Metode spectroscopice i electrochimice de

analiz a interaciunii AND-ului cu

medicamentul folosit n tratarea cancerului
numit metotrexat

Metotrexat, acid 4-dezhidroxi-4-mino-N10-metil-folic, este un

acid folic cu o grupare amino substituita la gruparea hidroxil la
pozitia C4 de la inelul piridinic rezultand un inhibitor al enzimei
dehidrofolat reductaza. MTX impiedica sinteza bazelor purinice si
pirimidinice ale celulelor canceroase, inhiba sinteza de ADN, ARN
si proteinelor fiind utilizat in tratarea numeroaselor disfunctii
neoplastice ex: leucemie acuta infantila, cancer la gat si cap,
osteosarcoma in micrometastaza cu toate ca esterii polietileni ai
acestuia au fost folositi in sistemul de eliberare a medicamentelor.

Exista mai multe tipuri de interactiuni asociate medicamentelor

care se leaga de ADN : intercalare, legatura non-covaleta in sant,
legatura covalenta, clivare/scindare de ADN si incorporare de
nucleotide analoage. Aceste interactiuni de legatura implica modificari
atat in moleculele medicamentului cat si in cele ale AND-ului datorita
structurii complexe. Gruparile laterale (secundare) ale moleculelor
medicamentului se pot aditiona la: extremitatile perechilor de baze , in
santul minor sau major al substratului zahar-fosfat, pe suprafata
subtratului fosfat, sau la suprafata ADN-ului dublu-helix fie prin
legaturi de hidrogen fie prin interactiuni electrostatice.

Interactiunea dintre ADN si medicament a fost studiata cu

ajutorul urmatoarelor metode: rezonanta magnetica nucleara,
spectroscopia de masa, spectroscopia Raman si FT-IR, tehnici
de modelare moleculara, dializa de echilibru, dicroism linear
electric, electroforeza capilara, rezonanta suprafetei
plasmonului, etc.
Unele metode electrochimice utilizate sunt voltametria
ciclica, voltametria anodica, analiza cronopotentiometrica si
analiza potentiometrica. Interactiunea ADN-ului cu citrat de
sildenafil si ciprofloxacin, a fost studiata utilizand biosenzorul
de AND electrochimic.

Numerosi mutageni, incluziv metotrexat, se fixeaza in

spatiul dintre doua perechi de baze adiacente process
numit intercalare. Cei mai des intalniti agenti de tip
intercalativ sunt: etidiu, daunomicina, doxorubicina,
talidomida, etc. Pentru ca acesti mutageni sa se poata
fixa, separa mai intai perechile de baze, denaturand
lanturile AND-ului prin desfacerea dublului helix. Astfel
impiedica procesul de transcriptie si translatie cauzand
toxicitate si mutatii. Exemple de astfel de compusi sunt:
benzopiren, acridina, bromura de etidiu si aflatoxina.

Interactiunea dintre metotrexat si ADN a fost

studiata utilizand diferite metode electrochimice.
Prin analiza comportamentului voltometric anodic al
MTX pe electrodul de carbon sticlos in solutia tampon
acetat (pH 3,6) {utilizand tehnici cronocoulometrice si
voltametrice}, s-a demonstrat ca oxidarea
metotrexatului s-a realizat printr-un proces controlat de
difuzie ireversibila, metoda fiind aplicata si la
determinarea metotrexatului din urina umana diluata.
Interactiunea AND-ului dublu catenar cu combinarea
metotrexat-emodin a aratat ca activitatea anticancer a
metotrexatului este intensificata de legaturile
intermoleculare de hidrogen formate. De asemenea
metotrexatul poate fi folosit la deosebirea AND-ului
monocatenar de cel dublucatenar datorita interactiunii
diferite cu aceste moleculele.

