiei genetice procesate: presupunnd c genomul uman haploid
conine cca 2,8 x 106 kb, iar EcoRI produce fragmente de ADN de aproximativ 4 kb,
36

rezult c se impune screening-ul a 7 x 105 molecule recombinante pentru a avea o

ans rezonabil de a identifica gena de interes.
Deci, este necesar s se obin un numr extrem de mare de recombinani (o
banc de gene de mari proporii) pentru a realiza o colecie a tuturor secvenelor de
ADN ale unui astfel de genom.
Exist ns cel puin dou probleme care pot s apar n cadrul acestui
demers. n primul rnd, o gen poate fi clivat n poriunea intern a secvenei sale de
ctre EcoRI, ceea ce va duce la imposibilitatea obinerii acesteia ca un unic fragment.
Acest lucru se ntmpl, de regul, atunci cnd gena are dimensiuni foarte mari. De
asemenea, fragmentul obinut ar putea fi mai mare dect capacitatea maxim de
receptare a vectorului. n aceast situaie, gena nu va putea fi clonat.
Toate aceste probleme pot fi depite prin metoda clonrii randomice a
fragmentelor de ADN de dimensiuni mari (peste 20 kb). Odat ce ADN-ul a fost
clivat aleator (randomic), practic nici o secven nu este exclus s fie clonat.
Clonele se vor suprapune parial una peste cealalt, oferind posibilitatea trecerii de
la o secven la alta, deci a identificrii ntregii secvene. Deoarece fragmentele de
ADN clonate sunt mai mari; vor fi deci necesare puine clone pentru a construi o
banc de gene complet (Cmpeanu et al, 2000).
Pentru a obine fragmente randomice cu dimensiuni apropiate, clivarea
mecanic este o soluie. De regul, ns, se folosesc procedee ce implic aciunea
endonucleazelor.
n strategia pus la punct de ctre Maniatis i colab. (1978) (fig.10) ADN-ul
int este clivat cu un amestec de dou enzime de restricie. Ambele enzime au
situsuri de recunoatere tetranucleotidice, frecvente n ADN-ul int, astfel se poate
obine o populaie de fragmente de dimensiune de cca 1 kb. Cum digestia este
efectuat o perioad restrns de timp, de regul se genereaz fragmente mult mai
mari (peste 10-30 kb). Un astfel de set de fragmente, suprapuse parial, acoper
ntreaga secven a ADN-ului int. Prin separare n gel de agaroz (electroforez),
sau ultracentrifugare n gradient de sucroz, se obine o populaie de fragmente
randomice cu dimensiuni de aproximativ 20 kb, potrivite pentru inserie n vectorul
de clonare (de tipul fagului ).

37

ADN eucariot cu GM mare (>100kb)

ADN Charon 4A (vector de nlocuire)

Clivare cu un
amestec de
HaeIII i AluI
(digestie foarte
incomplet

mperechere
complementar a
capetelor coezive
naturale ale

Fracionare pe
baz de talie
Cca 20 kb
Metilarea lui
EcoRI pentru
blocarea
situsurilor EcoRI

EcoRI

Ligarea capetelor
boante cu
molecule linker
de EcoRI
Fragmente interne
Fracionarea pe baz
de talie pentru
ndeprtarea
fragmentelor interne

EcoRI

mperecherea complementar a capetelor coezive ale EcoRI

Ligare

mpachetarea in vitro

Particul fagic

Fig. 10: Strategia de producere a unei bnci de gene procedeul Maniatis

38

n procedeul Maniatis, cele dou restrictaze au situsuri de recunoatere

complet diferite HaeIII i AluI. Aceste dou enzime produc capete drepte (bluntends), iar pentru clonare se adopt strategia linkerilor.
O simplificare a procedeului descris const n utilizarea unei unice enzime
cu situsuri frecvente de clivare, cum este Sau3AI. Fragmentele generate vor putea fi
clonate imediat ntr-un vector de mare capacitate, de tip , de exemplu pEMBL3,
care va fi clivat cu BamHI. Clivarea vectorului cu restrictaza BamHI determin
formarea de capete coezive (stiky-ends).
Aceast

metod

de

digestie

parial,

cuplat

cu

mpachetarea

recombinanilor fagului a fost intens utilizat ca strategie de producere a bncilor de

ADN genomic (Israil, 2000).
n locul vectorilor derivai din fagul se pot utiliza i cosmide, care prezint
avantajul unei eficiene superioare n ceea ce privete mpachetarea ADN-uli in vitro.
Clonarea ADNc are aplicaii speciale, care deriv din faptul c acest tip de
ADN este lipsit de introni, n mod normal prezeni n ADN-ul genomic corespunztor.
Intronii reprezint secvene fr funcie de codificare, prezente n interiorul
secvenelor genice la eucariote. Ei sunt situai de regul n interiorul secvenei
codificatoare, ntrerupnd relaia de colinearitate a genei cu catena polipeptidic pe
care o codific. Intronii pot aprea i la capetele 5` sau 3` netranslate ale unei gene; n
oricare din aceste cazuri, intronii sunt copiai n ARNm

de ctre ARN Pol, n

momentul n care aceasta transcrie gena.

Iniial, ARNm produs se constituie ntr-un transcript primar. Acesta va suferi
o serie de procesri n nucleu, nainte de a migra n citoplasm, ca ARN matur.
Procesarea transcriptului primar include eliminarea secvenelor intronice, proces care
poart denumirea de splicing.
Cnd ADNc este derivat din ARNm, acesta nu va conine de regul,
secvene aparinnd intronilor. Cum ndeprtarea intronilor prin splicing nu are loc i
la bacterii (deoarece acestea nu posed introni), clonele de ADNc sunt utile atunci
cnd se urmrete expresia unei gene eucariote la bacterii, sau atunci cnd produsul
genei este obiectivul primar al cercetrilor. n plus, astfel de clone sunt folosite n
experimente de hibridizare, atunci cnd secvena original din ADN-ul genomic este
cunoscut, n scopul stabilirii cu precizie a granielor introni / exoni.

39

n vederea obinerii unei bnci de clone de ADNc i screening-ului acestora

n scopul depistrii unei anumite secvene, mai nti este necesar s se stabileasc
natura populaiei fragmentelor de ARNm din materialul biologic investigat.
n multe esuturi i culturi de celule, ARNm manifest o abunden foarte
variabil, mai exact anumite tipuri de ARNm sunt prezente ntr-un numr foarte mare
de exemplare per celul, n timp ce alte tipuri sunt reprezentate doar de cteva copii.
De exemplu, n oviductele ginilor exist un tip de ARNm foarte abundent
ARNm al ovalbuminei, proteina major a albuului oulor. Deoarece ARNm este
foarte bogat reprezentat n acest caz, screening-ul su i clonarea ADNc al
ovalbuminei se realizeaz cu uurin (Tudose et al, 2000).
O alt cale de obinere a unui numr mare de clone de ADNc, este cea a
clonrii ADNc ntr-un vector de tip M13, de exemplu M13mp8. Setul de clone va
putea fi imediat secveniat i identificat pe baza polipeptidelor pe care fiecare clon
de ADNc le codific.
n cazul clonelor de ADNc cu abunden redus, se procedeaz n mod
normal la construirea unei bnci de ADNc. n mod normal, 10 5 clone vor fi suficiente
pentru ARNm cu abunden redus, din orice tip de celul. O eficien mrit n
obinerea ADNc, se poate obine realiznd mpachetarea in vitro cu ajutorul vectorilor
de tip . Vectorii inserionali (gt10, NM1149, ZAP i gt11) sunt n mod
particular potrivii pentru clonajul ADNc.
n metodele clasice de sintez de ADNc, ca urmare a autoiniierii replicrii
celei de-a doua catene a acestei molecule, pe catena matri complementar cu ARNm
(self-priming), exist dezavantajul pierderii unei mici secvene n cursul procesului de
replicare, secven corespunztoare captului 5` al ARNm.
Pentru evitarea acestui neajuns au fost dezvoltate mai multe strategii. Una
dintre cele mai simple dintre acestea (fig. 11) a fost pus la punct de Lang i
colaboratorii (1981).
n scopul eliminrii utilizrii nucleazei S1 au fost imaginate alte dou
metode. Ambele permit clonarea de ADNc ntreg, cu foarte mare eficien (Okayama
i Berg, 1982). Un avantaj particular al metodei Okayama-Berg, este posibilitatea de a
integra ADNc-ul ntr-un vector, adiacent promotorului T3, T7 sau Sp6, ulterior
ARNm putnd fi sintetizat in vitro de pe o caten definit de ADNc, folosind ARN
Pol fagic purificat.

