PROGRAMA DE INGENIERA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE INGENIERA
UNIVERSIDAD DE CALDAS

GUAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Mara Marcela Martnez Miranda
Bacteriloga y laboratorista clnico
M.Sc. Microbiologa

2016-1

[CARRERA

35 # 60160 SEDE SANCANCIO BLOQUE B PISO 4TEL.:8781587

ndice
INTRODUCCIN
Prctica 1. Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento microbiano.
Prctica 2. Preparacin de muestras y recuento de aerobios de mesfilos por la tcnica de
recuento en placa.
Prctica 3. Enumeracin de coliformes y E. coli por la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP).
Prctica 4. Recuento de mohos y levaduras.
Prctica 5. Anlisis de microbiolgico de ambientes y superficies en la industria alimentaria.
Prctica 6. Anlisis microbiolgico del agua mediante la tcnica de filtracin por membrana
(FPM).
Prctica 7. Deteccin de Salmonella spp.
Prctica 8. Deteccin de Listeria monocytogenes.
Prctica 9. Determinacin de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) en agua.
Prctica 10. Recuento e identificacin de Staphylococcus coagulasa positivo.
Prctica 11. Recuento e identificacin de Bacillus cereus.
Prctica 12. Evaluacin de esterilidad comercial de conservas.
TEMPORALIZACIN

Introduccin
Los alimentos, al igual que el agua, no son productos estriles cuya carga microbiana vara de
acuerdo del tipo de alimento, su origen, procesamiento, conservacin y manejo.
La calidad microbiolgica de los productos alimentarios hace referencia a dos aspectos
fundamentales: la calidad higinico-sanitaria y la calidad comercial. La primera tiene una gran
importancia debido a que su ausencia conlleva un considerable riesgo para la salud del
consumidor, ya que los alimentos pueden ser vehculos de microorganismos patgenos.
Respecto a la segunda, cabe sealar que hay microorganismos que aunque carezcan de
significado sanitario, pueden ser causa de deterioro del alimento, modificando su color,
aroma, sabor, consistencia o aspecto de forma tal que sea rechazado por el consumidor.
El anlisis microbiolgico de alimentos est destinado a la bsqueda de agentes patgenos o
de microorganismos indicadores de una contaminacin no admisible, de modo que se asegure
la calidad higinico-sanitaria y comercial de los mismos. Aunque los microorganismos ms
importantes en cuanto a la salud pblica son aquellos que desarrollan enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA), tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, etc., existe un grupo de microorganismos de especial utilidad en la industria
alimentaria, que son los llamados "indicadores". Estos microorganismos no son
necesariamente patgenos y su presencia se relaciona con la existencia de contaminacin,
avisando de la posible existencia de patgenos y otros microorganismos que pueden alterar el
producto. Estos microorganismos "indicadores" se analizan de forma rutinaria, y de hecho, en
la legislacin se considera su anlisis como un parmetro de calidad microbiolgica.
El propsito de la presente gua de laboratorio es dar a conocer a los estudiantes de Ingeniera
de Alimentos de la Universidad de Caldas los diferentes procedimientos para el anlisis
microbiolgico de alimentos, de la aplicacin de Buenas Prcticas de Laboratorio, toma de
muestras, diluciones, hasta la fase analtica de los mismos, recuento, lectura, interpretacin y
presentacin de los resultados.

Prctica 1. Efecto de los factores fsicos sobre el

crecimiento microbiano
I.

INTRODUCCIN

La capacidad de los microorganismos para crecer en un alimento est determinada por el

ambiente interno del alimento y por el ambiente en el cual el alimento se encuentra
almacenado, designados como factores intrnsecos y extrnsecos, respectivamente. Los
factores intrnsecos del alimento que influyen en el crecimiento microbiano son los nutrientes,
la actividad de agua (Aw), el pH, el potencial de xido reduccin (redox), los factores de
crecimiento y los inhibidores (o antimicrobianos). Por otra parte, los factores extrnsecos son la
temperatura, la humedad relativa y el ambiente gaseoso.
El conocimiento de la influencia de estos factores permite explicar el crecimiento y distribucin
de los microorganismos en los alimentos y la forma en que dichos factores se pueden usar
para el control de microorganismos alterantes que dan lugar a prdidas econmicas en la
industria alimentaria y patgenos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos.
El objetivo de esta prctica es determinar cmo influyen los factores fsicos sobre el
crecimiento microbiano de algunos microorganismos in vitro.
II.

INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
Cultivos bacterianos y de levadura en caldo BHI pre-incubados durante 24-48 horas:

Pseudomonas aeruginosa

Bacillus cereus

Escherichia coli

Salmonella

Staphylococcus aureus

Saccharomyces cerevisiae

Materiales

Tubos de agar Tripticasa Soya (TSA) inclinado (15 tubos) x triplicado.

Dos series de tubos con caldo BHI + NaCl a cinco concentraciones diferentes: 0.85%,
3.5%, 7%, 10% y 15% (10 tubos en total) x triplicado.

Dos series de tubos con caldo BHI + Sacarosa a cuatro concentraciones diferentes: 3%,
7.5%, 15% y 30% (8 tubos en total) x triplicado.

Dos series de tubos con caldo BHI a cuatro pH diferentes: 3.0, 5.0, 7.0 y 9.0 (8 tubos en
total) x triplicado.

Placas de agar TSA (2 placas) x triplicado.

Asas bacteriolgicas.

Pipetas de 1 ml.

Gradillas.

Marcador Sharpie.

Cronmetro.

Equipos

Nevera.

Incubadora a 37C.

Incubadora a 28C.

Bao Mara a 60C.

