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LAB. N3: DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA POR

SU CONTENIDO BACTERIAL
1. OBJETIVO(s)
a) GENERAL:
i)

Determinar la cantidad de colonias de bacterias de una muestra de agua,

utilizando como medio de cultivo agar nutritivo fundido estril.

b) ESPECFICOS:
i)

Determinar la cantidad de colonias de bacterias obtenidas de las muestras

de: bao FIA, estanque de Arquitectura y lavadero del comedor del Teatro.
Para cada muestra se analizar tres (03) cantidades distintas:
(1) Muestra de agua de 1ml
(2) Muestra de agua (diluida en agua de disolucin estril) de 0.1 ml (10 1
ml)
(3) Muestra de agua (diluida en agua de disolucin estril) de 0.01 ml(10 2
ml)

ii) Calcular las Unidades Formadoras de colonia por mililitro (UFC/1ml) de

cada muestra.

2. FUNDAMENTO TERICO
2.1.

CALIDAD DEL AGUA

Es un factor que incide directamente en la salud de los ecosistemas y el
bienestar humano: de ella depende la biodiversidad, la calidad de los
alimentos, las actividades econmicas, etc. Por tanto, la calidad del
agua es tambin un factor influyente en la determinacin de la pobreza
o riqueza de un pas.
Se refiere a las caractersticas qumicas, fsicas, biolgicas y
radiolgicas del agua. Es una medida de la condicin del agua en
relacin con los requisitos de una o ms especies biticas o a cualquier
necesidad humana o propsito. Se utiliza con mayor frecuencia por
referencia a un conjunto de normas contra los cuales puede evaluarse
el cumplimiento. Los estndares ms comunes utilizados para evaluar la
calidad del agua se relacionan con la salud de los ecosistemas,
seguridad de contacto humano y agua potable.

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2.2.

INDICADORES DE CONTAMINACIN DEL AGUA

2.2.1. Indicadores fsico-qumicos:

-Slidos totales (residuo de evaporacin): comprende la materia
(orgnica e inorgnica) disuelta, coloidal y en suspensin; el residuo
seco del agua potable debe ser igual o inferior a 1500 mg/litro.
-Color: el agua potable debe ser incolora; las aguas residuales
domsticas tienen un color entre gris y negro; las aguas residuales
industriales pueden tener colores muy variados.
-Olor: el agua potable debe ser inodora (la desinfeccin con derivados
del cloro confiere cierto olor caracterstico); las aguas residuales
domsticas tienen un olor desagradable; las aguas residuales
industriales pueden tener olores desagradables; el sabor del agua est
relacionado con su olor.
-Temperatura: influye en el desarrollo de la vida acutica, el oxgeno
disuelto y la velocidad de las reacciones qumicas y bioqumicas.
-Turbidez: depende de la cantidad de slidos en suspensin; es mayor
cuanto mayor es la contaminacin del agua.
-pH: mide la concentracin de hidrogeniones; pH del agua potable entre
6,5-8,5; un pH elevado (superior a 7) indica baja
-Conductividad: vara con la temperatura y depende de la
concentracin de sustancias disueltas; las sales minerales aumentan la
conductividad y la materia orgnica la disminuye; se mide en
microsiemens por cm (400 para el agua potable).

2.2.2. Indicadores de la contaminacin orgnica:

-Carbono orgnico total (COT): mide la cantidad de compuestos
orgnicos, naturales o sintticos; expresa en mg/litro la cantidad de
dixido de carbono producido en la combustin de una muestra a 950
C.
-Demanda bioqumica de oxgeno (DBO): mide la cantidad de materia
orgnica biodegradable; se determina midiendo la cantidad de oxgeno
consumido por los microorganismos cuando utilizan la materia orgnica
como fuente de energa para su metabolismo; los ensayos se realizan
durante 5 das a una temperatura constante de 20 C y el resultado se
expresa en mg/litro; la DBO del agua potable no debe exceder los 2
mg/litro; se trata de un mtodo biolgico cuyos resultados pueden
alterarse por la presencia de sustancias reductoras (sulfuros, sulfitos,
hierro ferroso, etc.) y de txicos para la flora microbiana.
-Demanda qumica de oxgeno (DQO): indica la cantidad de
contaminantes que pueden oxidarse mediante un oxidante qumico
(dicromato potsico, etc.); estos contaminantes pueden ser materia
orgnica e inorgnica; se expresa en mg de oxgeno por litro.
-Nitrgeno total (NT): mide el nitrgeno de los compuestos orgnicos
nitrogenados naturales (proteinas, pptidos, aminocidos) y sintticos

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(oxinas, hidracina, etc.) y el nitrgeno de nitratos y nitritos; se expresa

en mg/litro.
-Otros indicadores: nitrgeno amoniacal, nitratos y nitritos (en mg/litro.)