40

ARNm
5`

Oligo - dt

AAAA 3`

revers-transcriptaz
+ 4 dNTPs
ARNm
5`
3`

AAAA 3`
T T T T 5`

ADNc

transcriptaz terminal
+ dCTP

ARNm
5`
3` CCC

AAAA CCC 3`
TTTT

ADNc

5`

Mediu cu gradient alcalin

de sucroz:
1. Hidroliza ARN
2. Colectarea de molecule
ntregi de ADNc

3` CCC

TTTT

ADNc

5`

Oligo dG, reverstranscriptaza + 4 dNTPs

5` GGG
3` CCC

3`
Duplex de ADNc

TTTT

5`

Inseria de vectori fie prin

cozi homopolimerice, fie cu
ajutorul linkerilor

Fig. 11: Reprezentarea schematic a etapelor unei metode mbuntite de sintez a

ADNc dublucatenar, cu lungime mare

41

Capitolul III

Izolarea i sinteza artificial a genelor

Progresele mari realizate n studiul structurii moleculare i funciei genelor
au fcut posibile izolarea i sinteza lor artificial. S vedem mai nti cum s-a efectuat
izolarea experimental a genelor.
Operaia izolrii genei a fost realizat n anul 1969 la Universitatea Harvard
din Statele Unite de ctre J. Beckwith i colaboratorii si. Cercetrile, publicate n
revista englez Nature, din noiembrie 1969, s-au efectuat pe bacteria Escherichia
coli, care are un singur cromozom de form circular pe care se gsesc circa 3000 de
gene. Printre acestea se afl trei gene notate cu x, y i ce determin sinteza a trei
enzime: -galactozidaza, galactozid-permeaza i transacetilaza, care intervin n
procesul de metabolizare a lactozei (prescurtat lac), din care mai fac parte i alte trei
gene care intervin n reglajul genetic al operonului respectiv (Cmpeanu et al., 2000).
Izolarea genei la bacteria E. coli se bazeaz pe fenomenele genetice de
transducie i sexducie (fig. 12). Iat care sunt etapele cele mai principale ale acestui
proces: mai nti s-a ataat de cromozomul bacterian fagul (de form circular),
alturi de operonul galactoz (gal), apoi s-a ataat alturi de fagul un factor F (tot de
form circular), care conine gene ale operonului lactoz (lac) (etapa I). Operonul
lac a fdost apoi inserat n cromozomul bacterian n mijlocul genei gal, iar fagul a fost,
de asemenea, inclus n cromozomul bacterian ntr-o regiune alturat, rmnnd ns
separat de operonul lac printr-un segment cromozomial (etapa II).
Dintre bacteriile care conin att factorul F ct i fagul s-au selecionat celule
mutante defective, deci care au pierdut segmentul cromozomial dintre operonul lac i
fagul (etapa III). n acest fel, fagul se gsete plasat alturi de operonul lac, (etapa
IV) i apoi capt o form circular avnd ns inclus operonul lac (etapa V). Prin
iradiere cu radiaii ultraviolete fagul a fost eliberat din cromozomul bacterian
mpreun cu operonul lac i apoi i-a recptat forma linear, avnd ns inclus la
mijloc operonul lac (etapa VI).

42

fag

Factor F

Cromozom
bacterian
ADN

lac

Etapa I
gena gal

Etapa II

gal

lac gal

ADN

Factor F

Etapa III

gal

fag

lac gal

ADN
fag
segment pierdut

Etapa IV

gal

lac

Factor F

ADN
fag

lac

fag recombinat

Etapa V

ADN
Iradiere UV

Etapa V

lac

fag recombinat linear

Fig.12: Etapele izolrii operonului lac la bacteria E. coli

Aceleai operaii de mai sus se efectueaz i cu cellalt fag transductant
phi80, astfel c la sfrit se obin fagi lineari care au inclus la mijloc operonul lac.
Dup aceea, cei doi bacteriofagi transductani, care au inclus n mijloc
operonul lac, au fost supui unui tratament cu cldur, prin care s-a produs
denaturarea ADN. Acest tratament determin ruperea punilor de hidrogen i
separarea celor dou catene. n cazul celor doi bacteriofagi i phi80, ADN-ul lor
este format dintr-o caten cu greutate molecular mai mic. Dup separarea catenelor
s-a ultracentrifugat materialul rezultat, izolndu-se astfel catenele grele de cele
uoare. S-au pus apoi mpreun catenele grele de la cei doi bacteriofagi i prin
scderea treptat a temperaturii a avut loc renaturarea ADN, adic refacerea structurii
bicatenare prin realizarea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene. Aceast
renaturare ns se realizeaz numai n regiunea operonului lac, acolo unde catenele
43

sunt complementare, n timp ce n rest catenele celor doi fagi, nefiind complementare,
rmn n stare liber.
n sfrit cu ajutorul unei enzime capabile s hidrolizeze ADN-ul
monocatenar are loc hidroliza i apoi eliminarea catenelor celor doi fagi, rmnnd
exclusiv operonul lac dublu catenar. Ulterior s-a reuit ca nsi operonul lac s fie
segmentat, astfel nct genele care-l alctuiesc au putut fi izolate n stare liber.
Izolarea genei este o realizare remarcabil a geneticii contemporane, ea
fcnd posibil studiul aprofundat al materialului genetic in vitro, precum i transferul
genelor izolate la alte specii. Se deschid astfel perspective extraordinare geneticii
aplicative n domeniul agriculturii, zootehniei i medicinii.
O alt realizare remarcabil a biologiei moleculare contemporane este
sinteza artificial a genelor.
Istoria sintezei artificiale a genelor ncepe n anul 1968, cnd geneticianul
american Arthur Kornberg, laureat al premiului Nobel, a realizat sinteza ADN de la
virusuri phi X 174. Acesta este unul dintre cele mai mici virusuri cunoscute, care are
un cromozom circular format din ADN monocatenar, alctuit dintr-o secven de
5375 de nucleotide. Acest virus este de fapt un bacteriofag, adic un virus al
bacteriilor.
Sinteza artificial a ADN viral s-a realizat folosind ca model ADN-ul natural
al virusului phi X 174, n mediul de reacie introducndu-se ADN-polimeraza care
determin polimerizarea nucleotidelor, cele patru tipuri de nucleotide care conineau
adenin, timin, guanin i citozin, din care una era marcat cu fosfor radioactiv
(32P) i o enzim de tipul ligazelor (forming rnzymes) care reunete capetele
macromoleculei de ADN. Pentru a putea identifica ADN-ul natural, acesta a fost
marcat cu un izotop radioactiv al hidrogenului i anume cu tritiu (3H) (fig. 13).
Studiul procesului de sintez a artat urmtoarele: mai nti are loc formarea
unei catene de ADN complementar cu ADN-ul viral. Ca urmare, se formeaz ADN
bicatenar. Cu ajutorul enzimei ligaza are loc apoi formarea de ADN bicatenar circular,
dar care este sintetizat artificial numai pe jumtate, deoarece una dintre catene este
natural.