III. PROCEDIMIENTO
1. Determinacin de la temperatura ptima de crecimiento

Tomar una asada de cada uno de los cultivos bacterianos pre- incubados en caldo BHI:
E. coli, P. aeruginosa, B. cereus, Salmonella y S. aureus.

Sembrar tres lotes de tubos de agar TSA inclinado con cada uno de los cultivos
bacterianos pre-incubados en caldo BHI.

Incubar el primer lote a temperatura de refrigeracin durante 24 horas.

Incubar el segundo lote de las mismas bacterias a temperatura ambiente durante 24

horas.

Incubar el tercer lote de bacterias en una incubadora a 37C durante 24 horas.

Registrar los resultados del crecimiento bacteriano en cruces. (+): crecimiento mnimo,
(++): crecimiento regular y (+++): crecimiento mximo.

Determinar la temperatura de crecimiento ptima para cada bacteria, que ser donde
se observe el mejor crecimiento.

2. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias

En este experimento se determinar a) el punto de muerte trmica (PMT) y b) el tiempo de
destruccin trmica (TDT):

Con un marcador divida el reverso de una placa de agar TSA en cinco partes.

A partir de un cultivo de E. coli en caldo BHI de 24 horas de incubacin, sembrar por

estra una divisin de la placa de agar TSA. Marcar el reverso con una clave.

Colocar el tubo del cultivo bacteriano en un bao Mara a 60C.

Tomar una asada a intervalos de 10 minutos y sembrar cada vez en una de los sectores
de la placa de agar TSA hasta completar los 40 minutos.

Incubar a 37C durante 24 horas.

Determinar el punto trmico mortal de E. coli.

Otro grupo de estudiantes debe trabajar igualmente con la bacteria esporulada B. cereus
para determinar su tiempo trmico mortal.
3. Influencia de la presin osmtica

Preparar dos series de cinco tubos de caldo BHI adicionado con NaCl en diferentes
concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7%, 10% y 15% y un control sin NaCl.

Preparar dos series de cuatro tubos de caldo BHI adicionado con sacarosa en diferentes
concentraciones, al 3%, 7.5%, 15% y 30% y un control sin sacarosa.

Inocular una serie de tubos con 0.1 ml por tubo de E. coli y otra serie con S. aureus.
Homogenice cada tubo.

Incubar a 37C por 24 horas.

Registrar el grado de turbidez de los tubos inoculados en cruces (+).

4. Influencia del pH

Preparar dos series de tubos con caldo BHI y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0).

Inocule una serie con 0.1 ml de E. coli y otra serie con la levadura S. cerevisiae.

Incubar la bacteria a 37C y la levadura 28C.

Registrar el grado de turbidez de los tubos inoculados en cruces (+).

IV. CUESTIONARIO
1. Defina el punto de muerte trmica (PMT) y el tiempo de destruccin trmica (TDT)
2. Cmo se define el tiempo de reduccin decimal?
3. En una curva de la tasa de crecimiento de un microorganismo en funcin de la
temperatura, se distinguen tres puntos importantes conocidos como temperaturas
cardinales, a qu se refieren estas temperaturas?
4. Qu factores influyen en la termorresistencia de los microorganismos? Explique cada
uno de ellos.
V. BIBLIOGRAFA
ALARCN, LR.; OLIVAS, E. Manual de prcticas de Microbiologa bsica y Microbiologa de
alimentos. Universidad Autnoma de Ciudad de Jurez (UACJ). 2001
JAY, J. Microbiologa Moderna de los Alimentos. 3 edicin. Zaragoza: Editorial Acribia, 1994.
PRADO, A.; RODRIGUEZ, S.; FIGUEROA, I.; SHIRAI, K. Manual de prcticas de laboratorio.
Microbiologa de Alimentos. Universidad Autnoma Metropolitana. 2013
RAY, B. Fundametal Food Microbiology. 3 edition. CRC Press Editorial. 2004.

Prctica 2. Preparacin de muestras y recuento de aerobios

mesfilos por la tcnica de recuento en placa
I.

INTRODUCCIN

La operacin de preparacin de muestras para el anlisis microbiolgico exige unas reglas de

manipulacin asptica muy estrictas, as como la utilizacin de material y diluyentes estriles,
para evitar la contaminacin exterior del alimento.
La mayora de los alimentos no son estriles sino que contienen una carga microbiana, que
vara ampliamente en nmero, dependiendo del alimento. Es por eso que al preparar el
alimento en el laboratorio se le realizan una serie de diluciones para su cuantificacin, ya que
si se siembran los alimentos sin diluir, presentarn un recuento tan alto que sera imposible
hacer el conteo.
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se
desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e
incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. El recuento en placa puede
referirse a distintos grupos de bacterias, segn sea la temperatura y la atmsfera de
incubacin:

Microorganismos mesfilos: crecen a temperaturas ptimas entre 25-40C.

Microorganismos psicrotrofos: Aunque su temperatura ptima de crecimiento se estima
entre 15 y 20C, se pueden multiplicar lentamente a temperaturas de refrigeracin (0 y
6C).
Microorganismos termodricos: Son capaces de sobrevivir el calentamiento de un
alimento a temperaturas de pasteurizacin (63 por 30 minutos), pero no crecen a altas
temperaturas.

El propsito de la presente prctica es capacitar al estudiante en la preparacin de las

muestras de alimentos y sus diluciones y dar a conocer el mtodo para el recuento en placa de
aerobios mesfilos.
II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS
Insumos

Muestras lquidas: Leche, bebida hidratante energtica, jugos, etc.

Muestras slidas: Queso, hamburguesa, lechuga, frutas, arepas, etc.

