Protocolos y mtodos

Laboratorio de Genmica Viral y Humana

Facultad de Medicina UASLP

Conteo y Evaluacin de la Viabilidad de Clulas Mononucleares

Creado: 10 de Marzo de 2008
Ultima modificacin: 18 de Mayo del 2011

Conteo y Evaluacin de la Viabilidad de Clulas Mononucleares

El azul tripn (azul diamina, azul nigara, azul vital) es un colorante derivado de la toluidina que posee la capacidad de teir a
tejidos y clulas muertas (Ehrlich, 1904). Su nombre se deriva de su capacidad para matar a los tripanosomas, parsitos
causales la enfermedad de Chagas en Amrica, enfermedad del sueo en Africa y Leishmaniasis). Este colorante es uno de
varios empleados para evaluar la viabilidad de clulas por exclusin de captacin, ya que no puede penetrar y teir a las clulas
vivas con membranas ntegras. El azul tripn no es necesario para realizar conteos simples de clulas pero s es imprescindible
para diferenciar entre las clulas muertas (con disrrupcin membranal) de las vivas con membranas ntegras.
En este procedimiento, una suspensin de clulas mononucleares (CMN) es mezclada con una solucin al 0.4% de azul tripn
antes de ser observada bajo el microscopio haciendo uso de un hemocitmetro de Neubauer. A pesar de que el protocolo
original estipulaba el uso de una mezcla isovolumtrica de azul tripn y suspensin celular (digamos, 10 L de suspensin
celular y 10 L de azul tripn), tambin se puede hacer uso de otros tipos de diluciones (especialmente para suspensiones
celulares muy concentradas), siempre y cuando se considere el factor de dilucin correspondiente en los clculos finales.
El hemocitmetro es un portaobjetos especializado en el cual una retcula es grabada con laser. Su construccin permite
conocer el volumen de cualquier lquido colocado sobre el y por debajo de su cubreobjetos. La retcula se encuentra compuesta
por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (cuadro azul en la figura inferior). Los cuatro cuadros de 1 mm2 localizados en cada
esquina poseen a su vez 16 cuadros de 0.0625 mm2 . El cuadro central (tambin de 1 mm2) se encuentra compuesto por 25
cuadros de 0.04 mm2 (en verde). Estos cuadros a su vez se encuentran compuestos por cuadros menores de tan solo 0.0025 mm2
(en negro). Dada la profundidad de la cmara de tan solo 0.1 mm, cada una de estas unidades corresponde a volmenes fijos
conocidos, segn se ilustra en la figura 1.

Unidad
Cuadrante 4x4

Superficie
1 mm

Volumen

100 nl

Cuadro 1 de 4x4 0.0625 mm

Cuadro 1 de 5x5 0.04 mm

6.25 nl
Cuadro 1 de 3x3 0.0025 mm2

4 nl

0.25 nl

Figura 1. Hemocitmetro. A. Esquema del porta y cubreobjetos. B. Dibujo de la retcula grabada, cada cuadro iluminado
equivale a la superficie y volumen descritos bajo la figura 1A.

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Ultima modificacin: 18 de Mayo del 2011

Procedimiento:
1.

Coloque el objetivo 25x en el trayecto ptico del microscopio en campo iluminado.

2.

Estime el volumen de la suspensin celular de la cual se toma la alcuota para evaluar.

3.

Agregue 90 L de azul tripn al 0.4% en un microtubo de PCR o un pocillo de una multiplaca.

4.

Homogeneice la suspensin celular (en medio de cultivo o PBS) y agregue 10 L de la misma al

microtubo/microplaca que contiene el azul tripn.

5.

Mezcle la supsensin celular con azul tripn por pipeteo de 5 a 8 veces.

6.

Coloque 10 L de la mezcla en cada cmara del hemocitmetro. (Figura 2.)

7.

Coloque el hemocitmetro en el microscopio y localice la retcula grabada. (Figura 3)

Figura 2. Llenado del

hemocitmetro

Figura 3. Retcula
grabada

8.

Deje que las clulas se asienten durante 1-2 minutos y proceda al conteo.

9.

