LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

LAPORAN PRAKTIKUM MINGGU KE-III

Pembuatan Sel E.coli Kompeten dengan Perlakuan CaCl2 dan Kejutan Panas (Heat
Shock) ,Transformasi, dan Elektroforesis Poliakrilamida SDS-Page

Kelas Bioteknologi A1
Kelompok 3
DISUSUN OLEH :
Brigitta Winata

1306480295

Cakra Meliala

1306480774

Dini Khoirunnisa

1306414362

Dwitta Medya P

1306376944

Hana Rosanna

1306405465

Indah Pratiwi

1306397040

Raihandana Putra

1306480231

Sung Endah

1306479886

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2016

I. PEMBUATAN SEL KOMPETEN DENGAN PERLAKUAN CaCl2 DAN KEJUTAN

PANAS
I Pendahuluan
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru
dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan
bertujuan untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik DNA rekombinan meliputi
isolasi DNA genomik atau kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi
sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke
dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang
menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang,
dan analisis DNA rekombinan. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan
atau rekayasa genetika ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel
yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen (RifaI, M.,
2010).
Transformasi adalah penyisipan materi genetik asing eksternal yang berupa fragmen
DNA (baik DNA kromosom maupun DNA plasmid) ke dalam sel melalui dinding sel yang
akan menjadi inang. Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan
DNA ke dalam sel bakteri (Cowell & Austin, 1997). Metode ini sekarang secara luas dipakai
untuk mentransfer plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya (Hanahan 1983).
Pada dasarnya, dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda
asing termasuk DNA, tetapi, dalam kondisi tertentu, dinding sel dapat memiliki semacam
celah atau lubang yang bisa dimasuki oleh DNA. Oleh sebab itu, sebelum melakukan
transformasi, bakteri yang akan digunakan perlu diubah terlebih dahulu dari sel regular
menjadi sel kompeten (sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik
maupun kimia.) agar DNA plasmid dapat lebih mudah diintroduksikan saat transformasi.
Sel inang yang paling umum digunakan sebagai sel kompeten adalah Escherichia coli
karena ia dapat bereplikasi secara cepat serta memiliki kandungan plasmid dalam jumlah
banyak sehingga fragmen DNA yang didapatkan untuk dijadikan rekombinan juga banyak.
Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap DNA asing. Setiap sel
memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat
menyerap DNA secara efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak
efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki kemampuan alami
menyerap DNA asing yang rendah (Tsen et al. 2002).
Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus,
sehingga sel tersebut menjadi kompeten. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan fisik

dengan garam kalsium klorida (CaCl2) atau rubidium klorida (RbCl) (Suharsono, 2006).
Pembuatan sel kompeten dengan penambahan larutan CaCl2 bertujuan untuk megganggu
keseimbangan kalsium dalam membran sel inang dengan adanya kation divalent Ca2+, dan
membantu terbukanya protein integral membran sebagai kanal ion karena adanya perbedaan
muatan. Membran akan dinetralkan dan plasmid DNA yang bersifat negatif akan dapat masuk
dan diintroduksikan.
II Prinsip
Prinsip dari pembuatan sel kompeten adalah dengan pemberian perlakuan khusus
terhadap sel baik secara fisik ataupun kimia agar kemampuan sel dalam menyerap DNA asing
untuk proses transformasi dapat ditingkatkan. Salah satu metode fisik yang paling sering
digunakan adalah dengan penambahan garam kalsium klorida (CaCl2)
IIITujuan
Menyediakan sel yang siap digunakan untuk transformasi DNA rekombinan ke sel
inang (E. coli) untuk memperoleh E. coli rekombinan
IV Alat dan Bahan
a

Alat
i

Pipet mikro 0-20L dan 20-200L beserta tip-nya

ii

Tabung mikro 1.5 mL

iii

Rak tabung mikro

iv

Erlenmeyer 100ml

b Bahan

Escherichia coli DH5

ii

Larutan 0.1 M CaCl2 dingin

Prosedur kerja
1. Tumbuhkan E. coli DH5a pada kaldu LB, 37C semalam
2. Inokulasikan masing-masing 0,4 mL ke dalam 10 mL LB di dalam 125 mL
erlenmeyer. Inkubasikan secara aerobik, 37c selama 3 jam.
3. Secara aseptik mikrobiologik masukkan 1,5 mL kultur segar dari tahap 2 ke dalam
tabung mikro steril untuk sentrifusi. Pelet sel dengan sentrifusi 5000 rpm selama 1
menit pada mikrosentrifus berpendingin.

