Fijadores qumicos

Acetato mercrico.- Produce mejor fijacin que el cido actico.

Acido actico.- Conserva la cromatina. Retrae los tejidos. Es ms un conservante que un fijador.

Actico-smico-dicromato
Se trata de un fijador bsico que preserva principalmente mitocondrias, ncleo y algunas veces
vacuolas. Enviado por Emmel y Cowdry, este fijador es excelente para mitocondrias. Debido a la
presencia de cido smico, la penetracin en los tejidos es lenta y no extensiva; por eso se deben
usar muestras pequeas.
Dicromato potsico (2.5% acuoso)---8 ml
Acido smico (2% acuoso)-----------2ml
Acido actico glacial------------- una gota
Fijar muestras pequeas durante 24-48 horas, lavar en agua, deshidratar e imbibir en parafina.

Acido actico.- Conserva la cromatina. retrae los tejidos. es ms un conservante que un fijador.

Acido crmico.- Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaucin al usarlo, puesto que
disuelve las lminas medias y las celulosas. Despus de una fijacin de 1-2 horas, se debe sacar la
muestra del mismo y pasarla a un conservador. Es un buen fijador si se toman las precauciones
debidas.
El cido crmico como fijador es el ms usado en investigacin citolgica. Es un oxidante fuerte y
fijador coagulante y resulta en una fijacin cida mostrando buena preservacin de los cidos
nucleicos y protenas. Las sales de cromo se disocian en soluciones acuosas formando complejos
Cr-O-Cr, que reaccionan tanto con lpidos como con protenas. El cromo, en la forma de dicromato
potsico, es uno de los pocos fijadores (los otros debidos al tetrxido de osmio y mercurio) que
preserva lpidos.
El cido crmico tiende a encoger los tejidos de manera que es usado ms frecuentemente en
combinacin con cido actico, que hincha los tejidos.
Formulacin dbil:
Acido crmico (10% acuoso)-----2,5 ml

Acido actico (10% acuoso)--------5 ml

Agua destilada-------------------92.5 ml

Formulacin media:
Acido crmico (10% acuoso)-----7 ml
Acido actico (10% acuoso)-----10 ml
Agua destilada-------------------83 ml

Acrolena
La acrolena es un fijador que penetra rpidamente en los tejidos y es muy bueno para fijar tejidos
delicados y preservar vacuolas y orgnulos subcelulares. Generalmente la acroleina se reserva
para mtodos preparatorios que utilizan como medio de imbibici plsticos, ya que las estructuras
finas preservadas son retenidas pobremente por la parafina. La acrolena es inestable a la luz y a
pH elevado, formando un disacril slido.
La acrolena es un muy buen agente entrecruzador y puede reemplazar al glutaraldehido en la
formulacin de Karnovsky con paraformaldehido o puede ser utilizada sola. La acrolena tambin se
ha mostrado que reacciona con cidos grasos, por tanto estabilizando membranas. El papel de las
microtcnicas clsicas de plantas de Feder y O'Brien describieron el uso de la fijacin con acrolena
e infiltracin en glicol metacrilato.
Precaucin: la acroleina es txica y un lacrimador extremadamente voltil. Tener cuidado cuando
se maneje este fijador.
El procedimiento es el siguiente:
1.- Fijar los especmenes en acrolena al 10% (acuoso) en tampn fosfato, cacodilato, o en un
tampn Good.
2.- Deshidratar qumicamente por transferencia directamente a 2-metoxietanol (metil o etil
celosolve) a una concentracin 0.1 mM pH 6.8, 12-24 horas a 4C.

Carmn actico hidrato de cloral.- Se trata de un fijador y colorante al mismo tiempo para la
tincin de protalos de helechos. La siguiente formulacin est preparada para 200 ml de fijador.
1. Aadir 100 ml de agua destilada a 100 ml de cido actico glacial.
2. Disolver en esta mezcla 2 g de carmn. Hervir suavemente durante 5 minutos en campana de
gases.