2.2.3. Indicadores microbiolgicos:

-Coliformes: bacterias aerbicas y anaerbicas facultativas gramnegativas, no esporuladas, con forma de bacilo, que fermentan la
lactosa formando cido y gas a las 48 h de ser cultivadas en caldo
lactosado a 35 C; en este grupo se encuentran bacterias no entricas y
entricas (principalmente Escherichia coli); los coliformes sirven como
indicadores de contaminacin fecal y del nivel de saneamiento de las
aguas (un agua potable tendr 0 para el 95% de las muestras
analizadas).
-Estreptococos fecales: conjunto de estreptococos que poseen el
antgeno D de Lancefield (Streptococcus faecalis, S. durans, S. bovis,
etc.) conocidos tambin como enterococos al formar parte de la flora
intestinal; son indicadores de la contaminacin fecal (0 por 100 en el
agua potable).
-Otras determinaciones: esporas de Clostridium sulfito-reductores,
presencia de Clostridium perfringens, bacterifagos fecales,
microorganismos patgenos (cuando se producen brotes de
enfermedades de transmisin hdrica); la presencia de bacterias del
gen. Leptospira (patgenas para el hombre y los animales) indica
contaminacin por deyecciones animales.

2.2.4. Otros indicadores:

-Elementos no deseables y/o txicos: Al, As, B, Cu, Fe, Mn, Ti, Zn, Sb,
Ag, Ba, Cr, Sn, F, Hg, Ni, Pb, Se, etc.
-Microcontaminantes orgnicos: hidrocarburos clorados, hidrocarburos
aromticos policclicos, aceites y grasas (pueden ser mayoritarios),
mercaptanos, pesticidas, detergentes, cianuros, fenoles, etc.

2.3.

PRINCIPALES CONTAMINANTES MICROBIOLGICOS

Las enfermedades infecciosas se transmiten principalmente a travs de

las excretas de seres humanos y animales, en particular de las heces. As si el
agua usada para beber y preparar los alimentos est contaminada, puede
producir enfermedades infecciosas. Al respecto la OMS, en sus guas para la
calidad de agua potable, seala que el riesgo ms comn y difundido que lleva
consigo el agua potable son las enfermedades infecciosas causadas por
bacterias, virus, protozoarios y helmintos.
(a) LAS BACTERIAS:
(i) SALMONELLA: gnero de bacterias que pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos,
anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no
desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi ni esporas. Son

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bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S).

Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no
lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo
fermentativo.
Se presenta en al agua cruda, pero solo ocasionalmente se le
haya en aguas tratadas, ya que la cloracin es altamente
efectiva para controlar esta bacteria.
Sntomas tpicos: Gastroenteritis aguda con diarrea, dolores
abdominales, fiebres, nuseas vmitos y dolor de cabeza.
(ii) SHIGELLA: es un gnero de bacterias con forma de bacilo Gram
negativas, inmviles, no formadoras de esporas e incapaces de
fermentar la lactosa, que pueden ocasionar diarrea en los seres
humanos. Tiene baja resistencia al cloro, por lo que la cloracin
acaba con el peligro de ser afectado por esta bacteria.
(iii) ESCHERICHIA COLI: Se trata de una enterobacteria que se
encuentra generalmente en los intestinos animales, y por ende
en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados,
dado que es un organismo ubicuo. Causa gastroenteritis en
seres humanos y animales. Diarreas, Nauseas y deshidratacin
(iv) VIBRIUM CHOLERAE: Es una bacteria Gram negativa con
forma de bastn (un bacilo) curvo que provoca el clera en
humanos.
(v) CAMPYLOBACTER: Las especies de este gnero son bacilos
gram negativo con forma de coma y mviles por la presencia de
uno o dos flagelos polares. Sntoma ms notorio es la diarrea.