La interaciunea dintre metorexat i ADN s-a utilizat un

biosenzor electrochimic de AND ntr-o soluie tampon de
acetat cu pH 4,2 (20% atanol). . Mecanismul de ataare a
metotrexatului de moleculele de ADN este determinat prin
tehnici poteniometrice la curent constant, cu ajutorul
radiaiilor UV-VIS i metoda FT-IR, constanta de ataare fiind
3,821 x 105 M-1. Semnalul analitic a fost dat de scderea
picului asociat concentraiei de guanin.
n urma interaciunii MTX-ADN au avut loc anumite
modificri analizate cu:
Radiaiile UV-VIS
au indicat efecte hipercromice i
hipocromice n banda de absorbie maxim a metotrexatului
Analiza FT-IR
a aratat modificri n benzile caracteristice
absorbiei n IR la toate gruprile fosfat i bazelor AND-ului.
Prin modificarea benzilor caracteristice gruprilor C=O, N-H,
C-H i O-H ale metotrexatului
s-a evideniat legtura
intercalata intre metotrexat si ADN

Materiale si metode
Aparatura
Biosenzorul electrochimic de ADN consta intr-un electrod
de carbon sticlos si un electrod de referinta Ag/AgCl. Spectrul
UV-VIS utilizand spectrometrul T80 iar spectroscopia FT-IR s-a
realizat utilizand sistemul BX-FT-IR.
Reactivi si preparerea amestecului de solutie
Reactivi si substantele folosite : solutie cu continutul de AND
din sperma de somon, acid acetic, acetat de sodiu, tablete de
metotrexat. Amestecul de solutie de diiferite concentratii de
AND a fost preparat prin dizolvarea a 2, 4, 6, 8 si 12 mg de
AND de sperma de somon in apa deionizata dublu distilata.
Solutia astfel formata s-a agitat timp de 2 h pana la
solubilitatea completa a ADN- ului.
Amestecul de solutie cu metotrexat s-a preparat cu NaOH 0,2
M prin agitare 30 minute.
Ca electrolit s-a folosit solutia tampon acetat de sodium 0,16
M HAc-NaAc (20 % etanol, pH 4,2).

 Pretratarea electrodului si fixarea ADN-ului

Inainte de fixarea AND-ului electrodul de carbon a fost

slefuit cu kitul de cutatare Alumina pentru a se obtine o
suprafata asemanatoare oglinzii. Dupa ce alumina a fost
indepartata cu ajutorul undelor sonore, electrodul a fost
spalat cu apa deionizata si apoi uscat.
Solutia de ADN a fost aplicata pe suprafata electrodului cu
ajutorului unei micropipete lasandu-se apoi la uscat timp de 40
minute la temperatura camerei. Conditiile potentiometrice utilizate
au fost: timpul de 60 secunde; current constant,+ 8A iar domeniul
potential cuprins intre 0 si 1,2 V.
Cantitatea de ADN fixata pe electrod a fost determinata prin
reprezentarea grafica a suprafetei picului de guanina in functie de
concentratia de ADN.
Interactiunea metotrexatului cu ADN-ul
Electrodul cu ADN a fost imersat intr-o solutie acetat cu un ph de
4,2 (solutie tampon CHac-NaAc )in care se afla si metotrexat. Procesul a
avut loc intr-un circuit deschis pentru selectarea timpilor. Dupa
acumularea metotrexatului, electrodul a fost limpezit si reintrodus
intr-o solutie tampon acetat fara metotrexat, inregistrandu-se o
voltamograma la curent constant.

Rezultate si discutii
Optimizarea fixarii ADN-ului
Optimizarea fixarii ADN-ului dublucatenar pe electrodul
de carbon sticlos, a fost stabilita prin fixarea a 2 L de
ADN din solutii de diferite concentretii (2, 4, 6, 8, 10 si 12
mg/ml). Semnalul dt/dE a fost reprezentat in functie de
diferenta de potential. Guanina din AND a fost oxidata la
+0,89 V scazand treptat la +0,86 V cu o crestere initiala
a concentratiei de AND fixat. Pe baza pikului oxidarii
guaninei s-a determinat concentratia de AND fixat pe
suprafata electrodului. Oxidarea guanine a fost folosit ca
parametru in determinarea AND-ului fixat pe electrod.