3. Preparar el mordiente (sulfato frrico al 5%):por una parte aadir 0.5 g de sulfato frrico, por la
otra 10 ml de la mezcla segn la proporcin: 0.5 ml de agua destilada + 5 ml de cido actico
glacial.
4. Dejar enfriar la mezcla de carmn.
5. Aadir el mordiente a la mezcla de carmn.
6. Filtrar el conjunto.
7. Aadir 320 g de hidrato de clorla (16 g /10 ml).
8. Guardar en nevera.

Etanol.- El nico alcohol que se puede utilizar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el
de 96. Se debe usar junto con otros fijadores para potenciar la accin de los mismos, o como
solucin de otros fijadores, pero no solo, ya que tiene poco poder de penetracin, es un mal fijador
de ncleos y mediocre de citoplasmas, y retrae excesivamente los tejidos. Ms que un verdero
fijador, el etanol a baja concentracin puede ser un buen conservador.

Fijador de Bouin
Acido actico glacial-----------------------------2.4 ml
Formaldehido, 37%-----------------------------11.9 ml
Acido pcrico solucin, saturada------------ 35.7 ml

Fijador de Carnoy
El fijador de Carnoy es un fijador que contiene cloroformo. Penetra en tejidos extremadamente
rpido y pude fijar piezas de tejido de pequeo tamao en minutos en vez de las horas requeridas
con otros fijadores. Los tejidos delicados pueden ser daados cuando se transiferen de soluciones
acuosas a este fijador, debido a la extrema hidrofobicidad del cloroformo y resultando en una
deshidratacin rpida de los tejidos. Reservar el fijador de Carnoy para muestras ms fuertes. este
fijador ha sido usado tradicionalmente para estructuras citolgicas.
Etanol absoluto---------60 ml
Acido actico glacila----10 ml
Cloroformo-------------30 ml
Fija piezas de tejido de pequeo tamao aproximadamente en 1 hora, lavar varias veces en alcohol
absoluto, infiltrar e incrustar.

Fluido de Regaud
Se trata de un fijador bsico utilizado con xito en la fijacin de mitocondrias de clulas de
mamfero pero que puede ser til para investigaciones en plantas.
Dicromato potsico (3% acuoso)----20 ml
Formalina (37%)----------------------5 ml
Fijar los tejidos durante 4 das cambiando el fijador diariamente. Entonces tratar con dicromato
potsico al 3% durante otros 7 das, cambiando la disolucin de dicromato tambin cada da. Lavar
2-3 veces en agua, deshidratar e infiltrar en parafina.

Etanol.- El nico alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de
96. Se debe usar junto con otros fijadores para potenciar la accin de los mismos, o como solucin
de otros fijadores, pero no solo, ya que tiene poco poder de penetracin, es un mal fijador de
ncleos y mediocre de citoplasma, y retrae excesivamente los tejidos. ms que un verdadero
fijador, el etanol a baja concentracin puede ser un buen conservador.

Etanol-Glicerina-Agua o Alcohol-Glicerina-Agua (G.A.W.)

Alcohol 96-----1/3
Glicerina--------1/3
Agua destilada--1/3
Fijador lento y conservador perecedero, mximo dos aos de permanencia en la solucin. No
endurece; para cortar por congelacin debe lavarse la muestra en agua destilada un mnimo de
cuatro horas.
Fijador de Chamberlain
Es un fijador de cido crmico que ha mostrado ser til para fijar tejidos delicados y para trabajo
con embriones. La formulacion "dbil" debe ser usada para meristemos de tallos y races, ovarios u
vulos aislados. La formulacin "fuerte" ha sido utilizada con xito para la preservacin de musgos,
algas, y hongos. Fija muestras de tejido muy pequea en 24-48 horas, lavar con agua destilada y
proceder a la realizacin de sercciones.
Formulacin dbil:
Acido crmico (10% acuoso)-----3 ml
Acido actico (10% acuoso)------7 ml
Agua destilada-------------------90 ml