44

ADN monocatenar (3H)

ADN-amors (3H)

ADN (3H)
ADN (32P)

Ligaz
polinucleotidic

X 174

ADN linear viral

ADN circular viral
ADN dublu catenar
ADN linear nou sintetizat
ADN circular nou sintetizat

ADN dublu catenar

ADN nou sintetizat

(32P)

Denaturare temperatur
+
Dezoxiribonucleaz

Ultracentrifugare

Nucleotide
+
ADN polimeraza
+
Ligaza polinucleotidic
ADN dublu
catenar circular
nou sintetizat

Fig. 13: Sinteza ADN in vitro de la fagul phi X 174

ntr-o etap urmtoare, mediul de reacie se nclzete, pentru a se realiza
denaturarea ADN, adic separarea celor dou catene, i se adaug enzima
dezoxiribonucleaza, care rupe molecula circular de ADN. Ca rezultat n mediu se vor
gsi: ADN circular monocatenar natural, ADN circular monocatenar nou sintetizat,
ADN linear natural i ADN linear nou sinterizat (Covic et al., 2004).
Pentru a putea separa prin ultracentrifugare ADN-ul natural de cel nou
sintetizat, s-a folosit un artificiu de tehnic, i anume s-a nlocuit baza azotat timina
cu bromuracilul, o substan foarte asemntoare chimic cu timina. Datorit atomilor
de brom ADN-ul artificial era mai greu dect cel natural i putea fi separat prin
centrifugare. n felul acesta s-a separat ADN-ul circular monocatenar nou sintetizat,
care a fost apoi folosit pentru realizarea sintezei de molecule similare de ADN dublu
catenar i monocatenar circular. ADN-ul artificial sintetizat complet artificial, dar
45

dup modelul natural a fost folosit pentru realizarea unor infecii bacteriene,
constatndu-se c el are capacitate infecioas. S-a demonstrat astfel c materialul
genetic viral sintetizat artificial este identic cu cel natural. Este pentru prima oar
cnd oamenii de tiin au realizat sinteza artificial de ADN i respectiv a unui
cromozom viral. Evident c de aici i pn la sinteza artificial a genei, n-a fost dect
un pas.
Profesorul G. Khorana, mpreun cu o echip de cercettori de la Institutul
de Tehnologie din Massachusetts, a realizat n 1970 pentru prima oar sinteza
artificial a unei gene de drojdie de bere. Este vorba de o gen relativ mic, format
dintr-un segment de ADN care conine o secven de 77 de nucleotide, gen ce
determin sinteza unui ARN solubil, care are rolul de a transfera aminoacidul alanina
la locul sintezei proteice. Iat cum s-a realizat sinteza artificial a acestei gene: mai
nti au fost sintetizate 15 tipuri de segmente scurte de ADN formate din 5-20 de
nucleotide. Apoi cu ajutorul enzimei ligaza, descoperit n 1967, s-a efectuat sudarea
enzimatic a segmentelor respective de ADN. Cu ajutorul unei alte enzime, kinaza
polinucleotidic, s-au obinut trei segmente de ADN dublu catenar, care apoi au fost
legate ntre ele i au dat natere primei gene sintetizate artificial n totalitate.
Ulterior, geneticianul D. Agarwal, un colaborator al profesorului G. Khorana
a comunicat, la cea de a 166 reuniune a Societii Americane de Chimie, c a reuit
sinteza artificial a unei gene la bacteria Escherichia coli, gen format dintr-o
secven de 126 de nucleotide. Aceast gen determin sinteza unui acis ribonucleic
solubil (ARNs), care transfer tirozina la locul sintezei proteice. n prealabil, doi
biochimiti englezi S. Altman i J. Smith au reuit s determine exact structura
molecular a genei respective i s identifice secvena caracteristic de nucleotide.
n anul 1975 geneticianul A. Efstradiatis i echipa sa de le Universitatea
Harvard au sintetizat artificial genele care intervin n producerea hemoglobinei la
iepure. Aceasta a fost prima sintez artificial a unei gene de la mamifere.

O echip de cercetri de la Institutul de chimie organic i biochimie

din Hamburg, condus de Koster, a sintetizat, n 1977, dup trei ani de
cercetri, gena uman care determin sinteza hormonului angiotensina II, care
intervine n reglarea tensiunii arteriale i a contraciei musculaturii netede.
Aceast gen este relativ mic, fiind format din numai 2 x 33 nucleotide, iar

46

angiotensina II este format dintr-o caten alctuit din numai 8 aminoacizi

(fa de hemoglobina format din 574 de aminoacizi).
n realizarea sintezei s-a pornit de la cunoaterea structurii hormonului
i s-a dedus structura genei. Datorit codului genetic degenerat exist de fapt
4600 de variante, care toate determin sinteza hormonului angiotensina II,
variante sinonime din punct de vedere genetic. Evident c s-a ales varianta care
prezenta cele mai puine dificulti n procesul de sintez (Cmpeanu et al.,
2002).
Gena sintetizat artificial este sinonim cu cea din organismul uman,
dar nu identic. De fapt aici nu este necesar identitatea, deoarece numai
produsul genei este identic.
Gena artificial nu cuprinde i secvene de nucleotide care determin
reglarea sa, fenomen care la mamifere este aproape total nerecunoscut.
Cercettorii respectivi i-au propus s conecteze la capetele genei scurte
secvene reglatoare, sintetizate artificial sau provenite de la bacterii, pentru a
studia funcionarea lor.
Mai recent, sinteza artificial a genelor se realizeaz pornindu-se de
la ARNm, care, cu ajutorul enzimei revers-transcriptaza, determin sinteza de
ADN complementar i respectiv de gene.
Implicaiile sintezei artificiale a genelor sunt deosebit de importante.
Mai nti se prevede posibilitatea ca genele sintetizate artificial s fie inserate
n virusuri sau plasmide, care vor putea transfera genele respective n celulele
bacteriene. Ca urmare, bacteriile vor putea ncepe sinteza unor antibiotice,
hormoni, enzime, proteine alimentare etc. Bacteriile care pot fi cultivate uor i
ieftin vor putea astfel produce diferite substane farmaceutice, alimente etc. pe
o cale complet nou i de mare eficien.
n al doilea rnd, genele sintetizate artificial vor putea probabil fi
implantate n celulele cu gene defecte care determin apariia unor maladii
ereditare umane. Terapia genic va nsemna tratamentul unor maladii ereditare
ntr-un mod radical, nu prin combaterea efectelor, ci prin eliminarea cauzelor,
deci a genelor cu defecte.

47

Capitolul IV

Aplicaii ale tehnologiei ADN-recombinant la om

IV.1. Recombinarea genetic la om

Recombinarea genetic este procesul prin care materialul genetic transmis
de la ascendeni la descendeni formeaz, prin rearanjare (reasortare, redistribuie)
combinaii genetice noi, ce determin manifestri fenotipice diferite (recombinani).
Recombinarea genetic la eucariote se realizeaz ntre uniti genetice de
mrime variat: genom, cromozom, gen. Ele se asociaz prin fuziune nucleaz n
cursul fecundrii (hibridare sexual) n cazul recombinrii genomice sau prin
fenomenele genetice specifice meiozei, pentru recombinarea cromozomial i genic
(Covic et al., 2004).
Recombinarea genomic se realizeaz n procesul sexual, prin asortarea
genomurilor din gameii masculi i femeli. Reproducerea sexuat asigur nu numai
continuitatea, ci i pstrarea genelor i caracterelor de la prini la copii, ct i
creterea variabilitii urmailor. Prin fecundarea a doi gamei provenii de la indivizi
diferii genetic, descendenii vor prezenta o vitalitate sporit, caliti noi, fertilitate
crescut. Aceast vigoare hibrid sau heterozis, la hibrizii rezultai prin ncruciarea
unor organisme nenrudite i diferite ca structur genetic, este consecina
heterogenitii genetice a descendenilor (fig. 14).