(b) BACTERIAS COLIFORMES:

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de
especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas
en comn e importancia relevante como indicadores de
contaminacin del agua y los alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria
principal del grupo, la Escherichia coli, descubierta por el
bacterilogo alemn Theodor von Escherich en 1860. Von Escherich
la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", "intestino").
Con posterioridad, la microbiologa sistemtica nombrara el gnero
Escherichia en honor a su descubridor.
COMO INDICADORES:
Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de
contaminacin fecal en el control de calidad del agua destinada al
consumo humano en razn de que, en los medios acuticos, los
coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas
intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su
ausencia indica que el agua es bacteriolgicamente segura.
Asimismo, su nmero en el agua es directamente e inversamente
proporcional al grado de contaminacin fecal; mientras ms

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coliformes se aislan del agua, mayor es la gravedad de la descarga

de heces.
Caracteres bioqumicos: El grupo contempla a todas las bacterias
entricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades
bioqumicas:

ser aerobias o anaerobias facultativas;

ser bacilos Gram negativos;
no ser esporgenas;

El grupo de los coliformes incluye bacterias en forma de bacilo, gram

negativos, con las siguientes propiedades bioqumicas: oxidasa
negativo y capacidad de fermentar lactosa, con produccin de gas en 48
horas a una temperatura de 37 C.
El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros:

Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Citrobacter

1 Vibrio Cholerae
2 E. Coli

2.4. CONTEO
BACTERIANO

4 Shiguella

3 Salmonella

a. Conteo en placa PETRI: Mtodo ms usado para contar bacterias. Un caldo

de cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo
son distribuidas en la caja de Petri contenedora de agar. Es de suponerse que
cada clula se dividir en sus mltiples alrededores para producir colonias
separadas en el agar. Cada clula es llamada unidad formadora de colonias
(UFC). Despus de la incubacin, el nmero de colonias se reflejar en el nmero
de clulas UFC originalmente presentes. Es importante considerar un nmero
limitado de colonias pues de no ser as, stas pueden sobrepoblarse y dificultar el
conteo de las mismas (rango sugerido de 25-250 colonias). El conteo se facilita
utilizando un contador de colonias. Este mtodo es deseable porque arroja el total
de clulas viables (slo clulas vivas); en contraste con el conteo microscpico y el
conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para

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producir las colonias, ya que se necesitan como mnimo veinticuatro horas o ms.
Por otra parte, no es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias
crecen unidas en cadenas o en grupos.
OJO: Nosotros usaremos como rango sugerido 30-300 UFC
a.1 Unidades Formadoras de Colonias: Unidades Formadoras de Colonias es un
valor que indica el grado de contaminacin microbiolgica de un ambiente.
Expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un
volumen de un metro cbico de agua.
UFC es el nmero mnimo de clulas separables sobre la superficie, o dentro, de
un medio de agar semi-slido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del
orden de decenas de millones de clulas descendientes. Las UFC pueden ser
pares (diplococos), cadena (estreptococos) o racimos (estafilococos), as como
clulas individuales Unidad formadora de colonias.
Una dilucin hecha con bacteria y agua peptonada se coloca en el plato de agar
(Cuenta de plato agar para muestras alimenticias o Agar trypticase de soja para
muestras clnicas) y expandida en el plato siguiendo este patrn.
SE MIDE : UFC/ml

3. MATERIALES
Tres frascos de dilucin y dos
esptulas

Tres frascos estriles y Pipetas (06)

de 1 ml

REJILLAS Tres mecheros Bunsen

OTROS MATERIALES:
-AGUA DESTILADA

-PERA

-AUTOCLAVE

-VASO DE PRECIPITADO: 200 ml y 400 ml

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-HORNO

-PLACAS PETRI (06) ESTRILES

-GUANTES DE ASBESTO

-TERMMETRO

-FSFOROS
CANASTILLAS

AGAR NUTRITIVO (en

polvo)

CANASTA

PEPTONA

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4.