Formulacin fuerte:
Acido crmico (10% acuoso)----10 ml
Acido actico (10% acuoso)-----30 ml
Agua destilada-------------------60 ml

Fijador de Farmer
El fluido de Farmer es una solucin fijadora anhidro que causa rpida deshidratacin y fijacin.
como con el fijador de Carnoy, el rpido cambio de agua en el tejido puede causar graves
alteraciones en los tejidos. Sin embargo estos dos fijadores son excelentes para investigacin
citolgica.
Etanol 100%-----------75 ml
Acido actico glacial---25 ml

Fijadores Navashin
La combinacin de sales de cromo, cido actico y formalina se refiere generalmente a un "fluido
Navashi" y se ubica mejor para la investigacin citolgica, pero estas soluciones son tambin
exitosas como fijadores para propsitos generales de algunos tejidos. Los fijadores Navashin son
mezclas de fijadores coagulantes (cromo) y no coagulantes (cido actico y formalina), las
proporciones relativas determinan el poder de fijacin y el grado de dao de tejidos blandos. Los
fijadores que contienten menores cantidades de cromo y cido actico son adecuados para tejidos
penetrables, delicados mientras que aquellos fijadores que contienen elevadas cantidades de
cromo y cido actico (y quizs otros solventes orgnicos) son ms adecuados para la fijacin de
tejidos no penetrables o tejidos leosos.
La mayora de los fijadores Navashin se preparan como dos solucones stock: la solucin "A"
continene cido actico y crmico y la solucin "B" contiene la formalina. La combinacin de
diferentes cantidades de soluciones A ms B da como resultado fijadores de diferente fuerza y
dureza. Las soluciones stock deben ser hechas por adelantado y mantenidas a temperatura
ambiente. Los fijadores tipo Navashi deberan ser preparados y usados inmediatamente, desde su
mezcla, el cido crmico se reducir y disminuir el potencial de fijacin de la solucin. Cuanto
esto sucede la solucin cambiar de color de naranga a verde o marrn. En este punto el fijador
deja de ser til y debera se desechado adecuadamente. No mantener tejidos en estos fijadores
que contienen cromo.
Una formulacin de Navashin, se refiere a los fijadores CRAF (cido crmico, cido actico,
formalina y debe ser preparada en varias fuerzas. Esta clase de fijadores convienen para propsitos
generales de fijacin citolgicas y morfolgicas para muchos tipos diferentes debido a la variacin
en la fuerza de las diferentes formulaciones CRAF. Usa la formulacin de menor nmero para tejidos
delicados y el nmero mayor de formulacin para tejidos ms resistentes. La modificacin de

Belling del fluido Navashin se ha usado para cromosomas en clula madres del polen. Este es un
fijador duro que preserva la cromatina, pero puede estar daando a otros componentes celulares.
Formulacin CRAF III
Solucin A
Acido crmico (10% acuoso)----3 ml
Acido actico (10% acuoso)----20 ml
Solucin B
Formalina----------------------10 ml
Agua destilada-----------------67 ml

Formulacin CRAF IV
Solucin A
Acido crmico (10% acuoso)----4 ml
Acido actico (10% acuoso)----30 ml
Solucin B
Formalina----------------------10 ml
Agua destilada-----------------56 ml

Formulacin CRAF V
Solucin A
Acido crmico (10% acuoso)----5 ml
Acido actico (10% acuoso)----35 ml
Solucin B
Formalina----------------------15 ml
Agua destilada-----------------45 ml