Reactivos y medios de cultivo

Agua peptonada 0,1%

Agar Plate Count (PCA) fundido

Alcohol etlico (70%).

Materiales (estriles)

Instrumentos para la preparacin de las muestras: tijeras, pinzas, cuchillos, cucharas,

esptulas, etc.

Placas de Petri vacas.

Vasos para licuadora.

Gasa estril.

Frascos con 90 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).

Pipetas de 1 y 10 ml.

Tubos con 9 ml de diluyente (agua peptonada 0,1%).

Mecheros de Bunsen.

Propiteadores.

Equipos

Balanza.

Licuadora.

Incubadora regulada a 35C

Cuenta colonias

III. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIN DE LA MUESTRA
1. Muestras slidas o semislidas

Pesar aspticamente 10 gr de la muestra a analizar en un recipiente homogenizador.

Adicionar 90 ml del diluyente (agua peptonada 0,1%).

Homogenizar la muestra con el diluyente en el recipiente homogenizador durante 1-2

minutos a 2000-3000 r.p.m hasta obtener una suspensin completa y homognea.

Filtrar la suspensin usando una gaza poco tupida para retener los restos
macroscpicos de la muestra.

2. Muestras lquidas no viscosas

Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un

tiempo de 7 segundos.

En condiciones aspticas, tomar 10 ml de la muestra y diluir con 90 ml del diluyente

(agua peptonada 0,1%) en un recipiente de tamao adecuado.

Homogenizar la suspensin manualmente durante 1-2 minutos.

3. Muestras slidas y semislidas congeladas

Descongelar en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 h. y no ms de 24 h antes de diluir y

analizar.

Proseguir como se indica en el numeral 1 para muestras slidas y semislidas no

congeladas.

B. PREPARACIN DE LAS DILUCIONES

La preparacin de diluciones decimales a partir de una muestra tiene por objeto efectuar
diluciones progresivas de dicha muestra, para poder realizar recuentos microbianos
posteriores.
1. La mezcla homogenizada en el apartado anterior se constituye en la suspensin madre y
primera dilucin de la serie (1:10).

2. A un tubo que contenga 9 ml del diluyente se transfiere 1 ml de la suspensin madre.

Mezclar durante 30 segundos en agitador excntrico. As se obtiene la segunda dilucin
(1:100). Desechar la pipeta usada.
3. De la mezcla anterior, y con una nueva pipeta estril, se incorpora 1 ml a otro tubo que
contenga 9 ml del diluyente. Mezclar durante 30 segundos en agitador excntrico. As se
obtiene la tercera dilucin (1:1000). Desechar la pipeta usada.
4. Repetir la operacin en varios tubos hasta lograr las diluciones deseadas. De esta manera
se obtiene la serie de diluciones decimales (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, etc.).
5. Los tubos de la serie se mantendrn en refrigeracin hasta el comienzo del anlisis, que no
debe exceder las dos horas.
C. SIEMBRA EN PLACA
1. Escoger dos diluciones consecutivas para la siembra de acuerdo al tipo de alimento
analizado.
2. A partir de las diluciones escogidas y por duplicado, depositar con pipeta estril 1 ml de
cada dilucin en las cajas de Petri, previamente marcadas as: # de grupo, fecha, hora, el
tipo de ensayo microbiolgico, medio de cultivo y tipo de muestra.
3. Aadir a cada caja de Petri unos 15 ml de agar PC fundido y atemperado a 45C.
4. Mezclar perfectamente medio e inculo sobre la mesa de trabajo, haciendo movimientos
circulares con la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj y en forma de cruz,
evitando al mismo tiempo que el medio impregne la tapa.
5. Dejar solidificar al agar de las placas sobre una superficie totalmente plana durante 10
minutos.
6. Cuando se haya solidificado completamente el agar, se invierten las placas y se incuban a
35C durante 24 - 48 h.
D. REGISTRO DE RESULTADOS
1. Transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias en aquellas placas que
muestren entre 10 y 300 colonias aisladas.
2. Marcar las colonias contadas con marcador Sharpie para evitar contarlas de nuevo.
3. Registrar los resultados en la siguiente tabla.
N colonias
Caja 1
Caja 2

Dilucin sembrada

Volumen sembrado

UFC/g

IV. CUESTIONARIO
1. Elabore una tabla con la composicin qumica de las sustancias usadas como diluyentes en
el laboratorio de microbiologa de alimentos.
2. En una tabla, mencione y describa cada uno de los homogeneizadores de muestras de
alimentos. Cul es el ms usado en el laboratorio de microbiologa de alimentos?

