Professional Documents
Culture Documents
2014
ADN
ARN
Secveniere
Northernblot
Westernblot
PCR
RT-PCR
Secveniere
Southernblot
Hibridarea
in situ
Analiza
histochimic
Hibridarea
in situ
Proteine
Analiza
funciei
Analiza ARNm:
analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
Depistarea ARN strin (viral) diagnosticul bolilor infecioase i
gradului de infectare.
10.12.2014
Deproteinizarea:
prin aciunea proteazelor, urmat de prelucrarea
cu solveni organici (fenol, cloroform)
Lezarea celulelor
n prezena detergenilor i a inhibitorilor de ARNaze
Deproteinizarea
cu utilizarea solvenilor organici
Precipitarea ARN
n prezena alcoolului.
ADN recombinant
molecul de ADN obinut
din segmente de origine
diferit, capabil s
funcioneze
ADN
recombinant
10.12.2014
multiplicare;
izolare i formare a bibliotecilor de ADNrec;
analiz molecular.
Expresia genic cu
scop de:
10.12.2014
Dimensiunile fragmentului
inserat
Gazda de
clonare
Plasmide
Pn la 10 kb (ADN
genomic, ADNc)
Bacterii,
Drojdii
Bacteriofagi
Pn la 25 kb (ADN
genomic, ADNc)
Bacterii
Cosmide
Bacterii
Pn la 300 kb (ADN
genomic)
Bacterii
Drojdii
Vectorul:
-se replic autonom n celula gazd (conine punct ori)
-are capacitate s insereze i s transfere ADN strin (conine situsuri de
restricie)
-conine gene de rezisten la antibiotice (capacitate de a fi selectate)
10.12.2014
Celula bacterian
Vector plasmidic
Cromozom artificial
al drojdiilor (YAC)
10.12.2014
10.12.2014
ER
SR
FR
RFLPs
Hri de
restricie
12 kb
10 kb
10 kb
8 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
6 kb
5 kb
6 kb
4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb
+
M
10.12.2014
Vizualizarea ADN
Colorarea specific
Fuxn bazic
(in situ)
Fluorescente
(reci)
Radioactive
(calde)
Bromur de
etidiu
(n geluri)
Este necesar de tiut
Sunt necesare
structura secvenei
ADN de cercetat
10.12.2014
Probleme:
Genele umane sunt mari;
Conin secvene reglatoare
diferite de cele a bacteriilor;
Conin introni ce nu pot fi
nlturai ce celula
bacterian.
Soluie:
Obinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
int
Hidroliza ARN
(ARN-aza H)
10.12.2014
Molecule
ADN
Clonare
ADN
Clonare in
vivo
Analiz
molecular
Clonare in
vitro (PCR)
Hibridare
molecular
Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin replicare repetat
in vivo
in vitro
Tehnica PCR
Este realizat n eprubet
Replicarea unei secvene de
interes cu ajutorul unui aparat
de replicare artificial
10
10.12.2014
11
10.12.2014
Biblioteci de gene
Biblioteci genomice conin secvene de ADN
genomic, obinut prin digestie enzimatic
Etapele obinerii
bibliotecii genomice
12
10.12.2014
13