48

A B C

A B C
a

Gametogenez

A a AA
B B bB
CCC c

Aa
Bb
Cc

a A a a
b b B b
c c c C

Fig. 14: Variabilitatea genotipic produs prin asortarea independent a cromozomilor

amologi, n metafaza i anafaza meiozei I, la un organism ipotetic cu trei perechi de
cromozomi 2n = 6 (dup Covic, 2004)
n cazul ncrucirii unor indivizi apropiai sau nrudii (consangvinitate),
gradul de heterogenitate se reduce i sporete fenomenul de omogenitate genetic
(homozigoie). Deci, recombinarea genomic este o surs de variabilitate, cu condiia
ca genomurile ce se combin s fie ct mai diferite.
Recombinarea cromozomial se produce n cursul gametogenezei (n
meioza I) ntre cromozomi omologi, putnd fi recombinare intercromozomial i
intracromozomial.
Recombinarea

intercromozomial

se

realizeaz

prin

disjuncia

cromozomilor n timpul diviziunii meiotice, asigurndu-se repartiia independent n

gamei, a cromozomilor omologi, de origine matern i patern. Disjuncia
cromozomilor dintr-o pereche este independent de separarea cromozomilor din alte
perechi (fig. 14). Ca urmare, n gamei se realizeaz combinaii aleatorii ale
cromozomilor, obinndu-se genotipuri distincte. Rata combinaiilor posibile n

49

gamei, prin disjuncia independent a cromozomilor omologi, depinde de numrul

perechilor cromozomiale. La om se formeaz 2 23 combinaii, deci peste 8 milioane de
gamei diferii (cifra valabil pentru situaia n care cromozomii se deosebesc printr-o
singur gen). Dup fecundare, vor rezulta 2 46 combinaii, valoare ce depete de 8
mii de ori populaia globului. De aceea, se poate afirma c fiecare persoan are o
structur genetic unic i nerepetabil.
Ca urmare a producerii recombinrii intercromozomiale (n metafaza i
anafaza meiozei I), la indivizii heterozigoi se formeaz i gamei recombinai, pe
lng gameii normali.
De exemplu, un individ dublu heterozigot pentru 2 gene plasate pe 2 perechi
de cromozomi A/a B/b (provenit din prini A/A B/B i a/a b/b) va produce dou
tipuri de gamei nerecombinai A B i a b, dar i dou tipuri de gamei recombinai A
b i a B.
n cazul n care individul dublu heterozigot este genotipic A b i a B
(provenind din prini A/A b/b i a/a B/B) acesta va putea conduce dou tipuri de
gamei nerecombinai A b i a B i dou tipuri de gamei recombinai A B i a b.
Deci, clasificarea tipurilor de gamei produi n gamei nerecombinai i
recombinai depinde de combaterea genelor nealele la indivizii parentali. procentul
gameilor nerecombinai i al celor recombinai este variabil i n funcie de cele 2
gene implicate.
Un exemplu este cazul transmiterii caracterelor n ncruciare dihibrid de
motenire a dou caractere: nanismul hipofizar i sistemul ABO.
Nanismul hipofizar (piticismul) este determinat de o gen recesiv
autosomal d. Astfel, indivizii dd sunt afectai, iar cei cu genotipul DD sau Dd
prezint nlime normal.
Sistemul ABO de determinism sanguin implic alele multiple (polialelie):
LA, LB i L0.
De exemplu, un brbat dublu heterozigot DdL ALB (nlime normal i grup
sanguin AB) va produce patru tipuri de gamei: DL A, dLB, DLB, dLA. Conform legii a
II-a mendeliene, fiecare pereche de alele segreg independent de alte perechi de alele.
Astfel, jumtate din gamei vor fi purttori ai genei D, iar jumtate vor prezenta gena
d, iar pentru perechea de alele LALB, tot jumtate din gamei vor prezenta gena LA i
jumtate gena LB (tabel. 5).

50

Tabel. 5 Schema legii II-a mendeliene

Alele pentru nanism

Alele pentru sistemul ABO

Gamei

1/2 D

1/2 LA

1/4 DLA

1/2 LB

1/4 DLB

1/2 LA

1/4 dLA

1/2 LB

1/4 dLB

1/2 d

Deci 50% din gamei sunt recombinai i 50% nerecombinai.

Din cstoria unui brbat DdLALB (ce va produce patru tipuri de
spermatozoizi) cu o femeie Ddll (ce va produce 2 tipuri de ovule tabel...) copiii
posibili ai acestui cuplu vor preazenta combinaiile genotipice redate n tabelul 6,
segregarea fenotipic fiind 3/8 indivizi normali, cu grupa A; 3/8 indivizi normali, cu
grupa B; 1/8 pitici, cu grupa A i 1/8 pitici, cu grupa B.
Tabel. 6 Tipurile de gamei produse de o femeie Ddll
Alele pentru nanism
1/2 D
1/2 d

Alele pentru sistemul ABO

100%
100%

Gamei
1/2 Dl
1/2 dl

Tabel. 7 Combinaiile genotipice posibile la generaia F1

Gamei
1/4 DLA
1/4 DLB
1/4 dLA
1/4 dLB

1/2 Dl
DDL l (1/8 normali, cu grupa A)
DDLBl (1/8 normali, cu grupa B)
dDLAl (1/8 normali, cu grupa A)
DdLBl (1/8 normali, cu grupa B)
A

1/2 dl
DdL l (1/8 normali, cu grupa A)
DdLBl (1/8 normali, cu grupa B)
ddLAl (1/8 normali, cu grupa A)
ddLBl (1/8 normali, cu grupa B)
A

Genele ce determin nanismul hipofizar i cele implicate n sistemul ABO

sangvin sunt plasate pe perechi diferite de cromozomi. Gena ce induce nanismul
hipofizar este plasat pe cromozomul 17, la mijlocul braului lung, iar genele pentru
sistemul ABO sunt localizate pe cromozomul 9, spre captul braului lung (fig. 15).

51

17

Fig. 15: Reprezentarea schematic a genelor pentru nanismul hipofizar i

pentru sistemul ABO (dup Covic, 2004)
Recombinarea intracromozomial (crossing-over). Variaiile genotipice
individuale produse de recombinarea intercromozomial sunt amplificate prin
fenomenul de schimb reciproc de gene ntre cromozomii omologi sau recombinare
intracromozomial (crossing-over) (Tudose, 2000).
Crossing-over-ul este procesul prin care se realizeaz schimbul de material
genetic ntre cromozomi omologi, n timpul diviziunii meiotice (P I pachiten).
Fenomenul presupune ncruciarea cromozomilor omologi, ruperea cromatidelor la
nivelul chiasmelor, schimbul reciproc de fragmente ntre cromatide i reunirea
fragmentelor ntr-o configuraie genic nou. Prin crossing-over se formeaz
cromatide recombinate genetic. Crossing-over-ul poate fi:

egal cnd are loc schimbul reciproc de fragmente cromatidice egale

(caz general);

inegal cnd ntre segmentele cromatidice omooage nu exist

coresponden, ceea ce genereaz o recombinare nereciproc (unul
dintre cromozomi va avea o duplicaie, iar cellalt o deleie a
aceleiai gene) rezultnd gamei anormali1.