3. Haga una tabla en la que enumere 10 alimentos a los que se les hace recuento de aerobios
mesfilos, los lmites microbiolgicos permitidos y la norma que lo establece en Colombia.
4. Busque en la pgina del Manual de Bacteriologa Analtica de la FDA la gua para calcular y
reportar las UFC de aerobios mesfilos (Items C y D) y extraiga los ejemplos que se
encuentran
all.
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm
5. Haga una tabla comparativa entre tres mtodos normalizados diferentes para el recuento
de aerobios mesfilos, incluyendo diluyentes, medios de cultivo, condiciones de
incubacin, etc. (ISO, BAM-FDA, ICMSF, etc.).
V. BIBLIOGRAFA
ARMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y tcnicas microbiolgicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.
BOTERO A., Patricia y C., TIBADUIZA (2003). Instructivo para toma de muestras y anlisis de
productos alimenticios y bebidas en puertos. INVIMA. Bogot, D.F.
DPTO. HIGIENE Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS. Prcticas de Microbiologa y Anlisis
Microbiolgico de los Alimentos. rea de Conocimiento de Nutricin y Bromatologa. Facultad
de
Veterinaria.
Universidad
de
Len.
Disponible
en:
http://www3.unileon.es/personal/wwdhtmpm/guiones.pdf Fecha de consulta: 23 de febrero
de 2010.
JEFE DE LABORATORIO (1998). Instructivo de anlisis: Recuento Aerobios Mesfilos. Obtenido
el 01 de febrero de 2008 en http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf
LISANDRO SIGNORINI, M, SEQUEIRA, GJ, BONAZZA, JC, et al. (2008). Utilizacin de
microorganismos marcadores para la evaluacin de las condiciones higinico-sanitarias en la
produccin primaria de leche.. Rev. Cient. (Maracaibo), vol.18, no.2, p.207-217. ISSN 07982259.
MARZOCCHI ediciones. (2005). Extraccin, Toma de muestras para anlisis de productos
alimenticios (Toxinas). Disponible en: http://riie.com.ar/?a=22355 Fecha de consulta: 23 de
febrero de 2010.
NORMA TCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4092. REQUISITOS GENERALES Y DIRECTRICES
PARA ANLISIS MICROBIOLGICOS.
NORMA TCNICA COLOMBIANA. (2009). NTC 4519. METODO HORIZONTAL PARA EL
RECUENTO DE MICROORGANISMOS. TCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS A 30C.
ORTIZ, LM. (2003). Material didctico de Microbiologa de Alimentos: Recuento de
microorganismos aerobios mesfilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de
_microlimentos.htm
PASCUAL, MR y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
THATCHER, FS. (1995). Anlisis microbiolgico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.

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Prctica 3. Enumeracin de coliformes, coliformes fecales y

E. coli por la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP)
I.

INTRODUCCIN
Los coliformes son un grupo de bacterias de la familia Enterobacteriaceae que se
caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, en
un periodo de 48 horas y a una temperatura de incubacin entre 30-37 C. Del grupo
coliformes forman parte los gneros bacterianos Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y
Citrobacter. Estos microorganismos son ubicuos, se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza, el suelo, agua y tambin son carga normal del intestino del hombre y
animales de sangre caliente.
Dentro del grupo de los coliformes existe un subgrupo que es el de los coliformes fecales o
termotolerantes, que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a una
temperatura de 44,5C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden
principalmente la especie bacteriana Escherichia coli y algunas cepas de Klebsiella. El
verdadero ndice de contaminacin fecal es E. coli ya que su origen fecal es seguro.
Actualmente, los 3 grupos se utilizan como indicadores pero para diferentes aplicaciones.
La deteccin de coliformes se utiliza como un indicador de la calidad sanitaria de agua o
como un indicador general de condiciones sanitarias en el entorno de procesamiento de
alimentos. Los coliformes fecales siguen siendo el indicador de eleccin para la cra de
moluscos y mariscos en aguas de recoleccin y E. coli se utiliza para indicar la
contaminacin fecal reciente o procesamiento antihiginico (BAM-FDA, 2002).
El propsito de la presente prctica de laboratorio es proveer las herramientas necesarias
para que los estudiantes se capaciten en la tcnica de siembra por NMP para la
enumeracin de coliformes, coliformes fecales y E. coli.

II. INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos y reactivos

Muestras de alimentos slidos (queso, harina, leche en polvo, crnicos, etc.) o

alimentos lquidos (leche pasteurizada, jugos, gaseosas, etc.).
Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST).
Caldo lactosa bilis verde brillante (LBVB).
Caldo E.C.
Agar EMB (eosina azul de metileno).
Agua de triptona (Tryptone Water: TW).
Reactivo de Kovacs.

Materiales

Tubos de ensayo con 9 ml de APT 0,1%.

Tubos de ensayo con los diferentes caldos de cultivo.
Frascos con 90 ml de APT 0,1%.
Gradillas.
Pipetas estriles de 10 y 1ml.

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Cajas de Petri con agar EMB.

Asas bacteriolgicas.
Pipetas Pasteur.
Vasos para licuadora.
Propiteadores.
Utensilios para preparacin de muestras.

Equipos

Estufa de cultivo regulada a 35C.

Bao Mara regulado a 44,5C.
Licuadora.
Balanza.

III. PROCEDIMIENTO
Preparacin de muestra y diluciones
1. Pesar o medir aspticamente 10 g/10 ml de la muestra y homogenizar con 90 ml de APT
0,1%.
2. Realizar 2 diluciones decimales seriadas de 10-2 y 10-3 a partir de la dilucin inicial
transfiriendo 1 ml a tubos con 9 ml de APT 0,1%.
Prueba Presuntiva
1. Preparar en una gradilla tres series de tres tubos cada una con 10 ml de caldo LST y
campana Durham.
2. Sembrar 1ml de cada una de las diluciones preparadas a cada uno de los tres tubos de
cada serie:
A tres tubos de la primera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:10.
A tres tubos de la segunda serie se adiciona 1ml de dilucin 1:100.
A tres tubos de la tercera serie se adiciona 1ml de dilucin 1:1000.
3. Incubar a 35C haciendo lecturas a las 24 y 48 horas.
Lectura e interpretacin de la prueba presuntiva:
Observacin de la generacin de gas depositado en la campana Durham (al menos en 1/10
parte de su volumen) y de la aparicin de turbidez y coloracin amarilla en el medio de cultivo
como consecuencia de la fermentacin de la lactosa. Seleccionar los tubos positivos (turbidez +
gas) y desechar los dems.
Prueba confirmativa
1. Sembrar con asa bacteriolgica una muestra de los tubos positivos en LST (turbidez y gas)
en tubos con caldo LBVB y caldo EC y campana Durham.
2. Incubar los tubos con LBVB a 35C durante 18-24 horas para confirmacin de coliformes
totales.
3. Incubar los tubos con caldo EC a 44,5C durante 18-24 h para coliformes fecales.
Lectura e interpretacin de la prueba confirmativa
- Coliformes totales: La reaccin es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo LBVB.
- Coliformes fecales: La reaccin es positiva cuando se produce crecimiento (turbidez en el
tubo) y desprendimiento de gas en la campana Durham en los tubos con caldo E.C.
- Determinar NMP de coliformes fecales.