PROCEDIMIENTO
1) PREPARACIN DEL MEDIO DE CULTIVO
1.1)
Se desea preparar una muestra de 135 ml de agar nutritivo, para luego
ser distribuidos en nueve (09) tubos de prueba. Tres (03) tubos de agar
nutritivo para cada grupo.
Se sabe que: Concentracin del agar: 23g/L
TUBOS DE PRUEBA (09)
COCINILLA ELCTRICA
Por regla de tres simple: 23g --------- 1 L
X---------- 135 ml
X=3.105 g es la masa de agar que se debe pesar para preparar 135 ml.
1.2)

Se mezcla los 3.105 gramos de agar con 135 ml de agua destilada en

un vaso de precipitado de 200 ml, remover hasta que la solucin sea
homognea.

1.3)

Se calienta la solucin de agar nutritivo en la cocinilla elctrica hasta

alcanzar los 80 C (medido con termmetro)

5 PASO 1.2

6 PASO 1.3

1.4)

Se procede a vaciar el contenido la solucin de agar nutritivo preparado

en los nueve tubos de prueba, distribuyndose as 15 ml a cada tubo.

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Recordar que despus de vaciar el agar en los tubos se debe colocar

algodn en la boquilla de cada tubo con el objeto de evitar su
exposicin al medio.
1.5)

Luego los tubos son colocados en una canastilla para ser llevados al
autoclave aproximadamente 1 h.

7 PASO 1.5
8 PASO 1.4

2) PREPARACIN
ESTRIL(agua destilada + peptona)

DEL

AGUA

DE

DISOLUCIN

2.1)

Se desea preparar 297 ml de agua de disolucin (99 ml para cada

grupo). El agua de disolucin ser utilizada para lograr obtener
muestras de agua de 10-1 ml y 10-2 ml.

2.2)

Se sabe que : Concentracin de Peptona es 1 g/L

1g------ 1L
X ------- 297 ml -> X= 0.297 gramos deben ser pesados en la
balanza electrnica.

2.3)

Hecho esto procedemos a disolver los 0.297 gramos de peptona en

297 ml de agua destilada, agitamos la solucin hasta notar que sea
homognea.

2.4)

Luego vaciamos el agua de disolucin en tres (03) frascos 99 ml

cada uno.

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9 Agua de disolucin (99 ml).

GRUPO 1

3) TOMA DE MUESTRAS DE AGUA

3.1) LUGARES:
Para la extraccin de la muestra:
(a) Utilizamos un frasco estril (vaco) para la extraccin de la muestra
de agua.
(b) Abrir el grifo o cao del cual se va realizar la toma, medimos la
temperatura del agua, esperamos unos cinco minutos y anotamos la
marca del termmetro
(c) Luego abrimos el frasco y rpidamente lo colocamos en el grifo
hasta que la cantidad de la muestra de agua llegue a la mitad
aproximadamente, cerramos hermticamente. Anotamos la fecha y
hora de la toma.

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10 Muestra de agua BAO

FIA (grupo 1)

4) CULTIVO DE LA MUESTRA DE AGUA

i.
ii.

Primero retiramos los tubos de prueba que contienen el agar nutritivo,

esperamos unos minutos a que se enfren (sin dejar que se solidifique).
Vaciamos el contenido de cada tubo (nueve tubos) a las respectivas placas
petri estriles (nueve placas).

11 Paso i. y ii.

iii.

Teniendo listo las placas petri con el agar nutritivo. Realizamos lo

que muestra el siguiente esquema: (Para cada grupo)
Vaciamos 1 ml extrado
en el agua de disolucin

Extraemos 1 ml y 0.1 ml
de muestra con una
pipeta

12 Muestra de
agua
13 Agua de
disolucin
(99ml)

10-1

10-2

PLACAS PETRI con agar

nutritivo FUNDIDO
ESTRIL

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iv.
v.

Cuando se tienen listas las placas, moverlas circularmente para que exista
una distribucin uniforme de la mezcla
Una vez lista las nueve placas con muestra de agua (3 por cada grupo), las
colocamos en forma invertida en la incubadora durante 48 horas aprox. Y
esperamos los resultados.

5. RESULTADOS

Tabla 1 Cuadro resumen de la extraccin de la muestra de agua.