Fomulacin Belling
Solucin A

Acido crmico (10% acuoso)----6.7 ml

Acido actico (10% acuoso)------67 ml
Solucin B
Formalina----------------------26.3 ml
Saponina (p/v)-------------------0.4ml
Estos fijadores que contienen cromo, en el procedimiento de fijacin hay que mantener las
muestras durante 12-48 horas a temperatura ambiente, lavar varias veces, deshidratar e imbibir
en parafina siguiendo el procedimiento habitual. La adicin de saponina en la formulacin de
Belling (0.3-0.5%), y/o 2% de maltosa o sorbitol puede facilitar la penetracin de la mayora de
fijadores incluso en la frmula original de Bellign.
Los tejidos hemos comentado que requieren lavados antes de un procesamiento posterior. El
lavado puede hacer papilla los tejidos blandos, por tanto emplear tiempos de lavado corto. Utilizar
redecillas de alambre, etc para coger muestras pequeas en agua corriente. Conecta una mangera
de goma al grifo y aplica el agua a baja presin. Lavar los tejidos durante 10 minutos.
Las frmulas de Navashin deberan hacerse recientes antes de su uso. Despus de 12-24 horas la
solucin se vuelve verdosa y no acta mucho ms como fijador pero contina endureciendo tejidos.

Fijacin fase partida

Un mtodo de fijacin diferente es la fijacin en fase partida. En este mtodo el fijador acuoso se
mezcla con un disolvente orgnico, generalmente heptano, agitado, y usado inmediatamente. La
solucin forma un lquido en dos fases que penetra en estructuras hidrofbicas o impermeables
para permitir una fijacin mucho ms rpida del citoplasma. Mezcla 1:1 heptano:fijador acuoso,
agitar vigorosamente, a continuacin aadir los tejidos a la solucin. La fijaca fijain fase partida
debe ser til cuando los tejidos son impermeables a fijadores acuosos standar (por ejemplo hojas
con cutcula fina, esporas y polen).

Fijador de Zirkle
Los tejidos fijados con fijadores bsicos muestran preservacin preferente de mitocondrias, ncleo,
y (algunas veces) vacuolas, con el mantenimiento del citoplasma mayoritariamente disuelto. La
cromatina y "spindles" son tambin disueltos. Se trata de un fijador bastante satisfactorio, dentro
de los pocos que hay
Dicromato potsico------2.5 g
Dicromato amnico------2.5 g
Sulfato cprico----------2.0 g
Agua destilanda-------400 ml

Fijar 24-48 horas, lavar con agua, deshidratar e imbibir en parafina.

Formaldehido.- El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. es un fijador regular,
prctico y fcil de manejar, tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy
frecuentes en los vegetales y que una fijacin prolongada los endurece excesivamente. No debe
ser usado o se debe usar con ciertas precauciones en tejidos muy lignificados.

Formalina-calcio de Baker
Este es un fijador tradicional para estabilizar fosfolpidos y lpidos para investigacin en
microscopa de campo claro. Testar cada formulacin I o II en tu tejido a experimentar. Fijar 6-24
horas a temperatura ambiente y lavar con agua destilada antes de un procesado posterior.
I

II

Formalina

10

10

Clorhidro de calcio
(10% agua)

10

Acetato clcico,
monohidrato

2g

Agua destilada

80

90

Formol-Actico-Alcohol (F.A.A). Para preparar 100 ml.

Alcohol etlico de 50-70-----90 ml.
Acido actico glacial-----------5 ml.
Formaldehido 40%------------5 ml.
Se trata de un buen fijador muy difundido entre los histlogos vegetales, que da bastante buen
resultado para microscopa ptica. Buen fijador general para tallos, races y hojas. Sirve como
conservador. Endurece.
Una frmula alternativa propone mezclar a partes iguales en volumen, formaldehido al 4% en agua,
alcohol de 70 y cido actico glacial.
El cido actico puede reaccionar con estructuras salinas (cristales de oxalato clcico, y algunas
otras) introduciendo variaciones en su forma y estructura que hay que tener en cuenta.
Conviene no tener las muestras demasiado tiempo (no sobrepasar las 48 horas), y pasarlas a
alcohol de 70, aunque es ms correcto confeccionar los bloques cuanto antes y al macenarlos de
esta forma por tiempo indefinido.
Una frmula alternativa la obtenemos de Ruiz:

Alcohol etlico de 95%--------50 ml

Acido actico glacial------------5 ml
Formaldehido 37%------------10 ml
Agua destilada----------------35 ml
La concentracin final es la misma, pero evita el paso de hacer la dilucin previa del alcohol del
95%

Formaldehido-Alcohol. Para preparar 100 ml.