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Todos los tubos de caldo E.C. confirmados como positivos (turbidez + gas) de organismos
coliformes fecales en cada dilucin se utilizan para el aislamiento de E. coli en agar EMB y
comprobacin bioqumica de la produccin de indol.

Confirmacin de E. coli
Para la investigacin y recuento de E. coli se parte de los tubos confirmados como positivos
(crecimiento y formacin de gas a 44,5 C) para coliformes fecales en el medio E.C., de acuerdo
con los siguientes pasos.
1. Sembrar por estra con asa bacteriolgica los tubos positivos en agar EMB.
2. Incubar a 35C durante 24-48 horas.
3. La aparicin de colonias con brillo verde metlico o negras confirma la presencia de
coliformes.
4. Anotar el nmero de tubos confirmados en cada serie y recurrir a la tabla del NMP donde
se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.
Resultados:
Dilucin 10-1

Dilucin 10-2

Dilucin 10-3

N tubos positivos
(coliformes)
N tubos confirmados
(coliformes)
N tubos positivos
(coliformes fecales)
NMP coliformes/g:
NMP coliformes fecales/g:
5. Para investigar la produccin de indol se siembran 1-2 colonias de cada placa en tubos con
agua de triptona (TW).
6. Incubar en bao Mara a 44,5 C durante 24 horas.
7. Pasado este tiempo se incorporan 0,2 ml del reactivo de Kovacs a cada tubo. La reaccin
positiva se manifiesta por la formacin de un anillo rojo en la superficie del medio; la
reaccin negativa muestra anillo amarillento. E. coli al desaminar e hidrolizar el triptfano
del medio, produce indol que se pone de manifiesto al aadir el reactivo de Kovacs.
8. Cuando coincide crecimiento positivo (gas) en caldo BGBL a 44,5C, crecimiento
caracterstico sobre agar y EMB produccin de indol, se hace la lectura en la tabla del NMP
para obtener el nmero de E. coli por gramo o mililitro de muestra.
VI. CUESTRIONARIO
1. Consulte la composicin, empleo e interpretacin de cada uno de los medios usados en
esta prctica para la enumeracin de coliformes y E. coli (Elabore una tabla).
2. Consulte e imprima las tablas de NMP cuando se utilizan tres y cinco series de tubos para
cada ensayo, respectivamente.
3. Qu condiciones de proceso puede causar alto recuento de coliformes y E. coli en la
industria alimentaria?
4. Haga un diagrama de flujo para describir el procedimiento de recuento el placa de
coliformes y coliformes fecales, especificando diluyente, medio de cultivo, tiempo y
temperatura de incubacin, etc.

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5. Elabore una tabla donde enumere 10 alimentos a los cuales se le deba hacer la
enumeracin de coliformes, sus lmites microbiolgicos y la normativa que lo establece en
Colombia.
6. Consulte el mtodo de deteccin de E. coli O157:H7 en la NTC 4899 y haga un diagrama de
flujo del procedimiento A, B y C.
VII. BIBLIOGRAFA
ARAMBULA, AL y MURCIA, GM. (1987). Fundamentos y tcnicas microbiolgicas de alimentos.
Santander: Universidad Industrial de Santander.
BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL (2002). Enumeration of Escherichia coli and the
Coliform
Bacteria.
Disponible
en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm064948.htm#conve
ntional
NORMA TCNICA COLOMBIANA (2009). NTC 4516. MTODO HORIZONTAL PARA LA
DETECCIN Y ENUMERACIN DE COLIFORMES TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE.
NORMA TCNICA COLOMBIANA (2001). NTC 4899. MTODO PARA LA DETECCIN DE
Escherichia coli O157.
PASCUAL, M.R y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
THATCHER, FS. (1995). Anlisis microbiolgico de los alimentos. Zaragoza. Acribia, 271 p.

14

Prctica 4. Recuento de mohos y levaduras

I.

INTRODUCCIN

Los mohos y levaduras crecen con mayor rapidez que las bacterias en los alimentos cidos y
con baja actividad de agua, generando por ello importantes prdidas econmicas en la
industria de frutas frescas, jugos, vegetales, quesos, cereales, alimentos salazonados y
encurtidos, as como en alimentos congelados y deshidratados, cuyo almacenamiento se
realiza en condiciones inadecuadas. Adems, existe el peligro potencial de produccin de
micotoxinas por parte de algunos gneros de mohos.
Para conocer la calidad microbiolgica de este tipo de productos, se debe evaluar su tasa de
contaminacin por mohos y levaduras usando los mismos mtodos de recuento usados para
las bacterias (recuento en placa), pero por siembra en superficie. Los mohos y levaduras se
desarrollan en condiciones de aerobiosis, en medios de cultivo que favorezcan su desarrollo, a
temperaturas que varan entre 20 y 25C. Para el recuento de mohos y levaduras se utilizan
medios cidos (pH 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azcar y que adems
contienen antibiticos de amplio espectro para inhibir el crecimiento bacteriano.
El propsito de esta prctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las bases
metodolgicas para que sean capaces de hacer el recuento de mohos y levaduras en alimentos
por el mtodo de recuento en placa por siembra en superficie y la interpretacin de los
resultados obtenidos en dicho recuento.
II.