4. Cuci masing-masing pellet di dalam tabung dengan 1 mL 0,1 mL CaCl2 dingin.

Diamkan di atas es selama 15 menit.
5. Pelet sel dengan sentrifusi 5000 rpm, 1 menit seperti pada tahap 3, kemudian
suspensikan pellet dalam 200 mikroliter larutan CaCl2 dingin. Diamkan di atas es
selama 10 menit. Sel kompeten sudah siap dipakai untuk transformasi.
6. Tergantung dari kondisi selnya, 1 tabung mikro (200 mikroliter suspensi sel) dapat
dipakai untuk 1-2 transformasi.
VI

Alur Kerja

VII

Kesimpulan
Sel kompeten adalah sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar

karena telah mendapatkan perlakuan khusus. Pada praktikum kali ini, digunakan bakteri
Escherichia coli untuk dibuat menjadi sel kompeten agar E.coli dapat mengambil DNA dari
lingkungannya. Pemilihan bakteri E.coli dikarenakan bakteri ini dapat ditemukan dalam
bentuk flora normal dalam tubuh dan dapat membelah dengan cepat sehingga sel rekombinan

yang dihasilkan akan lebih banyak dalam waktu yang singkat. Pembuatan sel kompeten
dilakukan karena pada kondisi normal, dinding sel bakteri akan melindungi sel dari
masuknya benda-benda asing termasuk juga DNA, sehingga DNA rekombinan yang telah
dimurnikan tidak dapat diintroduksikan ke dalam sel inang.
Pembuatan sel kompeten dapat dilakukan dengan perlakuan fisik penambahan garam
kalsium klorida (CaCl2). Penambahan Garam CaCl2 akan mempengaruhi keseimbangan
kalsium dan porositas membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran
menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan menjadi permiabel terhadap produk ligasi
sehingga produk tersenut dapat masuk ke dalam sel. Pembuatan

sel kompeten dengan

menggunakan metode CaCl2 ini, cukup efisien dan tidak membutuhkan peralatan khusus.
Pada prakrikum kali ini, praktikan belum dapat melihat hasil yang diperoleh
dikarenakan praktikum tidak dilakukan.
:
VIII

Daftar Pustaka
1. Cowell IA, Austin CA. 1997. cDNA Library Protocols : Preparation of
Competent Cells for High-Efficiency Plasmid Transformation of Escherichia coli
Vol 69. Humana Pr.
2. Malik, Amarila. 2016. Protokol Kerja Bioteknologi. Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Farmasi. Depok : Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
3. Rifai, M. (2010). Genetika Rekombinasi dan Populasi. Ed. 1. Malang: Galaxy
Science.
4. Suharsono, W. U. (2006). Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen.
Bogor (ID): Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
5. Suharsono et all. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi
H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma

malabathricum L. Institut

Pertanian Bogor. Vol 1 : 67-74. J Agron. Bogor, Indonesia.

6. Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of
Biomedical Science. 9:246-252.