 Figura 1. Optimizarea fixarii ADN-ului pe elctrodul de carbon sticlos utilizand

analize potentiometrice la current constant. Sunt reprezentate mai multe
concentratii de ADN in functie de aria picului guaninei obtinute prin fixarea
concentratiilor corespunzatoare de ADN pe electrodul de carbon sticlos.

Aria picului oxidarii guanine a aratat o

crestere treptata odata cu cresterea
concentratiei de AND fixat pe electrodul de
carbon sticlos.
Diferite concentratii de AND au fost
reprezentate determinate pe baza(in functie)
picului de guanina. Aria pikului a crescut
concomitant cu cresterea concentratiei de
ADN. Totusi prin variatia concentratiei initiale
din amestecul de solutii, cantitatea de AND
fixate pe electrod a crescut de la 0,014 la 0,12
mg. In acest studiu filmul gros de AND aplicat a
impiedicat atasarea nedorita a moleculelor de
medicament pe suprafata electrodului.

Studii electrochimice asupra

interactiunii MTX-AND
Optimizarea timpului de interactiune
Picul guaninei a scazut odata cu
cresterea timpul de acumulare. Dupa 4
minute de interactiune scaderea picului
guaninei atinge limita minima si ramane
constanta timp de 5 minute. De aceea in
toate experimentele, timpul de
interactiune folosit a fost de 5 minute,
care in cazul interactiunii ADN-ului cu
ciprofloxacina a fost considerat insuficient.

 Optimizarea pH-ului
Analiza potentiometrica a interactiunii dintre ADN si MTX s-a
realizat pe un domeniu al pH-ului 4,0-8,0 intr-o solutie tampon
acetat. Reyultatele au indicat o definire mai buna a picurilor in
cazul masuratorilor din mediul acid, pH fiind 4,2. De ase,menea
s-a avut in vedere si concentratia molara, astfel ca solutia
tampon de 0,16 M a fost selactata ca electrolit producand un
singul pic anodic ceea ce indica ireversibilitatea reactiei.
pH< 4,2 => sensibilitate a picului, iar voltamograma a fost
foarte slaba
pH > 7, 2 => picul anodic aproape a disparut ceea ce indica
ca MTX a fost supus oxidarii
Asadar pH de 4,2 a fost selecata pentru interactiune. La acest
pH pucuriel potentiale ale oxidarii ADN-ului au trecut de la 0, 89
la 0,94 indicand o stabilitate a ADN-ului la suprafata electrodului
ceea ce determina o intercalare partiala a MTX in structura ADNului dublu helix. Totusi cu cresterea concentratiei metotrexatului
de la 2 la 3,6 picul potential al oxidarii ADN-ului s-a modificat de
la 0,89 la 0,87.

 Optimizarea concentratiei
medicamentului

Figura 2. Voltamogramele potentiometrice la current continuu pentru

interactiunea Mtx-AND utilizand electrodul modificat cu AND
dublucatenar. Semnalele oxidarii guaninei la blanck (a), electrodul
modificat cu AND (g) si (b-f) dupa intereactiunea de 5 minute cu
diferite concentratii de MTX (2, 2.4, 2.8, 3.2 si 3.6 M) in solutia
tampon 0,16 M acetat ( 20% etanol, pH 4,2

Prin cresterea concentratiei de medicament

de la 0 la 3,6 M picul pentru ADN s-a micsorat
cauzand o scadere a picului potential de la 0,89
la 0,94 ceea ce a indicat ca MTX s-a intercalat
partial in structura ADN-ului dublu helix
ingreunand procesul de oxidare de oxidare la
suprafata electrodului.
Deplasarile picurilor potentiale au indicat
faptul ca structura sa aromatica planara a MTX a
favorizat intercalarea in structura ADN-ului.
Curba de calibrarea a fost obtinuta prin
reprezentarea concentratiei de MTX in functie de
oxidarea guaninei. Prin cresterea concentratiei
de medicament picul oxidarii guaninei a scazut.