MATERIALES

Reactivos e insumos
Muestras de alimentos slidos (queso, carne, arepa, huevo, frutas, cereales, etc.) o
alimentos lquidos (jugo, yogur, leche, salpicn de frutas, etc.).
Agar YGC (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar).
Diluyente: Agua peptonada tamponada 0,1% (APT).
Alcohol al 70%.

Materiales
Pipetas de 1 y 10 ml.
Tubos de ensayo con 9 ml de APT.
Erlenmeyer con 90 ml de APT.
Cajas de Petri con agar YGC.
Jarra para licuadora.
Utensilios para preparacin de la muestra.
Asa de Drigalsky.

Equipos
Licuadora.
Incubadora regulada a 25C.
Balanza.

III.

PROCEDIMIENTO

A. Preparacin de la serie de diluciones

15

1. Suspender 10 g de la muestra en 90 ml de APT para preparar la dilucin inicial (1:10).

2. Partiendo de esta dilucin, se realizan las diluciones decimales seriadas (1:100, 1:1000,
1:10.000, etc.), en tubos con 9 ml de APT.
B. Siembra en superficie
3. Partiendo de la serie de diluciones decimales, seleccionar dos diluciones consecutivas y,
por duplicado, transferir 0,1 ml de cada una de las diluciones a placas con agar YGC,
previamente marcadas.
4. Diseminar el inoculo por toda la superficie del agar, sin romperlo, con ayuda del asa de
Drigalsky.
5. Dejar que el inoculo sea absorbido y colocar todas las placas sin invertir en estufa regulada
a 25C, por un periodo de incubacin de 5 das.
6. Trascurrida la incubacin, hacer el recuento de colonias de mohos y levaduras y calcular el
nmero de UFC por gr/ml del producto analizado.
IV.

CUESTIONARIO

1. Cul es la importancia de la determinacin de mohos y levaduras y qu informacin

brinda un alto recuento de este indicador en productos alimenticios?
2. Haga una tabla con la composicin y el fundamento de los medios de cultivo que se
pueden usar para el recuento de mohos y levaduras incluyendo el YGC que ser utilizado
en esta prctica de laboratorio.
3. Consulte por lo menos tres normas para el mtodo de recuento de mohos y levaduras y
haga un cuadro comparativo para establecer las diferencias en el procedimiento.
4. Enumere por lo menos 10 alimentos en los que se exige el recuento de mohos y levaduras
como indicador de calidad microbiolgica. Especifique los lmites permisibles de este
indicador para cada uno de los alimentos mencionados y cite la normativa.
5. Investigue qu son las micotoxinas, qu tipos de micotoxinas se han encontrado, qu
gneros de hongos las producen y en qu de alimentos se producen. (Haga una tabla
resumen).
6. Indique cules son las metodologas usadas para determinar que un alimento tiene
micotoxinas.
V.

BIBLIOGRAFA

LISANDRO SIGNORINI, M., SEQUEIRA, GJ., BONAZZA, JC. et al. (2008). Utilizacin de
microorganismos marcadores para la evaluacin de las condiciones higinico-sanitarias en la
produccin primaria de leche. Rev. Cient. (Maracaibo), Vol.18, No.2, p.207-217. ISSN 07982259.
PASCUAL, M.R y CALDERN, V. (1999). Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.

16

THATCHER, FS. y CLARK, DS., (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.

17

Prctica 5. Anlisis microbiolgico de ambientes y

superficies en la industria alimentaria
I. INTRODUCCION
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: aire, agua, superficie
de los objetos e incluso sobre nuestra piel. A pesar de que todava no existe un documento
legal en Colombia que exija el control microbiolgico de ambientes, superficies y
manipuladores del sector alimentario, cada vez ste es ms consciente de la importancia que
tiene verificar el plan de limpieza y desinfeccin ejecutado. El control microbiolgico de
ambientes, superficies y manipuladores es necesario para la evaluacin de las condiciones
higinicas de las reas de trabajo en la industria alimentaria, ya que de esto depender el
nmero y tipo de microorganismos presentes en los alimentos.
En una planta procesadora de alimentos, el manipulador de alimentos juega un papel
importante en la fabricacin de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente de
contaminacin. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, los
sitios de importancia donde residen los microorganismos saprfitos y que se constituyen en
una fuente de contaminacin son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe).
Los equipos, utensilios y superficies utilizados en el procesamiento, fabricacin, conservacin o
preparacin de alimentos, deben estar diseados, construidos, instalados y mantenidos de tal
forma que se evite la contaminacin de los alimentos y se facilite el proceso de limpieza y
desinfeccin de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiolgico del aire
(ambiente), ya que ste se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro
de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado.
El propsito de esta prctica de laboratorio es brindar a los estudiantes la capacitacin en los
procedimientos para toma de muestras y anlisis microbiolgicos de ambientes y superficies
que podran ser fuente de contaminacin de alimentos en la industria.
II. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Placas con agar Baird Parker (BP).

Placas con agar Plate Count (PC).
Placas con agar Yeast Extract Glucose Chloramphenicol (YGC).
Placas con agar Eosina Azul de Metileno (EMB).
Tubos de tapa a rosca que contengan 23 ml de agua peptonada tamponada (APT) al 0,1%.
Hisopos de algodn.
Baja lenguas.
Esponja.
Bolsa de plstico.
Rejilla delimitadora de rea.
Incubadora a 35C.
Incubadora a 25C.
Cuenta colonias.