Cuente por separado a las CMN azules (muertas) y a las CMN birefringentes o blancas (vivas) que sean observadas en
cada uno de los cuadros por considerar.

10. La cuenta celular para cada cuadrante externo (cuadros 4x4, figura 3A; uno de los cuales es ampliado en la figura 3B).
deber oscilar entre 20-50 clulas, teniendo un total de clulas para los cuatro cuadrantes 4x4 de 80-200 clulas. Las
clulas localizadas en los mrgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO debern ser incluidas en las
cuentas.
11. Cuando existe una densidad celular mayor a 50 clulas por cuadrante 4x4, se proceder al conteo del cuadrante central.
Pueden contarse las clulas de todos los cuadros secundarios, o si se prefiere, los 4 cuados secundarios de las esquinas
y el central.
12. Calcule sus resultados:

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Clulas por ml
Para cuadros 4x4
Cuenta total de clulas vivas Nmero de cuadros 4x4 evaluados factor de dilucin 10,000.
Para todos los cuadros del central
Cuenta total de clulas vivas 100 (100% cuadros) factor de dilucin 10,000.
Para 5 cuadros del central
Cuenta total de clulas vivas 20 (20% cuadros) factor de dilucin 10,000.

Clulas totales
Clulas por ml x volumen (en ml) total del cual fueron extradas las clulas evaluadas.

Viabilidad celular (%)

(Nmero de clulas vivas totales) (Nmero de clulas Totales [vivas+muertas]) 100

Ejemplo:
Se tiene un cultivo celular de 3 ml. Se resuspenden las clulas del mismo y se toman 10 L para realizar el conteo, y se
depositan en un microtubo con 90 L de azul tripn (Dilucin 1:10). Se cuentan los cuatro cuadros de 4x4 obteniendo un
nmero total de clulas vivas de 455 con un total de 35 clulas muertas.
Clulas por ml = (455/4) 10 10x104 = 11'375,000
Clulas totales = 11'375,000 3 = 34'125,000
Viabilidad = 455 490 100 = 92.8 %

Notas:
1.

El azul tripn tiene una mayor afinidad por las protenas sricas que por las protenas intracelulares. Si el fondo
extracelular de la suspensin celular aparece obscuro ser necesario volver a centrifugar la suspensin celular y
resuspender el pellet celular en medio libre de protenas, PBS o Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS).

2.

Las clulas mezcladas con azul tripn debern ser evaluadas inmediatamente. Incluso las clulas vivas captarn el
colorante tras exposiciones superiores a los 10 minutos.

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3.

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Ultima modificacin: 18 de Mayo del 2011

Si las clulas forman cmulos o agregados, reptase el procedimiento asegurndose de mezclar bien la suspensin
celular y el azul tripn por pipeteo.

4.

La cmara hemocitomtrica deber ser lavada con agua destilada al trmino de su uso empleando papel higinico
Kleenex. Las Sanitas no debern ser empleadas para limpiar la cmara del hemocitmetro! Una vez lavado con
agua se deber enjuagar con Etanol al 70% y secarse con pauelos desechables Kleenex.

Referencias:
1.

Cell Culture Manual 2008-2009, 3rd Edition. Sigma Life Science, pp 230-231.

2.

Personal communication, Neema Mayor PhD, Anthony Nolan Research Institute

3.

SOP #290 Cell Counting and Viability Determination , Johns Hopkins University . The Genetic Resources Core
Facility: The Cell Center . MD, USA.

4.

Wikipedia contributors. Hemocytometer. Wikipedia, The Free Encyclopedia. May 22, 2008, at 07:00 UTC. Available
at: http://en.wikipedia.org/wiki/Hemocytometer.

5.

Fundacin Comprarte Vida, A.C. Manual de Procedimientos Serolgicos y Celulares de Histocompatibilidad.

Departamenteo de Inmunologa e Inmunogentica del Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos, 2007.

6.

Phillips, H.J., "Dye exclusion tests for cell viability." Tissue Culture: Methods and Applications ed. by Kruse, P.F., Jr.
and Patterson, M.J., Jr.: 406-408 (Chapter 3), Academic Press, 1973.

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