II.
I.

Pendahuluan

TRANSFORMASI

Transformasi adalah penyisipan materi genetik asing eksternal yang berupa fragmen
DNA (baik DNA kromosom maupun DNA plasmid) ke dalam sel melalui dinding sel yang
akan menjadi inang. Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan
DNA ke dalam sel bakteri (Cowell & Austin, 1997). Metode ini sekarang secara luas dipakai
untuk mentransfer plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya (Hanahan 1983).
Transformasi pertama diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982
berdasarkan pada penelitiannya bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNAnya ke
dalam suatu medium, yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri lain yang ada dalam
kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang
mati atau mengalami autolisis. Namun, ternyata ada lebih dari 1% spesies bakteri yang
mampu melakukan transformasi secara alami, dimana mereka memproduksi protein-protein
tertentu yang dapat membawa DNA menyeberangi dinding sel.
Pada dasarnya, dinding sel berfungsi melindungi sel dari masuknya benda-benda
asing termasuk DNA, tetapi, dalam kondisi tertentu, dinding sel dapat memiliki semacam
celah atau lubang yang bisa dimasuki oleh DNA. Oleh sebab itu, sebelum melakukan
transformasi, bakteri yang akan digunakan perlu diubah terlebih dahulu dari sel regular
menjadi sel kompeten (sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat
perlakuan fisik maupun kimia.) agar DNA plasmid dapat lebih mudah diintroduksikan
saat transformasi.
Pembuatan sel kompeten dapat dilakukan dengan penambahan larutan CaCl 2 untuk
membuat dinding sel menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid dan teknik
Heat Shock mendinginkan, memanaskan, dan mendinginkan kembali pada gradian suhu
extreme agar DNA dapat masuk ke dalam sel dan tidak keluar kembali. Teknik ini
ditemukan oleh trio peneliti Stanley Cohen, Annie Chang, Leslie Hsu pada tahun 1972.
Transformasi alami biasanya melibatkan DNA rantai lurus (linear) sedangkan
transformasi artifisial melibatkan DNA rantai melingkar (plasmid) (Muladno, 2002).
Berdasarkan Tsen (2002), proses transformasi berlangsung dalam beberapa tahap, yaitu:
1.

Molekul DNA rantai ganda berikatan pada reseptor yang terdapat di permukaan
sel. Perikatan ini bersifat reversible.

2. Pengambilan DNA donor yang bersifat irreversible. Pada saat ini, DNA donor akan
menjadi resisten terhadap enzim DNAase yang ada di dalam medium.
3.

Konversi molekul DNA donor yang berupa rantai ganda menjadi molekul rantai
tunggal melalui degradasi nukleotida terhadap salah satu rantai.

4.

Integrasi (insersi kovalen) seluruh atau sebagian unting tunggal DNA donor
tersebut kedalam kromosom resipien.

5.

Segregasi dan ekspresi fenotipik gen donor yang telah terintegrasi

Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan dapat dilakukan dengan resistensi

antibiotika (misalnya ampisilin) dan seleksi warna salah (satunya teknik seleksi biru putih).
Seleksi biru putih yaitu metode untuk memisahkan sel yang mengandung plasmid
rekombinan dengan sel yang mengandung plasmid tanpa insert (Brown 1995). Metode ini
menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida). Koloni
yang berwarna biru artinya tidak mengandung DNA sisipan, sedangkan koloni berwarna
putih artinya DNA bakteri mengandung DNA sisipan.
II. Prinsip
Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian
dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA
melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Cowell & Austin 1997).
III.

Tujuan
Mengintroduksikan DNA rekombinan yang telah dimurnikan ke sel inang (E.coli)

untuk memperoleh E.coli rekombinan.

IV.

Alat dan Bahan

c

Alat
v

Pipet mikro 200L dan 1000L beserta tip-nya

vi

Mikrosentrifus berpendingin

vii

Bak es dan es yang telah dihancurkan

viii

Tabung mikro 1.5 mL beserta rak tabung mikro

ix

10 tabung reaksi steril

Beads untuk menghomogenkan

d Bahan
iii

Escherichia coli DH5 (kompeten)

iv

Larutan 0.1 M CaCl2 dingin

Plasmid/DNA rekombinan hasil ligase

vi

Medium LB; LA; LA + Ap (10g/ml)

vii

Larutan garam fisiologis

viii

dH2O steril

V.

Prosedur kerja
1

Ke dalam dua tabung mikro steril masukkan masing-masing 100 l 0,1 M CaCl 2
steril. Pada salah satu tabung (tabung K = kontrol) masukkan 20 l dH 2O steril,
sedangkan pada tabung yang lain (tabung S = sampel), masukkan20 l larutan
100-500 ng pUC19. Kemudian tambahkan 200 l sel kompeten DH5

Letakkan pada 0OC (di atas es) selama 90 menit dengan kadang-kadang digoyang
dengan ujung jari telunjuk. Siapkan penangas 42OC

Campuran transforman diinkubasi pada 42OC selama 60 detik, kemudian langsung

disimpan di es selama 2 menit. Sementara itu, disiapkan shaker pada 37OC untuk
tabung reaksi