 Spectroscopia UV-VIS a interactiunilor MTX-ADN

Spectroscopia UV-VIS a fost folosita pentru evidentierea formarii

de noi compusi de ADN cu medicament. Domeniul spectral al
abosorbtiei interactiunii dintre MTX si ADN a fost 190420 nm.
Picul absorbtiei pentru ADN este ~258 nm. In amestecul de solutii
de AND au fost utilizate diferite concentratii (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,
0.1, 0.12 si 0.14 mg/ml de solutie tampon acetat 0.16M,pH 4.2)
Cresterea absorbantei a crescut cu cresterea concentratiei de AND
de la 0.02 la 0.1 mg/ml apoi cresterea a fost neregulata.

Figura 3.Spectrul UV-VIS pentru ADN

Figura 3.Spectrul UV-VIS pentru ADN (a), MTX (b), interactiunea MTX-ADN n solue tampon Hac-NaAc (20
% etanol, pH 4,2) (c), ADN= 10 L i MTX=500-900 L, DNA=2-12 L i MTX=500 L

 Metotrexatul a avut un pic de absorbtie ascutit la 208 nm,

unul la 256 nm si unul larg la 302 nm. ( figura 3 b) se
observa ca in cazul MTX picurile absorbantei la 208 si 302
nm nu s-au modificat in timp ce un nou pic larg de absorbtie
la 254 nm pare a a fi suprapunerea spectrului de ADN
(258nm) si MTX (256 nm)( Figura 3c). interactiunea dintre
MTX si AND a fost indicata (reprezentata) de absorbanta
scazuta in general si de o usoara deplasare a picului spre
lungimi de unda mici. Aceleasi rezultate s-au obtinut si cu
metoda electrochimica.atunci cand o anumita cantitate de
medicament (o cantitate fixa) (2 M) a fost pusa in contact
cu diferite concentratii de ADN (0,02-0,12 mg/ml de solutie
tampon)(figura 3 d) fenomenul de intercalare a MTX cu AND
poate fi explicat (identificat) de prezenta a doua tranzitii
electronice diferite, -* si n-* in spectrul MTX. Odata cu
cresterea cantitatii de AND a crescut si inaltimea picului
absorbantei EX efectul hipercromic din banda II (- *) poate
fi asociata cu intensificarea intercalarii AND-ului iar
complexul astfel format devenind mai compact.

Cresterea in intensitate a absorbantei

maxime (effect hipercromic) a medicamentului
precum si legutura dintre moleculele AND-ului
este o caracteristica tipica procesului de
intercalare a AND-ului. Aceste caracteristici
spectrale sunt atribuite(datorate) interactiunii
puternice dintre gruparile cromofore ale MTX cu
bazele AND-ului.
Acest efect hipercromic evidentiaza
intercalarea MTX in structura AND-ului. La
interactiunea cu AND-ul /mtx a aratat atat effect
hipercromic cat si effect pipsocromicindicand o
legatura puternica de intercalare cu AND-ul.

 Spectroscopia in infrarosu cu
transformata fourier
Spectroscopia vibrationala ( Raman i n
infrarou ) este adesea folosita pentru a
caracteriza natura interaciunii medicament ADN i pentru a monitoriza efectele diferitelor
medicamente asupra structurii ADN-ului.
Analiza prin spectroscopie in infrarosu cu
transformata FOURIER ( FT - IR) este folosit
pentru a determina situsuri de fixare a
medicamentelor pe un anumit substrat,
structura secundar a AND-ului , precum i
variaiile structurale ale complexelor
medicament - ADN n soluie apoas.