III. PROCEDIMIENTO

18

En el siguiente cuadro se especifica los microorganismos indicadores de contaminacin que se

realizarn en ambientes, superficies y manipuladores:
Ambiente
Aerobios mesfilos
Mohos y levaduras

Superficies
Aerobios mesfilos
Enterobacterias

Manipuladores
Staphylococcus aureus
Enterobacterias

ANLISIS DE AMBIENTES
Tcnica de sedimentacin
1. Escoger una de las plantas de alimentos de la UTA para evaluar la carga microbiana de su
ambiente por medio de recuento de aerobios mesfilos (PCA) y mohos y levaduras (Agar
YGC).
2. Llevar las placas que se van a utilizar completamente cerradas, con cuidado de que no se
abran durante el transporte a la planta escogida.
3. Destapar las cajas de Petri y dejarlas abiertas durante 15 minutos.
4. Cerrar las cajas de Petri y llevar al laboratorio para su incubacin durante:
- 48 horas a 37C las placas de PC
- 4 a 5 das a 25C las placas de YGC
5. Realizar el recuento de aerobios mesfilos y mohos y levaduras e informar los resultados
obtenidos.
ANLISIS DE SUPERFICIES
Cada grupo debe seleccionar la superficie a analizar de un equipo, utensilio o mesn presente
en una de las plantas de alimentos de la UTA.
Mtodo del hisopo
1. Delimitar la superficie que se va a analizar usando una plantilla con una abertura de rea
conocida (p. ej. 100 cm2)
2. Humedecer un hisopo estril con APT 0,1% y restregar varias veces sobre la superficie
delimitada por la plantilla.
3. Introducir el escobilln en el tubo con APT 0,1% y dejar durante 15-30 min de manera que
los microorganismos se liberen del algodn al diluyente.
4. Sembrar 0,1 ml de la suspensin placas con agar PC y EMB por duplicado para recuento de
Aerobios Mesfilos y Enterobacterias, respectivamente.
5. Rastrillar el inculo con el asa de Drigalsky haciendo una siembra masiva por toda la
superficie del medio de cultivo.
6. Incubar las placas de cultivo a 35C durante 24- 48 horas.
7. Contar las colonias que hayan crecido posterior al tiempo de incubacin y dividir por el
rea muestreada.
8. Expresar los resultados.
ANLISIS DE MANIPULADORES
Toma de muestra de manipuladores por el mtodo del hisopo
Manos

19

1. Humedecer el hisopo en el APT 0,1% y frotar la superficie de la palma de la mano haciendo

rotar el hisopo.
2. Lavar el hisopo en el diluyente, drenar el exceso de lquido en la pared del tubo.
3. Frotar la zona entre los dedos, repetir la limpieza del hisopo y pasar el hisopo por las uas.
4. Finalizando el frotis, sumergir el hisopo en el tubo con el diluyente.
5. Repetir la misma operacin para la otra mano.
6. Ambos hisopos se colocan en el mismo tubo con APT 0,1% y se dejan durante 15-30
minutos. Se considera como una sola muestra.
Mtodo de siembra de muestras tomadas a manipuladores
1. Sembrar directamente el hisopo (siembra masiva) en la superficie de cada una de las dos
placas con agar BP y EMB.
2. Incubar las placas en posicin invertida a 35C durante 24 y 48 horas.
3. Observar el crecimiento de colonias caractersticas en cada uno de los medios de cultivo.
En agar Baird Parker las colonias de Staphylococcus aureus crecen negras rodeadas por
halos claros que contrastan con la opacidad del medio de cultivo. En agar EMB muchas
cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras
que las que no lo hacen son incoloras.
IV. CUESTIONARIO
1.

2.

3.
4.

5.

Qu mtodos NO convencionales de toma de muestras en ambientes y superficies

existen? Qu ventajas presentan frente a los mtodos convencionales empleados en
esta prctica?
Haga una tabla donde se muestre cmo se expresan los resultados de los anlisis
realizados microbiolgicos en ambientes, superficies (regulares e irregulares) y
manipuladores.
Consulte las normas disponibles a nivel internacional y nacional sobre tcnicas de
muestreo en superficies en la industria de alimentos en general y en la industria crnica.
Consulte y haga una tabla con los diferentes lmites microbiolgicos disponibles a nivel
internacional para indicadores de limpieza y desinfeccin en ambientes y superficies de
la industria alimentaria.
Investigue qu es un biofilm en la industria alimentaria, cules son los patgenos
bacterianos que ms lo forman y cules son los factores que favorecen su formacin.
V. BIBLIOGRAFIA

GAMAZO, C., Lpez-Gui, I. y Daz, R. (1995). 2005. Manual prctico de microbiologa. (3 ed.).
Espaa: Editorial Masson S.A. 2005.
GMEZ, FJ. y Salgado, MT. 2006. Manual de procedimientos e instructivos. Laboratorio de
Microbiologa de Alimentos de la Unidad Tecnolgica de Alimentos (UTA) de la Universidad de
Caldas.
Guia de prctica de microbiologia. 2005. Departamento de Microbiologa II. Facultad de
Farmacia.
Universidad
Complutense.
Disponible
en:
http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/CYTA/Guia_CYTA_1.pdf

20

FUSTER, N. 2007. Importancia del control higinico de las superficies alimentarias mediante
tcnicas rpidas y tradicionales para evitar y/o minimizar las contaminaciones cruzadas.
Disponible en: http://www.tesisenxarxa.net/TDX-1005107-165210/index_cs.html
MICHANIE, S. 2012. Apuntes de laboratorio. Volumen II Monitoreo de la higiene de superficies.
Disponible en: http://www.britanialab.com/files/tcientificos/17.pdf