Crossing-overul inegal. n cazul n care nu se realizeaz sinapsarea precis

a regiunilor omoloage, se va produce un crossing-over inegal ntre poriunile
nealiniate realizndu-se o rearanjare a secvenelor de ADN, deci o modificare a
structurii polipeptidelor codificate de aceste secvene.
Un exemplu, l reprezint hemoglobina Lepore, ce conine catene 0 normale
asociate cu catene anormale; acestea ncep cu o secven de aminoacizi identic cu
catena i se continu cu o secven a catenei normale (fig. 16). Hibridul
(Lepore) rezult prin crossing-overul inegal.
1

52

co X

Fig. 16: Model de producere a Hb Lepore prin crossing-ever inegal (dup

Tudose, 2000)
Alt exemplu l constituie Hb Kenya, n care catena anormal rezult dintr-o
fuziune a unor pri din catenele i .
Crossing-over-ul inegal se poate realiza n zonele cu gene duplicate, cu
segmente nucleotidice similare, de exemplu genele pentru vederea colorat rou i
verde (gene localizate pe cromozomul X i Xq28). Pentru culoarea roie exist o gen
i 1 3 gene pentru culoarea verde. Nucleotidele acestor gene sunt omoloage n
proporie de 96%.
Crossing-over-ul inegal poate determina pierderea funciei unui tip de gene
hibride alterate.
Crossing-over-ul egal. Pentru demonstrarea crossing-over-ului egal se aleg
dou perechi de gene legate de X: G-gena dominant pentru vederea normal,
colorat; g alela recesiv pentru absena vederii colorate pentru verde
(deuteroanopie) i gena H gena dominant pentru coagularea normal a sngelui; h
alela recesiv pentru hemofilia A.

53

De exemplu, dou femei sntoase, dublu heterozigote GgHh pot prezenta

genotipuri diferite ca faz: o femeie poate avea genele plasate n poziia cis (cele
dou alele recesive pe acelai cromozom omolog) sau trans (cele dou alele recesive
plasate opus pe cromozomi omologi), ca n fig. 17.

gG
H

g h
gamet
cis mascul

g H

X hpatern

gamet femel

X matern
G

g gh

g H

X patern
trans

G
H

G
h X matern
G

MEIOZ

Fig. 17: Reprezentarea schematic a poziiilor cis i trans ale alelelor legate
de X: G i H, cu alelele corespunztoare (Tudose, 2000)

g cis
h va forma 2 tipuri de gamei:
g gh
H i GH (gamei
Femeia48.5
cu %
genotipul
48.5 %
gamei
nerecombinai, parentali) i 2 tipuri de gamei: gH i Gh (gamei recombinai, ca
nerecombinai
urmare a unui crossing-over ntre genele g i h). Gameii recombinai se obin cu o
97 %
97 %
frecven sczut (1,5% pentru fiecare, deci 3 % n total), n comparaie
cu gameii
G
48.5 %
48.5 %
G i 97 % n total).
parentali (48,5 % pentru fiecare
h
H

1.5 %

g H

gamei
recombinai
3%

1.5 %

G
h

g h

1.5 %

3%

G
H

1.5 %

Fig. 18: Reprezentarea schematic a tipurilor

54 i procentelor de gamei recombinai i
nerecombinai, produi de indivizi cu 2 gene X nlnuite n poziia cis i trans

Femeia cu genotipul trans va forma aceleai patru tipuri de gamei, cu

deosebirea c gameii recombinai (parentali) sunt gH i Gh (n procent total de 3 %)
(fig. 18).
Din totalul tipurilor de gamei formai de un organism, procentele cuprinse
ntre 0 % (linkage complet) i 50 % (segregarea independent a perechilor de
cromozomi) gameii recombinai se datoreaz formrii chiasmelor ntre cromozomii
omologi. Fiecare chiasm reprezint locul unde cromatidele nesurori se rup i apoi se

55

unesc n manier criss-cross (n form de X). Acest schimb reciproc de segmente ntre
cromatidele nesurori este crossing-over-ul, iar cromatidele rezultate sunt cromatide
cross-over (recombinate) (fig. 19).
Chiasmele au fost observate la microscopul optic, n celulele meiotice
colorate (prin diverse metode de colorare nuclear), la diferite organisme. S-a
constatat c se pot forma numeroase chiasme pentru o pereche de cromozomi
omologi (tetrad), ns sunt dificil de evideniat (n principal datorit dimensiunilor
mici ale cromozomilor). Studiul celulelor meiotice umane a demonstrat existena, n
general, a 1-4 chiasme (uneori 5 sau 6) la tetradele autosomale la brbat (media fiind
de dou chiasme per pereche de cromozomi omologi). Se pare c perechea de
cromozomi XY nu formeaz chiasme. Referitor la numrul chiasmelor meiotice la
femei, sunt foarte puine informaii2.
Crossing-over-ul se produce n profaza meiozei I, n pachiten, naintea
g
h
condensrii cromozomilor n maniera n care devin vizibili la microscopul optic.
cromatide
1
suroriPentru2exemplul din figura de mai sus, n celulele meiotice ale unei femei
g
h
dublu heterozigote pentru genele ce determin daltonismul i hemofilia, se poate
G
H
produce
crossing-over
ntre
cromatidele
surori
2
i
3
(ca
n
figur)
sau 1 3, 1 4 i 2
cromatide
surori
3 acelai rezultat (n realitate toate cele patru cromatide se ating
4, obinndu-se
4
G
H
tridimensional). Ca urmare a crossing-over-ului, viitorul ovul va conine la nivelul
cromozomului X asociaii parentale de gene gh i gGH sau asociaii
recombinate gH i
h
1
Gh. Alegerea cromozomului
(din cei 4 cromozomi) ce va fi inclus n ovulul funcional
2
esteRupturi
aleatorie;
corpii polari.
n ceilali trei cromozomi vor sfri n g
h
cromatide
G la un genotip
H
Atunci cnd crossing-over-ul se produce
homozigot (gghh;
nesurori
GGHH; ggHH sau
3 GGhh) nu are loc recombinarea, gameii formai fiind doar de tip
4
G
H
parental.

1
2
Criss-cross

3
4

Gamei
2

g
H

G
h

g
G

h
H

H
G
H

56
Fig. 19: Schema unui crossing-over simplu ntre 2 gene X
nlnuite (G i H, respectiv alelele g i h)

n cazul genelor adiacente nu se produce crossing-over deoarece, practic nu

exist distan ntre gene, astfel nct procentul de recombinare prin crossing-over
este zero (genele fiind absolut nlnuite cazul IV din tabelul. 8).
Atunci cnd genele sunt foarte departe (spre capetele cromozomilor) se va
produce crossing-over. Deoarece din cele patru cromatide ale unei tetrade din profaza
meiozei I doar 2 vor fi implicate n crossing-over, celelalte 2 rmnnd parentale,
procentul maxim de gamei recombinai ce se poate forma este de 50 % (din procentul
de 100 % gamei), 50 % fiind gamei parentali (cazul II din tabel).
Genele plasate la o distan ce permite realizarea crossing-over-ului (nici
prea aproape, nici la capete) conduc la frecvene ntre 0-50 % crossing-over
(frecvena crossing-over-ului crete cu creterea distanei ntre gene) (Tudose, 2000).
innd cont de faptul c procentele de recombinare sunt egale cu unitile de
hart genetic, la exemplul descris anterior, la procentul de 3 % crossing-over sunt 3
uniti de hart genetic.
Atunci cnd genele sunt plasate pe cromozomi diferii va avea loc
recombinarea intercromozomial, segregarea fiind conform legii II-a mendeliene:
57

50% gamei recombinai i 50 % gamei parentali, rezultnd n final patru tipuri de

gamei, n procent de 25 % fiecare (cazul I din tabel).
Tabel. 8 Tipurile de gamei formai de o persoan rezultat din unirea gameilor:
AB i ab
Localizarea

Gametul AB

Gametul ab

Gametul Ab

Gametul aB

Procentul de

genelor A i B

% (parental)

% (parental)

% (parental)

% (parental)

recombinare

25

25

25

25

50

25

25

25

25

50

cromozom, nici

100-x

100-x

x = 0-50 %

prea aproape,

50

50

I Pe cromozomi
diferii
(neomologi)
II Pe acelai
cromozom, ns
foarte departe
III Pe acelai

nici prea departe

IV Pe acelai
cromozom,

foarte aproape

Crossing-over-ul somatic (sister chromatid exchange). Fenomenul de

crossing-over se poate produce i n mitoz (crossing-over somatic), ntre cromatidele
surori ale unui cromozom, explicnd fenomenul de mozaicism. Acesta a fost
evideniat prin autoradiografie (cu T cu 3H) de Taylor, n 1957 (cf. Mange & Mange,
1990), iar mai recent, prin ncorporarea de BdU (bromdeoxiuridin) i coloraie cu
acridin orange, sub form de schimburi ntre cromatidele surori. Numrul de
schimburi ntr-o metafaz (la aceeai doz de BdU) este relativ constant, putnd ns
crete semnificativ, sub aciunea agenilor mutageni (Covic, 2004).
Crossing-over-ul somatic este un test citogenetic (efectuat n metafaza
mitotic), cu sensibilitate mare la concentraii sczute de mutageni chimici. Deoarece
cromatidele surori sunt copii exacte (cea de-a doua cromatid se formeaz n faza S a
ciclului celular mitotic, prin duplicarea cu precizie a unei cromatide), schimbul
reciproc de segmente cromatidice ntre cromatidele surori nu prezint consecine
genetice, fiind imposibil de determinat. Crossing-over-ul somatic poate fi evideniat
la microscopul optic prin marcarea chimic a cromatidelor, celulele fiind supuse la
dou replicri, n mediu de 5-bromouracil (5-BU), ca n figurile ce urmeaz.