Figura 4. Spectrul FT-IR al AND-ului (a), al MTX (b), si al complexuluiAND-MTX (c)

Spectrele FT - IR au fost mprite n trei regiuni:

regiunea gruparilor functionale(4000-1300 cm-1 )
regiunea de amprente ( 1300-910 cm-1 )
regiunea aromatic ( 910- 650 cm-1 )

Aspectul benzilor de absorbie puternice din zona 4000-2500 cm -1

sunt de obicei cauzate vibratiilor de intindere a legaturilor dintre
hidrogen i ali atomi cu mas de 19 sau mai puin.
Benzile din regiunea 1800-1500 cm-1 pot fi datorate intinderii
legaturii C=O , vibratiilor legaturii N-H ale resturilor de baze . Benzilor
de absorbie ale AND-ului la 1658 cm-1 reprezinta vibratiile legaturii
C6=O ale guaninei i legaturii C4=O ale timinei ; la 1,579 i 1,489 cm 1 se identifica adenina i citozin i la 1417 cm -1 vibraiille inelului de
guanina;
Benzile din regiunea de amprente (1300-910 cm -1) includ vibratiile
de interactiune a compusului format.
In spectrul AND-ului se identifica benzi la 1240 , 1087 i 965 cm -1
corespunztoare vibraiei simetrice i antisimetrice de intindere a
legaturii gruparii fosfat a ADN-ului.
Vrfuri de absorbie puternica aparute la 832 i 791 cm -1 , se pot
datora ntinderii legaturilor P-O , C-O i vibratiilor legaturii N-H din
afara structurii planare sau cauzate de prezena inelelor aromatice .
Cu toate acestea anumite molecule nearomatice , cum ar fi aminele i
amidele pot contribui , de asemenea, absorbtiei n aceast regiune .

Cretere n intensitate a benzii de absorbie a ADN-ului ( 1,658

cm-1) de la 27% la 42% este asociata cu trecerea benzii de la 1658
la 1657 cm-1 care corespunde vibratiilor legaturii guaninei C6=O i
timinei C4=O. Schimbrile in intensitate ale altor vibratii de ADN
sunt associate cu trecerea benzilor de la 1579 ( adenin , 26 % ) la
1581 cm-1 ( 30 % ) i de la 1,417 ( vibraiile din inelul guaninei , 39
% ) la 1,415 cm-1 ( 12 % ) ; banda de absortie a ADN-ului la 1489
cm-1 ( citozina ) a disprut complet dup interaciunea cu
medicamentul . Aceste modificri sunt semnificative n benzile de
absorbie IR caracteristice tuturor bazelor de ADN i reflecta modul
de intercalare a MTX cu ADN .
Benzile de absorbtie datorate intinderii (expansiunii) ionilor
carboxilati s-au deplasat de la 1565 la 1581 cm -1 si de la 1419 la
1415 cm-1. Benzile de absorbtie datorate inelului aromatic de
asemenea s-a deplasat de la 877 la 875 cm -1. modificarea
(deplasarea) acestor benzi este dovada interactiunii majore dintre
MTX si ADN prin gruparile metotrexatului C=O,N-H,C-H sau O-H. Pe
langa acestea, benzile de absorbtie de la 3985, 3557, 3506, 3414
si 649 cm-1 au disparut din spectrul IR al MTX dupa adaugarea de
ADN.

 Concluzii
Cantitatea maxim de ADN care poate fi imobilizat (fixat) pe
electrodul de carbon sticlos este de 0,02 mg.
Picul oxidarii guananei a sczut cu creterea concentraiilor de
MTX
La intercatiunea dintre MTX si AND s-a determinat pH ul optim de
4,2 iar timpul de interactiune de 5 min
Valoarea constantei de legare a fost n intervalul de 10 -5 pentru
MTX aratand modul electrostatic de intercalare la interaciunea cu
ADN .
Studiile UV-VIS au aratat caracterul hipercromic i hipsochromic al
interaciunii MTX - ADN
Analiza FT-IR a AND-ului si MTX nainte i dup interaciune a
ilustrat implicarea bazelor azotate , a gruprilor fosfat din ADN prin
legturi de hidrogen si interactiuni electrostatice si de intercalare
Aceste studii arata importanta biosenzorului electrochimic de ADN
in intelegerea interactiunii medicamentelor cu AND-ul oferind
informaii rapide i sigure cu privire la afinitatea compuilor chimici
i mecanismul lor in interaciunea cu ADN-ul .