Alcohol etlico 96-------------58 ml.
Agua destilada----------------38 ml.
Formaldehido 40%------------4 ml.
Fijador general y conservador para estudios anatmicos de material leoso. Endurece.

Formaldehido-Alcohol-Propinico (F.P.A.). Para preparar 100 ml.

Alcohol etlico de 50-70-----90 ml.
Acido propinico -------------5 ml.
Formaldehido 40%------------5 ml.
Mezcla recomendada para Brifitos y Pteridfitos. Produce endurecimiento de los tejidos.
Una frmula alternativa la obtenemos de Ruiz:
Alcohol etlico de 95%--------50 ml
Acido propinico---------------5 ml
Formaldehido 37%------------10 ml
Agua destilada----------------35 ml
La concentracin final es la misma, pero evita el paso de hacer la dilucin previa del alcohol del
95%

Glugaraldehido
El glutaraldehido es un excelente fijador para preservar estructuras delicadas de la clula cuando
se usan resinas plsticas, pero tambin es un buen fijador estructural para la infiltracin en

parafina. Presenta dos grupos aldehido reactivos y por tante es un agente entrelazante muy fuerte.
La tendencia a formar uniones cruzadas hace del glutaraldehido un fijador til adems para
mantener la integridad estructural de los tejidos cuando se use un programa de fijacin dbil para
inmunolocalizacin o para el tratamiento con proteasas para hibriacin in situ. La penetracin en
tejidos es menor que la del formaldehido; por tanto hay que permitirle ms tiempo ara la fijacin.
Si es posible, fijar los tejidos a temperaturas bajas (4C).
Algunas propiedades destacables del glutaraldehido pertenecientes al uso biolgico:
- En solucin el glutaraldehido no tiene carga y es capaz de atravesar membranas biolgicas.
- Las propiedades de semipermeabiliad de las membranas celulares deben ser mantenidas despus
de la fijacin con aldehdo.
- La reaccin entre el glutaraldehido y los compuestos biolgicos (especialmente protenas) crea
una red de entrecurzamiento dentro del citoplasma. El entrecruzamiento es esencialmente
irreversible.
- Bajo condiciones ptimas el entrecruzamiento ocurre en segundos o minutos. La el paso limitante
es la tasa de difusin del glutaraldehido dentro del tejido.
- La reaccin del glutaraldehido (y formaldehido) con protenas producir compuestos
fluorescentes. La autoflurescencia resultante aparece como una emisin amarillo apagado que
puden esconder algunas pruebas de fluorescencia.
- La reaccin del glutaraldehido tiene poco efecto sobre la estructura terciara de protenas, las
cuales pueden dejar algunoas enzimas activas. Sin embargo, es la densa matriz de
entrecruzamiento la que puede influenciar con reacciones de anticuerpos. Por tanto, evitar altas
concentraciones de glutaraldehido cuando se preparen tejidos para la inmunolocalizacin.
El glutaraldehido tiene la mayor tendencia a polimerizar en solucin, especialmente a pH
superiores a 8. La polimerizacin reducir la concentracin efectiva de monmero e incrementa la
concentracin de la forma oligmera. Las formas polimricas de fomaldehido y glutaraldehido
poseen una capacidad similar de fijacin pero penetran en los tejidos en una tasa mucho menor. La
tasa de polimerizacin depende de la temperatura y del pH, con la menor tasa entre 1 y 4C, pH
menor de 4.5. Comprobar la pureza de las soluciones usando un espectro de anlisis UV. La
solucin de glutaraldehido muestra una gran absorbancia a l max de 235 nm cuando polimeriza o
una menor absorbancia cuando no est polimerizado (0.78 para una solucin al 1%). El fijador de
glutaraldehido debera realizarse en fresco, mantener a 4C y usar dentro de un mes desde su
preparacin. El glutaraldehido concentrado comprado debera ser mantenido a 4C.