58

Prima
replicare a
ADN

tt

Mitoz

A doua
replicare a
ADN

tb tb

tb

tb bb

Fig. 20: Schema replicrii ADN, n mediu de 5-BU, fr crossing-over mitotic (tt =
ADN dublu catenar, cu timin; tb = ADN cu timin i ADN cu 5-BU; bb = ADN cu 5BU) (Tudose, 2000)

Prima
replicare a
ADN

tt

Mitoz
A doua
replicare a
ADN
tb tb
bb

59

tb

tb

bb

bb

tb

tb
Fig. 21: Schema replicrii ADN, n mediu de 5-BU, cu dou crossing-overe
mitotice (tt = ADN dublu catenar, cu timin; tb = ADN cu timin i ADN cu 5-BU; bb
= ADN cu 5-BU) (Tudose, 2000)
n cultura de celule, n scopul testrii producerii crossing-over-ului somatic,
se pot utiliza leucocitele unei persoane expuse la diferii mutageni. Testarea se
realizeaz n medii cu 5-BU, un analog al timinei; pentru testarea in vivo se injecteaz
5 BdU (5-bromdeoxiuridin).
Prin tehnica in vitro, s-a constatat c, fumtorii prezint o frecven mai
mare a crossing-over-ului somatic, n celulele albe sanguine.
Pentru evidenierea crossing-over-ului se poate folosi un colorant (de
exemplu Giemsa sau un colorant fluorescent) ce va colora mai intens cromatidele cu
mai mult timin. Astfel, cromatida tb se va colora mai intens fa de cromatida bb.
Atunci se produc crossing-overe somatice, n cromozomii metafazici vor aprea
segmente cromatice alternante, nchise i deschise la culoare (fig. 22). Astfel de
cromozomi au fost denumii cromozomi arlechin.

60

Fig. 22: Cromozomi metafazici: A) normali cu cromatidele marcate (negru =

cromatid cu timin; gri = cromatid cu 5-BU); B( cu schimburi de segmente
cromatidice ntre cromatidele surori (cromozomi arlechin) (Covic, 2004)

Gene umane au fost transferate n celule de drojdii; acestea, dup

integrarea lor a genelor umane, au putut sintetiza produse metabolice umane. n
prezent drojdiile se folosesc n acest scop pe scar larg n industria farmaceutic.
Gene umane au fost inoculate i n culturi de celule de mamifere. De
exemplu, gena uman ( de pe cromozomul 10) responsabil de sinteza factorului VIII
al coagulrii a fost clonat i transferat n celule renale de hamster, celula de hamster
ncepnd s sintetizeze produsul acestei gene, adic factorul VIII de coagulare,
necesar n tratamentul hemofilicilor; preul acestui produs s-a dovedit a fi mult mai
ieftin dect al factorului VIII extras din plasma de la om sntos (Tudose, 2000).
Datorit cercetrilor n tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate
metode de transfer de gene n celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine
utile. Astfel, a devenit posibil producerea i chiar comercializarea pe scar larg a
unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor
de diagnosticare etc.
IV.2. Obinerea insulinei umane i a altor hormoni prin inginerie genetic
Din 60 de milioane de diabetici, cca. 4 milioane necesit un tratament cu
insulina. n 1916, E. Sharpy-Schafer a descoperit c insulina este secretat de celule
care alctuiesc insulele Langherhans din pancreas, ceea ce l-a determinat s numeasc
hormonul insulina. n 1921, F. Bauting i H. Best, la Toronto, au izolat din pancreasul
de cine hormonul insulin, demonstrnd aciunea lui antidiabetic. n 1923, firma
farmaceutic american Eli Lilly pune deja n vnzare prima insulin animal (n
prezent, pentru a obine cca. 100 g de insulin este nevoie de 800 kg de pancreas de
bou, pe cnd greutatea normal a acestuia este de 200- 250 g).

61

Insulina uman este alctuit din dou catene polipeptidice A i B, compuse

respectiv din 21i 30 de aminoacizi, a cror secven a fost stabilit n 1955 de F.
Sanger.
n perioada 1963-1965, trei grupe de cercettori au reuit sinteza artificial a
insulinei prin intermediul a 170 de reacii chimice, lucru ce fcea imposibil
producerea insulinei pe cale industrial.
Noile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost posibile
odat cu extragerea genei insulinei (W. Gilbert i colaboratorii si, 1980) i crearea
moleculelor recombinate de ADN n baza plasmidelor.
Moleculele recombinate de ADN sunt transferate n colibacili (E. coli) unde
are loc realizarea informaiei genetice codificat n molecula de ADN. Paralel cu
proteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i insulina. Pentru a proteja insulina
uman (ea nu este proprie colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), n
molecula recombinat de ADN se ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o gen
reglatoare care codific o protein specific colibacililor (de exemplu, galactozidaza).
Ca rezultat al manifestrii informaiei genetice a moleculei recombinate de ADN , se
obine o caten polipeptidic hibrid, din care mai apoi se sintetizeaz insulina.
Datorit utilizrii tehnologiei ADN- ului recombinant, se obin aproximativ
200 g de insulin de pe un metru cub de cultur, adic tot atta ct se poate extrage
din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc.

Plasmid

gena insulinei (sintetizat artificial)

62

inserare n E.coli

cultivare industrial

(E.coli produce insulin prin translaie)

purificarea insulinei umane (Humulin )

Fig. 23: Schema obinerii insulinei umane

63

Probele clinice efectuate cu insulin uman, produs prin tehnici de

inginerie genic, au demonstrat c ea nu are efecte secundare i c poate fi
comercializat, adic folosit la tratarea bolnavilor de diabet (din 1982 n S.U.A, din
1983 n Marea Britanie).
Un hormon de mare importan biologic este hormonul de cretere sau
somatotropina (HGH-Human Growth Hormone), secretat de lobul anterior al
hipofizei. Molecula hormonului cuprinde 191 aminoacizi. Absena lui provoac
nanismul hipofizar, care o frecventeaz de 7-100 per milion de persoane.

