Anlisis cuantitativo por clculo de reas

El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ultimas cuatro

dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede
realizar un anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas.
En la cromatografa en columna, el anlisis cuantitativo se basa en la comparacin
de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones
inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El uso de uno u otro
termino depender de las caractersticas de la banda obtenida, aunque en la
actualidad con el uso de sistemas de integracin de rea computarizados, la
precisin es muy alta para el clculo de rea, sin embargo siempre es importante
conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el rea de una banda y en
qu momento es mejor usar altura en vez de rea por si llega a faltar el sistema
computarizado.
Para lograr un anlisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra
existe una gran variedad de mtodos de anlisis entre los que se pueden
mencionar:
1.- Mtodo de normalizacin:
Como indica su nombre, es un mtodo que permite establecer el porcentaje de
cada componente en la muestra. Se calcula dividiendo el rea de cada
componente entre el rea total y multiplicando por 100. Es decir:

Este trmino es independiente del volumen de inyeccin de muestra y debe

cumplirse que todos los picos deben estar separados. Sin embargo, esta ecuacin
solo se puede aplicar para una serie homologa de compuestos de punto de
ebullicin muy parecidos y con similares respuestas del detector, algo ms acorde
con la realidad es usar el factor de respuesta. Sin embargo el factor de respuesta
depende del tipo de detector utilizado el clculo ms sencillo se aplica para el
factor de respuesta cuando se utiliza en cromatografa de gases un detector de
ionizacin a la llama y este es el que se explicara a continuacin.
Para que este mtodo sea preciso, se debe cumplir que todos los analitos eluyan,
se detecten y tengan la misma sensibilidad bajo el detector. Normalmente, slo se
aplica a compuestos de una serie homloga.
2.- Mtodo de normalizacin con factor de respuesta
Cada detector tiene su forma particular de respuesta para cada analito, es por ello,
que la composicin de cada componente en la muestra no se puede relacionar
directamente a menos que se unifique la respuesta del detector para cada
componente.
La respuesta de un detector de ionizacin a la llama (FID) es independiente de la
temperatura, del flujo de gas de arrastre y de la velocidad de flujo. Esto hace ms
sencillos los clculos, ya que se puede realizar relaciones directas de peso de

muestra, lo cual contribuye a que este sea el detector ideal para el anlisis
cuantitativo.
El clculo de factor de respuesta se realiza experimentalmente de la siguiente
forma. Se pesa una cantidad exactamente conocida del patrn del analito a
estudiar, se determina su rea en el cromatgrafo y luego se realiza el clculo,

As sucesivamente para todos los componentes en la muestra.

Una vez conocido el factor de respuesta de cada componente en la muestra, se
puede realizar el clculo de normalizacin de rea con factor de respuesta.

Es de hacer notar, que en algunos libros se utiliza el factor de correccin o la

sensibilidad del detector para realizar estos clculos, en ese caso observara las
siguientes ecuaciones.

Y para rea:

Note que al final las reas corregidas sern iguales, solo se invierte los dividendos
y productos. Eso s es sumamente importante que no mezcle las dos ecuaciones o
se confunda en los calculas, ya que los resultados sern errneos.
3.- Mtodo estandarizacin externa
En este mtodo tambin se aade un patrn a la muestra problema, pero la
naturaleza qumica del patrn es la misma que la del analito de inters. Se
requiere una alta reproducibilidad en el volumen de muestra inyectada.
El principio de este mtodo es que la seal extra, producida por la adicin de
patrn, es proporcional a la seal original. La Fig. 3 muestra de forma grfica de
este mtodo. Ntese que hay seal cuando no hay adicin de patrn externo; esta
representa la concentracin original que es el objeto de determinacin. A medida
que aumenta la cantidad de patrn externo (m pe) aadido a la muestra, la seal
incrementa (rea de pico), produciendo una lnea recta de calibracin.

Para encontrar la cantidad original desconocida de analito, se extrapola la lnea

recta hasta cortar con el eje de abscisas en la zona negativa. Este valor en el eje
de abscisas, cambiado de signo, representa la cantidad (masa) de analito
presente en la muestra antes de la adicin de cualquier cantidad de patrn
externo.
En la prctica que se plantea a continuacin, se realizarn cuantificaciones
mediante el mtodo de calibracin directa y mediante el mtodo de calibracin
indirecta.
4.- Mtodo estndar interno o patrn interno
En este mtodo se aade a la muestra una cantidad conocida de una sustancia
patrn diferente a los analitos a determinar y se compara la respuesta del
instrumento con la respuesta de concentraciones conocidas del analito.
Requiere adicionar el patrn a la muestra as como a la disolucin blanco. El
estndar debe ser lo suficientemente diferente qumicamente al analito, para que
cuando se le detecte en el mismo experimento, no interfiera en el anlisis y lo
suficientemente similar para que tenga el mismo comportamiento. El estndar
interno puede aadirse antes de la preparacin de la muestra o antes de la
medida.
Este patrn interno debe cumplir una serie de requisitos: eluir cerca de los picos
de inters, estar resuelto de ellos, ser de naturaleza qumica similar a los analitos
de inters y no reaccionar con ellos y debe existir en estado puro.
Para ello, relacin de masas conocidas de un patrn de la muestra y de un
estndar deber ser preparadas e inyectadas al cromatgrafo para luego
determinar las relaciones de rea. Estas relaciones de reas son graficadas en
funcin de la relaciones de masa, como se muestra en la figura.

De esta curva se obtiene la ecuacin lineal y = mx.

Entonces se adiciona una masa conocida del estndar interno a una masa
conocida de muestra y esta mezcla se inyecta al cromatgrafo. Del cromatgrama
se obtienen las reas de analito y del estndar y luego con la ecuacin de
calibracin y conociendo la masa del estndar se puede obtener la masa del
analito en la muestra.

A partir de esta masa se puede calcular el % de este componente en la muestra

cmo sigue

La ventaja de este mtodo es que es independiente del volumen de inyeccin de

muestra lo que es sumamente importante para aquellas tcnicas cromatografas
que utilizan un mtodo de introduccin de muestra no automatizado como por
ejemplo el uso de jeringas de inyeccin en cromatografa gaseosa.
Requerimientos para un buen estndar interno:
Debe ser resuelto de los otros picos
Debe eluir cercano al pico de inters
Debe usarse una concentracin similar al pico de pico de inters.
Debe ser de las mismas caractersticas estructurales.
Ecuacin de Van Deemter