Karnosky (Glutaraldehido-paraformaldehido al 5%). Para preparar 100 ml.

Disolver 4 gr de paraformaldehido en 50 ml de agua, agitando y calentando a 60-70C. Se han de
aadir 3-4 gotas de KOH 1N para aclarar la solucin. Todo este proceso ha de realizarse utilizando
un agitador magntico. Al llegar a los 70C se observar que la disolucin, antes turbia, se torna
rpidamente transparente. Se realizar el proceso en campana de extraccin para no respirar lso
vapores que resultan txicos.

Aadir 10 ml de glutaraldehido al 50%.

Verter a la solucin, hasta alcanzar los 100 ml con tampn fosfato 0,1 M y pH 7.2
Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observacin de
cortes en microscopa electrnica de transmisin. Ello se debe a que el contenido hdrico de las
vacuolas es alto y al penetrar el fijador, su concentracin intracelular desciende
considerablemente. De este modo estructuras que rpidamente degeneran, como las membranas,
nose aprecian con nitidez, por una deficiente fijacin.
El fijador se lleva al campo en nevera porttil para asegurarnos que no sobrepasen los 4C. El
tiempo de fijacin en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que
nosotros manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador
hasta pasadas 20 horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo
referente a la dificultad de penetracin por la naturaleza de las flores y los pelos hidrfobos; es
recomendable, sobre todo para las flores con un grado de madurez elevado fijar al vaco, esto
supone una dificultad aadida al tener que mantener las muestras a baja temperatura en nevera;
utilizamos para ello recipientes hermticos en los que se hace el vaco con una bomba de vaco
manual y luego pasamos a la nevera.
Hay que lavar el fijador, como mximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. el
lavado se lleva a cabo en tampn fosfato 1 molar a pH 7.2. Se pasan las muestras a un frasco
con abunante tampn y se hacen 5 cambios de 1/2 hora cada uno. En el tampn y en nevera
podemos mantener las muestras durante varios das sin que se aprecie ninguna alteracin.
Ruiz, pone un procedimiento algo distinto al descrito anteriormente que aade algunos elemenos
de control interesantes de mencionar.
1.- Para preparar 100 ml de fijador, disolver 2.5 g de PFA en 50 ml de agua destilada a 60-70C a
un pH de 8 o mayor. Enfriar y ajustar entonces el pH con HCl hasta llegar aproximadamente a 7.
Comprobar el pH con tiras reactivas, no usar un pH metro
2.- Aadir 0.5 ml de glutaraldehido al 50%.
3.- Diluir la solucin hasta 100 ml con tampn fosfato 200 mM, 100 ml de tampn PIPE, o 100 mM
de tampn cacodilato a pH 7.2.
4.- Fijar muestras pequeas durante 2-6 horas a 4C. Tejidos mayores necesitarn una fijacin ms
larga (overnight) y (probablemente) infiltracin a vaco. Alternativamente usa de la tcnica de
microondas para muestras de tejidos.
5.- Lavar los tejidos con tres o ms cambios de tampn, 10-30 minutos cada uno, y proceder con la
deshidratacin e imbibicin.

Metanol-cido actico (MAA)

Las anteras han sido fijadas con xito para la investigacin de cromosomas meiticos en estado
paquiteno usando metanol-cido actico. Quitar las anteras de los brotes florales seccionando en

tampn citrato (citrato sdico 0.01 M, pH 4.6). Fijar las anteras en MAA reciente a -20C (3:1).
Reemplazar el fijador dos veces a intervalos de 5 minutos y despus mntener las anteras en el
fijador a -20C durante 2-24 horas. Lavar en tampn o agua destilada antes de su observacin. El
metanol-cido actico preserva la estructura de los cromosomas pero normalmente disuelve el
citoplasma.