Tratamentul cu acest hormon se realizeaz ncepnd cu vrsta de 4-5 ani pn

la pubertate, n doze de minimum 6 mg pe sptmn per persoan.
Somatotropina este un hormon cu o specificaie nalt i nu poate fi utilizat de la
animale. Din hipofiza unui cadavru se extrag doar 4-6 mg de hormon, heterogen i
impurificat. Iat de ce producerea acestui hormon prin tehnici de inginerie genic
prezintun interes deosebit.
Sinteza acestui hormon pa cale artificial s-a nceput cu producerea de
ADNc (ADN copie) cu ajutorul revers-transcriptazei, avnd ca matrice ARNm din
hipofize (transcripie invers). Acesta a fost clonat, apoi tiat cu enzime de restricie
pentru obinerea secvenei nucleotidice corespunztoare somatotropinei, cu excepia
fragmentului ce determin primii 23 de aminoacizi. Fragmentul n cauz era clonat
separat, ca rezultat a unei sinteze chimice, apoi cele dou segmente unite, la ele se
adaug segmente reglatoare i pe baza plasmidelor se obine plasmidul recombinat cu
gena HGH (a somatotropinei). Colibacilii, primind acest plasmid recombinat,
sintetizau somatotropina (la un litru de mediu de cultur se obine 2.0-2.5 mg
somatotropin) (Coprean, 1999).
n prezent, cu ajutorul bacteriilor recombinate sunt obinui i ali hormoni,
de exemplu, thimopoetina ce conine 49 de aminoacizi i este secretat de timus.
n ce privete hormonii cu molecule mai mici (sub 20 aminoacizi), este
preferat sinteza lor pe cale chimic.
Obinerea interferonilor
Interferonii sunt produi de celule specializate pentru lupta mpotriva
efectelor virale. Ei au fost descoperii n 1957 de F. Isaacs i I Lindenmann la
Institutul Naional de Cercetri Medicale de lng Londra. Interferonii reprezint

64

nite substane proteice (din 146-166 de aminoacizi) i sunt produi n cantiti intime
de celul animal sau uman, cnd un virus ptrunde n organism.
Exist mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (),
interferonul fibroblastelor () i interferonul limfocitelor T sau interferonul imun ().
Ei pot fi obinui prin tehnici clasice (din celulele sanguine i din
fibroblaste) i prin tehnici de recombinare genetic.
Pentru a obine interferon din celulele sanguine sau din fibroblaste cultivate,
acestea sunt infectate cu virus, iar dup 24 ore prin centrifugare i purificare se
izoleaz din mediul de cultur. Dintr-un litru de snge se poate extrage pn la 1 mg
de interferon.
n 1980, savanii americani W. Gilbert i C. Weissmann i japonezul
T.Taniguki au produs interferonul uman cu ajutorul unor colibacili cu genomul
codificat.
Celulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului n
interferon activ, de aceea, iniial, complexul de ADN, format dintr-o regiune
nucleotidic reglatoare i o regiune ce determin structura interferonului, este supus
aciunii enzimelor de restricie, care taie molecula de ADN aproximativ la frontiera
celor dou catene (genei interferonului nu-i ajunge un triplet ATG). Codonul omis
(ATG) este anexat prin sintez chimic (Bra i Cmpeanu, 1999).
Gena interferonului se ncadreaz n continuare ntr-un plasmid, care se
transfer n E. coli. Astfel colibacilii sintetizeaz interferonul uman. Dintr-un litru de
suspensie de E. coli (cca 1011 celule) se pot extrage pn la 5 mg de interferon (adic
de 5000 de ori mai mult dect un litru de snge).
Tehnicile de inginerie genetic permit obinerea preparatelor hibride de
interferon cu un spectru larg de aciune.

65

Capitolul V

Cercetrile de inginerie genetic i umanitatea

Studiile de inginerie genetic ce vizeaz crearea unor genotipuri noi i

transferul unor gene naturale sau sintetizate artificial pot prezenta i un pericol
potenial care poate afecta societatea uman. astfel, nc n 1971 geneticianul A. M.
Lewis de la National Institute of Health (Bethesda, S.U.A.), a creat un hibrid artificial
ntre un adenovirus, care provoac un fel de grip i virusul SV40 de la maimue, care
determin apariia unor tumori maligne. Pericolul unei epidemii de cancer l-a fcut pe
cercettorul respectiv s renune la experienele respective. n anul 1972, geneticianul
P. Berg, de la Universitatea Berklez din California, a renunat voluntar la efectuarea
unor experiene periculoase de inginerie genetic, care constau n transferul unor gene
de la virusul oncogen SV40 de la maimue la un bacteriofag care apoi urma s
infecteze bacteria Eschericha coli, care triete n tubul digestiv i n cavitile nazale
umane. Dac aceasta experien ar fi reuit, exist pericolul rspndirii pe scar larg
a unor gene implicate n apariia tumorilor maligne. Doi ani mai trziu, n anul 1974,
Academia Naional de tiine a S.U.A., a cerut geneticianului P. Berg, bine cunoscut
pentru cercetrile sale de inginerie genetic, s studieze problema pericolului eventual
al unor cercetri de inginerie genetic.
Comitetul condus de P. Berg a realizat un raport n care nu numai c se
analizau consecinele eventuale ale unor cercetri de inginerie genetic, dar s-a
propus instituirea unui embargou asupra anumitor experiene. Este vorba de
cercetrile de inginerie genetic de tipul 1 care aveau ca obiectiv realizarea unor
organisme capabile s produc diverse toxine sau rezisten la antibiotice necunoscute
nc n natur. de asemenea s-a hotrt suspendarea i a cercetrilor de tipul 2, care-i
propuneau s transfere genele unor virusuri tumorale sau ale unor virusuri animale, la
bacterii. Aceasta, deoarece cu ajutorul bacteriilor astfel de gene pot fi diseminate uor
n cadrul populaiei umane s pot determina o mrire a incidenei cancerului sau a
altor maladii (Maximilian i Ioan, 1986).

66

Plecnd de la constatarea c manipularea artificial a genelor poate da

natere unor organisme noi, cu noi proprieti infecioase, i cu efecte ecologice
imprevizibile, n ultima vreme s-au instituit unele msuri pe plan naional i
internaional pentru controlul unor astfel de experiene.
n unele cazuri, cercettorii apreciind pericolul unor studii de inginerie
genetic au renunat voluntar la experiene. Astfel, n anul 1975, geneticianul H.
Chakrabarty din laboratoarele de la Schenectady ale societii General Electric
(S.U.A.) a transferat la bacteria Escherichia coli genele care intervin n sinteza
celulazei, enzim care determin hidroliza celulozei. Scopul acestor cercetri era
transformarea deeurilor domestice din marile orae n gaze, ce pot fi utilizate drept
combustibil. Ulterior, el ns a ncetat experienele, deoarece bacteria respectiv
eliberat n natur, ar fi putut ataca fibrele vegetale din tractul digestiv uman, fibre
care favorizeaz motilitatea gastric. Mai mult, celuloza din materialul vegetal ar fi
fost transformat n gaz, cu consecine grave.
n alte cazuri, s-au elaborat msuri oficiale pentru a mpiedica efectuarea
unor studii de inginerie genetic, care ar putea afecta specia uman sau ecosistemele
de pe Terra. Astfel, n anul 1975, a fost convocat o Conferin internaional la
Asilomar n California, la care au participat 86 de geneticieni americani i 53 de
geneticieni din alte 16 ri, precum i diferii juriti i ali specialiti n probleme de
etic social. Printre altele s-a recomandat specialitilor s ia msuri n vederea
evitrii experienelor periculoase de inginerie genetic, pentru controlul rspndirii
unor plasmide recombinate utilizate pe larg n astfel de experiene, pentru protecia
omenirii mpotriva unor riscuri privind rspndirea unor gene i a unor organisme noi
create n laborator, care ar putea afecta specia uman (Hartl et al, 1988).
Numai n Statele Unite, peste 100 de laboratoare efectueaz n prezent
cercetri de inginerie genetic. inndu-se seama de ritmul extrem de rapid al
cercetrilor i descoperirilor din acest domeniu, Departamentul Comerului a luat
recent msura de a simplifica i scurta procedura dobndirii unor brevete de invenii,
de la 18 luni numai la 6 luni. De asemenea, guvernul S.U.A. se pare c intenioneaz
s adopte o lege privind manipularea genelor, prin care s aib posibilitatea s
controleze cercetrile de inginerie genetic, att n laboratoarele de stat ct i n cele
particulare, n scopul evitrii unor experiene periculoase pentru societate.
n S.U.A., National Institute of Health a elaborat n urma conferinei de la
La Jolla (California) msuri speciale pentru laboratoarele care fac cercetri de
67