GRUP
O
MUESTRA
1 BAO FIA
ESTANQUE DE
3 ARQUITECTURA
5 LAVADERO DE
PLATOS DEL
TEATRO

PLACAS

PLACAS GRUPO 3

FECH
A

HORA T (C)

16/09/20
14

11:00
a.m.

16/09/20
14
16/09/20
14

11:22
a.m.
12:00
a.m.

19
21
18.5

GRUPO 1

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PLACAS GRUPO

Tabla 2 Cuadro de los resultados de UFC /ml y observaciones

GRU
PO

MUESTRA
1
ml
287

DILUCIN
10101
2
ml
ml
118
(*)

UFC/
ml

BAO FIA

287

LAVADERO DE
PLATOS DEL
TEATRO

46

11

13

46

ESTANQUE DE
ARQUITECTURA

42

420

OBSERVACIN

-Tamao:
0.1mm<x<3mm
-Tiempo de incubacin:
>24 hrs (52 hrs)
-Color: crema
Tamao:0.5mm<x<3m
m
-Tiempo de
incubacin:52 hrs 22
min
-Color: crema
-Tamao: x>0.5mm
-Tiempo de incubacin:
53 hrs
-Color: amarillo

6. OBSERVACIONES
En la placa del grupo 1 (10-2 ml) se observa una distribucin anormal de las
colonias de bacterias, lo cual no debe ocurrir ya que es la placa de menor
concentracin. Esto se debe a que el frasco de dilucin no era estril.
Se observa que el tiempo de incubacin es promedio 52 horas en los tres
grupos, esto sugiere que exista en algunas placas una mala distribucin de las
colonias, ya que el tiempo normal de incubacin es 24 horas en el que las
bacterias forman 100 generaciones.

7. CONCLUSIONES

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Las muestras arrojan resultados que se encuentran dentro del rango

sugerido para el conteo de colonias de bacterias (30-300), por tanto se
puede decir que:
o Cantidad de unidades formadoras de colonias por mililitro:
BAO FIA -> 287 UFC/ml
LAVADERO DE PLATOS ->46 UFC/ml
ESTANQUE DE ARQUITECTURA-> 420 UFC/ml
A medida que la concentracin disminuya las colonias de bacterias
disminuyen en cantidad y estn distribuidas con mayores espacios entre
ellas. Esto no se evidencia en los resultados del grupo 5 ya que en la placa
de 10-1ml hay ms colonias de bacteria (42) que la placa de 1 ml (8). VER
TABLA.2
Este mtodo de determinacin de la cantidad de colonias de bacterias en
una muestra de agua resulta ser estadstico, por lo que es necesario
realizarlo repetidas veces para as encontrar un resultado ms fiable, en
nuestro caso con los resultados obtenidos no podemos afirmar con
exactitud la calidad del agua, pero si fuese as compararamos con los
LMPs del ANEXO I. Haciendo esto las tres muestras se encuentran dentro
del rango <500 UFC/ml (bacterias heterotrficas).

8. RECOMENDACIONES
Realizar cuidadosamente la extraccin de la muestra de agua, cerrarlo
hermticamente para evitar la intrusin de otros microorganismos.
Al momento de pasar el agar nutritivo a las placas no olvidar foguear la
boquilla de los tubos de prueba para as mantenerlo estril.
Por precaucin usar los guantes de asbesto al usar el autoclave y el horno
y la cocinilla elctrica.
No olvidar lavar con desinfectante los materiales.

9.

ANEXOS

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15

10. BIBLIOGRAFA

http://www.upct.es/~minaeees/analisis_microbiologico_aguas.pdf

15

http://cdam.minam.gob.pe:8080/bitstream/123456789/109/3/CDAM0000012
-3.pdf
La calidad del agua potable en el Per, SUNASS/ pg. 43-49
Reglamento de la calidad del agua para consumo humano / MINSA,
Direccin General de Salud Ambiental/ Lima Per/ 2011/ ANEXO I, pg.
38.
http://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/02_Capi
tulo_02.pdf
http://www.ecured.cu/index.php/Calidad_del_Agua
http://es.wikipedia.org/wiki/Formaci%C3%B3n_de_colonias_(Unidad)