Mezcla Cromo-Actica. Para preparar 100 ml.

a) Dbil:
Anhidrido crmico, solucin acuosa al 10%-----------2,5 ml.
Acido actico al 10%-----------------------------------5 ml.
Agua destilada---------------------------------------72,5 ml.
Fijador para Algas filamentosas, Hongos y Briofitos.

b) Media:
Anhidrido crmico, solucin acuosa al 10%-------------7 ml.
Acido actico al 10%----------------------------------10 ml.
Agua destilada-----------------------------------------83 ml.
Se recomienda aadir 0,5% de saponina para aumentar el poder de penetracin del fijador. Tras
fijar el material duratne 24 horas, debe lavarse abundantemente en agua corriente y pasar a un
conservador. es un buen fijador para pices.

Mezcla Cromo-Actico-Formaldehido (C.R.A.F.)

Solucin a)
Acido crmico-------------------------------------------1gr.
Acido actico glacial------------------------------------7 ml.
Agua destilada-----------------------------------------92 ml.

Solucin b)
Formaldehido 40%-----------------------------------30 ml.
Agua destilada ---------------------------------------70 ml.

Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales, inmediatamente antes de su uso y tras una
fijacin de 12-24 horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70.

Paraformaldehido
El paraformaldehido (PFA, polioximetileno) es la forma polimerizada del formaldehido. El PFA es
estable cuando se mantiene a 4C-temperatura ambiente pero liberar cantidades crecientes de
gas formaldehido cuando se disuelvan en agua o tampn. Por esta razn el paraformaldehido es la
forma preferida del fijador cuando hacemos experimentos crticos. Si estamos usando formaldehido
o PFA, el agente fijador es el monmero de formaldehido (o una mezcla del monmero y polmeros
de pequeo peso molecular). El PFA debera ser usado cuando la calidad del fijador sea crtica y la
concentracin excta de formaldehido deba ser controlada. Para la fijacin histolgica general
cosecharemos resultados satisfactorios. Disolver paraformaldehido en polvo en agua a 60C y
aadiremos KOH para llevar el pH sobre 8. Cuando est disuelto, aadiremos un volumen de dos
veces la cantidad de paraformaldehido pero de tampn (0.2 M PO4, 0.2 PIPES, etc.) y pH 7.2).
El formaldehido solo, o una m ezcla que contenga formaldehido y glutaraldehido, es ubeno para la
inmunolocalizacin o hibriacin in situ. Provee al tejido de una gran estabiliad sin formar una matriz
de entrecruzamientos caracterizada por una mayor concentracin de glutaraldehido. Los tejidos
fijadoes en esta mezcla son penetrables por anticuerpos y pruebas de cidos nucleicos con un
tratamiento mnimo de proteasas.

Solucin de Allen
Este fijador citolgico es un reemplazo de la solucin de Bouin. Tener en cuenta que esta solucin
contiene cido pcrico y puede formar precipitados insolubles que pueden interferir con la tincin,
por eso asegurarse de lavar los tejidos concienciudamente despus de la fijacin. Como con otros
fijadores que contienen cromo, mezclar justo antes de su uso. Fijar overnight hasta 24 horas, lavar
en etanol de 70 hasta que el cido pcrico amarillo se elimine, y continuar con el procesado.
Agua----------------------75 ml
Formalina (37-40%)-------15 ml
Acido actico glacial-------10 ml
Acido pcrico------------------1g
Urea---------------------------1g
Acido crmico (opcional)------1g