Masukkan masing-masing campuran transformasi pada tabung reaksi steril secara

aseptis lalu tambahkan 1 ml LB pada tiap tabung. Inkubasikan dengan goyangan
kuat, 37OC selama 90 menit

Pada LA + Ap (10 g/ml) sebarkan secara aseptis 50 l suspensi dari tabung A

dan masing-masing 50 dan 100 l suspensi dari tabung B, masing-masing 2-3
cawan, kemudian sentrifugasi secara singkat dan sebar lagi bagian pelet
(supernatan dibuang, kelebihan sedikit bagian supernatan digunakan untuk
meresuspensi pelet sel). Hasil transformasi disebar menggunakan beads steril

VI.

-6

-7
dan 10

Pada LA, sebarkan 100 l suspensi tabung B dengan pengenceran 10

O
Inkubasikan semua kultur di cawan pada 37 C selama satu malam (18-24 jam)

Alur Kerja

Pembuatan sampel
dan kontrol dalam
tabung mikro steril

Peletakan pada suhu

0oC, persiapan untuk
Heat Shock

Heat shock untuk

sampel pada suhu
42oC (60 detik)
kemudian pada es (2
menit)

Pada LA+ Ap (10

g/ml) sebarkan 50
l suspensi tabung A
& masing-masing 50
& 100 l suspensi
tabung B (masingmasing 2-3 cawan)

Inkubasi keduanya
dengan goyangan
kuat (>100rpm)
pada suhu 37 oC
selama 90menit

Pindahkan sampel
dan kontrol ke
tabung reaksi steril,
masing-masing
ditambah 1 ml LB

Sentrifugasi dan
sebar bagian pelet
(supernatan
dibuang, kelebihan
supernatan dipakai
untuk meresuspensi
pelet sel).

Hasil transformasi
disebar
menggunakan beads
steril
Pada LA, sebarkan
100 l suspensi
tabung B dengan
pengenceran 10 -6
dan 10-7

Inkubasikan semua
kultur di cawan
pada 37OC selama
satu malam (18-24
jam)

VII.

Pembahasan
Pada praktikum transformasi kali ini, digunakan bakteri Escherichia coli yang sudah

dibuat terlebih dahulu menjadi sel kompeten E.coli DH5 agar E.coli dapat mengambil DNA
dari lingkungannya. Pemilihan bakteri E.coli dikarenakan bakteri ini dapat ditemukan dalam
bentuk flora normal dalam tubuh dan dapat membelah dengan cepat sehingga sel rekombinan
yang dihasilkan akan lebih banyak dalam waktu yang singkat.Sementara itu, pembuatan sel
kompeten dilakukan karena pada kondisi normal, dinding sel bakteri akan melindungi sel dari
masuknya benda-benda asing termasuk juga DNA, sehingga DNA rekombinan yang telah
dimurnikan tidak dapat diintroduksikan ke dalam sel inang.
Pembuatan sel kompeten dapat dilakukan dengan menggunakan larutan CaCl2 dan
metode heat shock (dikejutpanaskan). Fungsi penambahan larutan CaCl2 adalah megganggu
keseimbangan kalsium dalam membran sel inang dengan adanya kation divalent Ca2+, dan
membantu terbukanya protein integral membran sebagai kanal ion karena adanya perbedaan
muatan. Membran akan dinetralkan dan plasmid DNA yang bersifat negatif akan dapat masuk
dan diintroduksikan. Proses selanjutnya yaitu dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42C
selama 60 detik dengan maksud membuat membran sel tertutup kembali karena terjadi