inginerie genetic. astfel, n laboratoarele de tip P4, n care se efectueaz cercetri

extrem de periculoase, de pild cele cu virusul Marburg, virusurile ce provoac
frigurile Losa sau febra hemoragic Zaire, sunt necesare msuri excepionale. aceste
virusuri determina o mortalitate de aproape 100%. Ca urmare, pentru efectuarea unor
astfel de cercetri sunt necesare cldiri speciale cu filtru i cu o presiune mai sczut
dect cea a mediului ambiant, precum i un personal de nalt calificare i extrem de
bine instruit. n statele Unite exist numai 4-5 laboratoare de acest tip.
n laboratorul de tip P3 exist riscuri ipotetice, fapt pentru care sunt necesare
construcii speciale, pori duble, aer cu presiune sczut, msuri speciale de
decontaminare etc.
Laboratorul de tip P2 poate efectua cercetri cu bacterii patogene cum sunt
Salmonella typhosa, Cholera vibro i Clostridium botulinum, cu ADN recombinat,
dar nu s-a dovedit a mri patogenitatea bacteriilor respective.
Laboratoarele de tip P1 sunt cele n care se lucreaz cu ADN recombinat i
prin care se realizeaz transferul de gene la bacterii. Nu sunt necesare, n acest caz,
cldiri speciale, ci numai anumite msuri de securitate a materialului biologic i de
decontaminare a laboratoarelor (Covic et al, 2004).
n Frana s-au elaborat, de asemenea, anumite msuri de securitate pentru
experienele de inginerie genetic, iar n anul 1976 un grup de 300 geneticieni i ali
oameni de tiin au difuzat un apel n care i exprimau nelinitea privind
posibilitatea folosirii cercetrilor de inginerie genetic n scopuri destructive.
Adoptarea unor msuri hotrte este necesitat i de ncercrile unor cercuri
iresponsabile de a folosi metodele ingineriei genetice pentru crearea unor organisme
care ar putea fi utilizate n cadrul aa-numitului rzboi genetic. Evident c sinteza
artificial a unor supervirusuri necunoscute n natur, a unor bacterii rezistente la
antibiotice sau a unor microorganisme cancerigene ar constitui o arm teribil care ar
putea afecta grav ntreaga omenire. Rzboiul genetic poate fi mai periculos pentru
specia uman dect rzboiul termonuclear. Credem ns c nelepciunea uman va
determina ca cercetrile de inginerie genetic s mearg n continuare pe fgaul care
duce la rezolvarea unor probleme majore ale societii umane.

68

CONCLUZII

1. Tot mai multe voci autorizate consider c secolul XXI va fi secolul

biotehnologiei, care este una dintre cele mai noi tiine, dei bazele ei au fost puse
nc din antichitate.
2. Ingineria genetic i, mai ales ramura sa, tehnologia ADN-recombinant sunt
cele mai dinamice domenii ale biotehnologiei actuale. Ca urmare a cercetrilor i
descoperirilor actuale (de biologie molecular, genomic, proteomic) aceste tendine
vor fi accelerate n urmtorii ani.
3. Termenul ADN-recombinant se refer la combinaii noi de ADN, obinute
ntre anumite secvene de ADN uman (sau de la alte organisme) i molecule de ADN
bacterian (sau de la alte specii), capabile s se replice indefinit, formnd clone
moleculare sau s exprime ntr-o celul gazd informaia genetic pe care o conin.
3. Pe ct de controversat, pe att de incitant, acest domeniu presupune o solid
pregtire teoretic i practic n domeniul geneticii, biochimiei i biologiei
moleculare, iar scopul urmrit este acela de a revoluiona n primul rnd medicina,
agronomia, zootehnia, industria alimentar i farmaceutic.
4.Noii produi vor fi proteinele recombinate, ns cu noi funcii, performane
i activiti; ele pot fi chiar combinaii inedite, inexistente n natur.
5. Dei au trecut numai 20 de ani de la introducerea noilor tehnologii ADNrecombinant, aceste descoperiri, recompensate cu numeroase premii Nobel, au
generat consecine majore n toate domeniile de activitate, deschiznd era biologiei
moleculare.

69

BIBLIOGRAFIE
1.

Badea E., Raicu P., 1999 - Culturi de celule i biotehnologiile moderne, Ed.
Humanitas, Bucureti.

2.

Bra I.I., 1997- Vademecum de genetic, Editura Corson, Iai

3.

Bra I.I. Cmpeanu M, 1999 - Genetica, Editura Corson, Iai.

4.

Bra I.I., Ghiorghi A., 2000 Dicionar de genetic, Editura Corson, Iai.

5.

Butnaru G., Nicolae I., Tma E., 1999 - Genetica molecular, Ed. Mirton, Timioara.

6.

Cmpeanu M., Cmpeanu C.S., Bra I.I., 2000 ADN recombinant, Editura Corson,
Iai.

7.

Coprean Dana, 1999 - Genetica medical, Editura Risoprint, Cluj-Napoca.

8.

Covic M., tefnescu D., Sandovici I, 2004 - Genetic medical, Editura Polirom,
Iai.

9.

Dinu V., Truia E.,1998 - Biochimie medical (mic tratat), Editura medical,
Bucureti.

10.

DUBININ, N. P., 1985 - Genetica, Editura tiina, Chiinu.

11.

Gheorghi N., Iacubovici A, 1996 - Biochimie medical. Biochimie descriptiv, Vol

I, Ed. Univ. de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa, Iai.

12.

Hartl D.L., Freifelder D:, Snyder L.A., 1988 - Basic genetics, Jones and Bartlett
Publishing, Boston.

13.

Israil A.M.,2000 - Biologie molecular, Prezent i perspective, Editura Humanitas,

Bucureti.

14.

Mange A: P:, Mange E. J., 1990 - Genetics: Human aspects, Sinauer Associates, Inc.
Publishers, Sunderland, Massachusetts.

15.

Maximilian C., Ioan D. M., 1986 Genetica Medical, Ed Med., Bucureti.

16.

Miller SA, Dykes DD, Polesky H,1988 - A simple salting out procedure for extracting
DNA from human nucleated cells. Nucl Acids Res;16:1215.

17.

Mixich F., Cruce M. , 1997- Principii experimentale n Biologia Celular, Editura

Sitech, Craiova.

18.

Old JM, Varawella NY, Weatherall DJ , 1990- Rapid detection and prenatal diagnosis of

70

-thalassemia: studies in Indian and Cypriot populations in the UK. Lancet; 2:834.

19.

Raicu V., 2002 Genetic general i uman, Ed. Humanitas, Bucureti.

20.

Rogoz I., Perciuleac L.,2002 - Genetica uman, Ed. Cartdidact, Chiinu.

21.

Simon Z., Schneider F. , 1998 - Aspecte actuale de biologie i fiziologie molecular,

Editura Viaa medical romneasc, Bucureti.

22.

Stine G.J., 1989 - The new human genetics, Wm. C. Brown Publishers, Dubuque,
Iowa.

23.

Strachan T., Read A., 1996 - Human molecular genetics. Bios Scientific Bublishers
Oxford.

24.

Tudose C., Maniu M., Maniu C. L., 2000 - Genetic uman, Editura Corson, Iai.

25.

Tudose Cr., Mihaela Tudose, Marilena Maniu, Silvica Pdureanu, Monica Dragomir,
Clin Lucian Maniu, 2002 Echipamente utilizate pentru detecia mutaiilor
monogenice umane pe baza reaciei de amplificare enzimatic a ADN-ului (PCR),
Droguri, biomateriale i tehnici n medicina stomatologic. Supliment al Revistei de
Medicin Stomatologic, 1:299-304.

26.

Tudose I. Gh., 1993 - Genetica, vol. II, Ed. Univ. "Al.I.Cuza" Iai.

71