Solucin de Bouin

La solucin fuerte de Bouin se ha utilizado con xito para preservar imgenes de la telofase en
pices de raz y sacos embrionarios. La solucin dbil se us para preservar fosfolpidos para la
subsiguiente identificacin usndo Naranga G y Azul de anilina. Fijar durante 12-24 h, lavar en
etanol de 20% para eliminar resduos de cido pcrico (Ten cuidado cuando manejes cido pcrico
puro porque puede volverse explosivo si deshidrata ms de la cuenta), entonces proceder con la
deshidratacin en imbibicin. Los resduos de cido pcrico pueden interferir con la tincin de
tejidos, por eso asegurarse de lavar concienzudamente los tejidos antes de continuar con el
proceso. Los tejidos pueden ser lavados usando un sistema de un tubo de goma conectado al grifo
y haciendo circular el agua que da con las muestras que estn introducidad en una rejilla metlica.
Bouning fuerte

Bounign dbil
Formalina------------10 ml

Formalina---------------15 ml

Acido pcrico (5%)---50 ml

Acido pcrico (1.3%)----75ml

Acido actico glacial-----5 ml

Acido actico glacial---5 ml

Agua destilada--------35 ml

Solucin de Flemming
La solucin de Flemming es un buen fijador citolgico que contiene el cromo como agente
coagulante y el fijador aditivo tetrxido de osmio. La fijacin con tetrxido de osmio se retringe a
las paredes celulares exteriores debito a su baja tasa de penetracin en tejidos, mientras que el
cido actico entra concienzudamente en los tejidos. Por tanto, este es el mejor uso de la solucin
de Flemming sobre muestras de tejido de tamao pequeo.
La solucin "fuerte" fue uno de los fijadores ms tenidos en cuenta en estos das. La solucin ms
dbil est reservada generalmente para tejidos delicados. Prueba para determinar qu frmula (o
modificacin) es la mejor para tu material particular.
Prepara el fijador en dos soluciones stock: la solucin A contendr los cidos crmicos y actico y la
B contendr slo cido smico (tetrxido de osmio). Aade la solucin de osmio slo antes de su
uso. Fija piezas de tamao muy pequeo durante 24-48 horas, lavar concienzudamente, y preparar
para seccionar como es habitual. Los tejidos fijados con osmio necesitan ser blanqueados con leja
antes de su ticin.
Precaucin: el cido smico es un compuesto voltil extremadamente txico. Puede fijar crneas y
otros tejidos a travs de una fijacin con vapores. Emplear preacuciones especiales y usar siempre
en campana extractora de gases.

Acido crmico
(1%)
Acido actico
(1%)

Dbil

Fuerte

25

75

10

Acido actico
glacial
Agua destilada
Acido smico
(2% acuoso)

55

10

20

Terxido de osmio
Aunque no es un fijador comn para microscopa de campo claro, el tetrxido de osmio tiene un
entrecruzamiento extermadamente til, fijador aditivo para estabilizar lpidos y por tanto la
estructura de membranas. Uno de sus ventajas es la posibilidad de entrecruzar carbonos
insaturados que se encuentran en la bicapa lipdica de membranas y posiblemente con grupos
aromticos del triptfano y la histidina. Ambas protenas y lpidos deben ser entrecruzados por
reaccin qumica con tetrxido de osmio. Este compuesto casi no muestra reactividad con los
cidos nucleicos o carbohidratos, aunque hay autores que sugieren que la exposicin al cido dbil
podra mostrar cidos nucleicos (y protenas) susceptibles a la reaccin del tetrxido de osmio.
El tetrxido de osmio vuelve los tejidos negros y para ser tiles a la microscopa de campo claro los
tejidos deberan ser blanqueados. Por esta razn y debido a su toxicidad, el tetrxido de osmio no
est recomendado para propsitos generales de microscopa de campo claro. Tratar las secciones 5
minutos a temperatura ambiente con cido peridico o "Oxone" al 1% (acuoso, peso/volumen) para
convertir el tetrxido de osmio en un dixido de osmio menos txico.
http://www.euita.upv.es/varios/biologia/tecnicas_de_histologia_vegetal/Documentos/Fijadores_quim
icos.htm