perubahan suhu yang mendadak (secara extreme) dari suhu rendah ke suhu tinggi. Proses ini
dilakukan pada suhu 42C karena suhu tidak terlalu tinggi sehingga bakteri masih tetap dapat
bertahan hidup dan DNA tidak rusak. Waktu yang dibutuhkan juga hanya beberapa detik,
karena apabila terlalu lama dikhawatirkan ada kemungkinan plasmid yang telah masuk dapat
keluar kembali. Sampel dan kontrol kemudian diinkubasikan pada suhu 37C (sesuai suhu
tubuh) karena suhu tersebut merupakan suhu optimal pertumbuhan bakteri E.coli.
Pada percobaan ini, dilakukan transformasi plasmid pUC19 yang memiliki 2 klaster
besar, yaitu resisten ampisilin dan lacZ pada E. coli. Untuk menguji apakah transformasi
yang dilakukan berhasil atau tidak, maka bakteri sampel dan kontrol diinokulasikan dalam
media agar yang berisi ampisilin (10 g/mL). Jika transformasi yang dilakukan berhasil
dengan baik, maka E. coli rekombinan hasil transformasi tersebut akan mengekspresikan gen
resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisilin,
yang ditunjukkan dengan adanya koloni tunggal bakteri (bulatan-bulatan kuning) yang
tumbuh pada cawan petri seperti pada Gambar 1.
Pada praktikum kali ini, praktikan belum dapat melihat hasil yang diperloeh
dikarenakan keterbatasan waktu dan cawan yang berisi hasil transformsi perlu diinkubasi
pada suhu 37C selama satu malam (18-24 jam).

:
Gambar 1. Sel kompeten pUC19 (kiri) dan E.coli Rekombinan Hasil Transformasi (kanan)

VIII. Daftar Pustaka

1. Campbell et all. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta : Erlangga
7. Cowell IA, Austin CA. 1997. cDNA Library Protocols : Preparation of
Competent Cells for High-Efficiency Plasmid Transformation of Escherichia coli
Vol 69. Humana Pr.
8. Malik, Amarila. 2016. Protokol Kerja Bioteknologi. Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Farmasi. Depok : Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.
9. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda
dan USESE Foundation, Bogor. 123 halaman.
10. Russel PJ. 1992. Genetics Third Edition. New York(NY): Harper Collins
Publisher.
11. Suharsono et all. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi
H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma

malabathricum L. Institut

Pertanian Bogor. Vol 1 : 67-74. J Agron. Bogor, Indonesia.

12. Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of
Biomedical Science. 9:246-252.

III. ELEKTROFORESIS POLIAKRILAMIDA SDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulphate-Polycrylamine Gel Electrophoresis)
I. Pendahuluan

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan

kemampuannya untuk bermigrasi di dalam medium konduksi dan akan memberikan
respons setelah diberikan medan listrik (Harvey, 2000). Pada saat arus listrik diberikan,
molekul bermigrasi melalui media (biasanya berupa gel), molekul yang lebih kecil akan
bermigrasi lebih cepat daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan.
Elektroforesis SDS-PAGE merupakan elektroforesis yang menggunakan gel buatan
sebagai medium. Gel buatan ini dibentuk dari polimerisasi akrilamida, bis akrilamida,
ammonium persulfat, dan TEMED (N,N,N,N tetrametilendiamin) sehingga terbentuk
ikatan silang yang membentuk gel kaku (Girindra, 1993). Pemilihan penggunaan
poliakrilamida didasarkan pada poliakrilamida tidak bereaksi dengan sampel dan tidak
membentuk matriks dengan sampel sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang
memungkinkan pemisahan protein secara sempurna. Akrilamida merupakan senyawa
karsinogenik. Ammonium persulfate berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan
akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida lainnya membentuk polimer yang
panjang . Sedangkan, SDS (Sodium Lauril Sulfat) adalah suatu surfaktan anionik, yang
apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negative. SDS digunakan untuk
mendenaturasi protein, TEMED digunakan sebagai katalisator reaksi polimerisasi
akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein
dan APS 10% digunakan untuk pembentuk gel.

II. Prinsip
Pemisahan protein atau DNA berdasarkan proses migrasi molekul bermuatan di dalam
suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada
muatan, ukuran, dan bentuk dari setiap molekul yang terlibat.

III.

Tujuan
untuk memisahkan protein dengan cara elektroforesis menggunakan gel poliakrilamida
secara discontinuous, selain itu menggunakan pula sodium dodecyl sulphate (SDS) untuk
mendenaturasi protein.

Komposisi Gel

Stacking gel berfungsi untuk menggumpalkan protein yang telah diload menjadi pita atau
band yang tajam sebelum gel terpisah pada resolving gel.
Resolving gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarka ukuran molekul dan
komposisi resolving gel biasanya diubah saat dilakukan optimasi gel untuk pemisahan
gel.
IV.

Alat dan Bahan

1.1 Stacking Gel
Komposisi
Volume
ddH2O
3,05 ml
4X 0,5 M TrisHCl pH 6,8
1,25 ml
Akrilamid 30%
0,67 ml
APS 10%
25 l
TEMED
5 l
*Volume yang digunakan bisa berbeda-beda, namun bahan penyusun gel tetap sama
1.2 Resolving Gel
Komposisi menggunakan 10%
Volume
ddH2O
4,15 ml
4X 0,5 M TrisHCl pH 8,8
2,5 ml
Akrilamid 30%
3,3 ml
APS 10%
50 l
TEMED
5 l
*Volume yang digunakan bisa berbeda-beda, namun bahan penyusun gel tetap sama
1.3 Larutan Akrilamid 30%
30 gram acrylamide: bis-acrylamide (29:1)
Dilarutkan dalam 100 ml aquabidest
Simpan di dalam botol coklat/tempat gelap pada suhu 4C
1.4 1,5 M Tris-HCl (4X) pH 8,8
18,17 gram Tris base
4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 8,8 dengan HCl
Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest
Simpan pada suhu 4C
1.5 0,5 M Tris-HCl (4x) pH 6,8
6,06 gram Tris base
4,0 ml 10% SDS, atur pH hingga 6,8 dengan HCl
Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest
Simpan pada suhu 4C
1.6 4x Reservoir Buffer Tris-Glisin

12 gram Tris base

57,6 gram Glycine
Dilarutkan dalam 100 ml Aquabidest
Simpan pada suhu 4C
1.7 5x Sample Buffer
3,9 ml Aquabidest
1,0 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
0,8 ml Glycerol
1,6 ml 10% SDS
0,4 ml 2-mercaptoethanol
0,4 ml 1% bromophenolblue
Disimpan dalam freezer
1.8 10% SDS
50 gram SDS ad dengan aquabidest hingga 500 ml, aduk hingga homogen.
Simpan pada suhu ruangan dan selalu dibuat fresh.
1.9 10% APS
Larutkan 0,1 ml APS dalam 1 ml aquabidest, dibuat fresh setiap pemakaian.
1.10 Running buffer
370 ml Aquabidest
125ml (4X) reservoir buffer
5 ml 10% SDS
Campurkan semua bahan ke dalam beaker glass
Aduk homogen
Simpan pada suhu 4C
1.11 Staining/Destaining Solution
400 ml Methanol
100 ml Asamasetatglasial
500ml Aquabidest
1 gram Coomassie Brilliant Blue (untuk staining solution)
V. Prosedur kerja
1. Persiapan Gel
Untuk pembuatan atau perisapan gel mula-mula bersihkan plat kaca dengan akuades dan
etanol (70%). Hal ini ditujukan untuk membersihkan kaca dari kontaminasi. Selanjutnya,

plat kaca disusun, dan dipasangkan spacer (penjepit kaca). Untuk menyiapkan gel
poliakrilimide-SDS 10%, ikutilah tabel di bawah ini. Resolving gel disiapkan terlebih
dahulu.
Tabel 1. Komposisi bahan resolving gel dan stacking gel.
Bahan
ddH2O

Resolving gel
4,15 mL

Stacking gel
3,05 mL

4x 1,5 M Tris HCl

2,5 mL

------

pH 8,8
4x 0,5 M Tris HCl

-----

1,25 mL

pH 6,8
Akrilamida

3,3 mL

0,67 mL

Solutio 30%
APS 10%
TEMED

50 L
5 L

25 L
5 L

Kemudian, campuran resolving gel dituangkan ke dalam ruang antara lempeng kaca,
Sisakan kira-kira 2,5 cm dari tepi atas lempeng kaca untuk gel penumpuk. Tambahkan
isopropanol untuk menyingkirkan udara pada bagian atas gel serta meratakan bagian sel
yang terletak di bawah dan agar batas antar gel dapat terbentuk dengan baik. Biarkan
resolving gel berpolimerisasi selama kurang lebih 30 menit. Setelah resolving gel
berpolimerisasi, tuangkan campuran stacking gel yang sudah dipersiapkan sebelumnya
ke atas resoving gel yang telah berpolimerisasi. Sisir plastik (pembentuk sumur sampel)
disisipkan dan dibiarkan hingga gel membeku. Setelah stacking gel berpolimerisasi,
lepaskan sisir dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah. Lempeng kaca yang
berisi gel diletakkan secara vertikal pada alat elektroforesis. Tempat dapar diisi dengan
dapar elektroda. Gelembung udara pada bagian bawah gel dapat disingkirkan dengan
penambahan isopropanol.

2. Persiapan Sampel
a

Sampel protein didenaturasi dengan menambahkan sampel buffer, lalu dipanaskan

dengan menggunakan thermoblock, pada suhu 85C selama 5 menit.

3. Elektroforesis

Setelah protein marker (5-8 l) dan sampel (10-15 l) dimasukkan ke dalam sumuran
(well), alat elektroforesis di set (semakin kecil arus, pemisahan akan semakin baik,
namun waktu akan semakin lama). Untuk running 1 gel biasanya diperlukan waktu 120
menit dan 180 menit untuk 2 gel.

Elektroforesis dihentikan ketika semua sampel dan protein maker mencapai dasar
resolving gel.

4. Staining Gel
a

Gel hasil elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran protein serta menganalisa
bentuk pita proteinnya.

Gel yang telah selesai dielektroforesis difiksasi dengan merendam gel hasil elektroforesis
di dalam larutan fiksasi (10% asam asetat; 25% isopropanol; 65% aquadest) selama 15
menit. Larutan fiksasi kemudian dibuang lalu potongan gel ini direndam didalam larutan
staining Coomasie Brilliant Blue.

Setelah gel direndam, wadah yang berisi gel kemudian digoyangkan perlahan dan
dibiarkan selama satu malam dalam temperature kamar.

5. Destaining Gel
a

Gel kemudian dibilas beberapa kali dengan menggunakan aquadest steril atau direndam
dalam wadah plastic berisi aquadest. Gel kemudian disimpan didalam wadah plastic
dalam keadaan terendam oleh air. Hasil staining tersebut kemudian dibandingkan dengan
penanda protein untuk mengetahui perkiraan ukuran protein yang berhasil diperoleh.

VI.

Alur Kerja

Persiapan
Gel

VII.

Persiapan
Sampel

Staining
Gel

Elektrofore
sis

Destaining
Gel

Pembahasan
Pada praktikum kali ini tidak ada hasil percobaan karena tidak semua langkah kerja
dilakukan akibat terbatasnya waktu praktikum.
SDS merupakan teknik detergent anionic yang dapat melarutkan molekul
hidrofobik yang memberikan muatan negative pada struktur protein. Cara kerja SDS
PAGE adalah dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.
SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) pada percobaan ini digunakan untuk mendenaturasi
protein.
Sejumlah SDS dapat mengikat suatu rantai polipeptida sesuai dengan ukuran
molekul. Bila ditempatkan pada suatu medan listrik, muatan negatif SDS dapat
menghancurkan sebagian struktur kompleks protein dan secara kuat tertarik kearah anoda
(positively-charged electrode).
Stacking gel digunakan untuk mengumpulkan protein yang telah diload menjadi
pita atau band yang tajam sebelum gel terpisah pada resolving gel yang berfungsi sebagai
gel pemisah yang memisahkan protein berdasarkan ukuran molekul

VIII. Daftar Pustaka

Davidson. 2001. SDS PAGE.

http://www.bio.davidson.edu/COURSES/GENOMICS/method/SDSPAGE/SDSPAGE.ht

ml. Diakses tanggal 19 Maret 2016.

D.J Harvey, D.R Wing, B Kster, I.B.H Wilson, Composition of N-linked carbohydrates
from ovalbumin and co-purified glycoproteins, Journal of the American Society for Mass
Spectrometry, Volume 11, Issue 6, June 2000, Pages 564-571, ISSN 1044-0305,
http://dx.doi.org/10.1016/S1044-0305(00)00122-7.
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044030500001227)

Malik, Amarila. (2015). Penuntun Kerja : PCR, Purifikasi PCR, dan SDS-PAGE. Depok:
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Farmasi UI.

How

To

Strain

an

SDS-PAGE

gel

https://www.youtube.com/watch?v=b-

1dXzU4iOw&spfreload=10 diakses tanggal 19 maret 2016.