21

Prctica 6. Anlisis microbiolgico del agua mediante la

tcnica de filtracin por membrana (FPM)
I. INTRODUCCIN
La calidad microbiolgica del agua en muy importante en la produccin de alimentos debido a
que siempre es usada para los procesos de limpieza y desinfeccin o puede estar presente
como materia prima en la elaboracin de algunos alimentos.
En la industria alimentaria el agua puede dividirse en tres categoras: agua de proceso, agua de
enfriamiento y agua de alimentacin de calderas. La calidad de cualquier tipo depender del
contenido microbiano del agua utilizada como materia prima, de los mtodos de tratamiento a
los que es sometida y de los sistemas empleados para su almacenamiento y distribucin.
Para garantizar la calidad microbiolgica del agua, es necesario realizar el control de la misma,
utilizando diferentes mtodos que nos permitan realizar la enumeracin o el recuento
microorganismos indicadores o la investigacin de microorganismos patgenos.
Al finalizar esta prctica de laboratorio el estudiante estar en capacidad de realizar el control
microbiolgico del agua de proceso en la industria alimentaria mediante la tcnica FPM.
II. MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
-

Muestra de agua de proceso (potable).

Agua peptonada al 0,1 %.
Placas de Petri con agar Cetrimide.
Placas de Petri con agar ENDO.
Placas de Petri con Plate Count (PCA).
Equipo de filtracin (Millipore).
Membranas filtrantes estriles de 0,45 m.
Bomba de vaco.
Pinzas estriles.
Incubadoras reguladas a una temperatura de 35C.

III. PROCEDIMIENTO
1. Colocar una membrana filtrante estril, bajo condiciones aspticas, sobre el centro del
portafiltro, usando pinzas estriles, con la superficie cuadriculada hacia arriba.
2. Ensamblar el equipo, colocando el dispositivo de filtracin y asegurando con una pinza.
3. Verter 100 ml de la muestra de agua en el portafiltro y proceder a filtrar.
4. Lavar el embudo con aproximadamente 100 ml de agua peptonada al 0,1%.
5. Remover la parte superior del portafiltro y, con una pinza estril, transferir la membrana a
la placa de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al microorganismo que
se va a determinar:

Indicador
Coliformes y E. coli
Pseudomonas aeruginosa
Aerobios mesfilos

Medio de cultivo
Agar ENDO
Agar Cetrimide
Plate Count

Incubacin
Incubacin 35C por 24-48 h

22

6. Al colocar la membrana, evitar la formacin de burbujas entre sta y el medio de cultivo.

7. Incubar las placas en forma invertida a la temperatura y tiempo requeridos para el
crecimiento del microorganismo investigado.
8. Contar las colonias en las membranas.
9. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias (UFC) en 100 ml de agua,
considerando el volumen filtrado.
IV. CUESTIONARIO
1. Describa la metodologa de toma de muestra de agua de grifo y tanque de
almacenamiento, la forma de preservar la muestra y transportarla.
2. Haga un diagrama del equipo de filtracin por membrana y describa cada una de sus
partes.
3. Consulte la normativa nacional para el anlisis microbiolgico de agua de consumo
humano y sus lmites microbiolgicos.
4. Investigue el fundamento de otras tcnicas usadas para anlisis bacteriolgico del agua
potable.
5. Aparte de bacterias determinadas en esta prctica, Qu otros microorganismos pueden
investigarse en una muestra de agua potable y cul es su importancia como indicador?
V. BIBLIOGRAFIA
Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biologa de los microorganismos. 8
Edicin. Prentice Hall International. (1999).
Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4 Edicin. (1998).
Suliman Al Tomi, Abdyrazazq. Manual of Bacteriological Examination of Drinking Water. (2007)
The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmacopeia. The
National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD (1999).

23

Prctica 7. Deteccin de Salmonella spp.

I.

INTRODUCCIN

Salmonella spp. es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriacea y es

siempre considerado como potencialmente patgeno ya que es la causa ms comn de
enfermedades trasmitidas por alimentos. Se caracteriza por ser un bacilo Gram negativo,
mvil, anaerobio facultativo, fermentador de la glucosa, no fermentador de la lactosa, catalasa
positiva y oxidasa negativa.
Las salmonelosis comprenden un conjunto de cuadros clnicos cuya principal manifestacin es
la gastroenteritis aguda, una de las intoxicaciones alimentarias ms comunes causadas por la
ingestin de agua y alimentos contaminados. Los sntomas consisten en escalofros, cefalea,
nauseas, anorexia, tos, diarrea o estreimiento (Colaboradores de Wikipedia, 2014).
Salmonella spp. puede ser aislada de productos alimenticios o heces fecales de humanos y
animales y la nica forma de transmisin es la oral, por lo que es de suma importancia el
anlisis de los alimentos para detectar su presencia en ellos. Los alimentos ms contaminados
son los de origen animal, incluyendo huevos y ovoproductos, leche cruda y productos lcteos,
carnes y derivados y aves de corral (Escobar, 1994).
El propsito de esta prctica es capacitar a los estudiantes del programa de Ingeniera de
Alimentos de la Universidad de Caldas en la realizacin de un mtodo cualitativo para el
aislamiento e identificacin de Salmonella spp. a partir de alimentos de origen animal o
vegetal.
II.

INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
Muestra: productos crnicos, mayonesa, queso fresco, bizcocho, sopa o crema
instantnea.
Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
Medio Rappaport-Vassiliadis (RV).
Agar Xilosa Linisa Desoxicolato (XLD).
Agar Salmonella Shigella (SS).
Agar Triple Hierro Azcar (TSI).
Caldo Urea.
Agar Lisina Hierro (LIA).
Medio de movilidad semislido.
Reactivo de Kovacs.
Agar Citrato de Simmons.

Materiales
Pipetas de 1 ml.
Tubos de ensayo con 10 ml de caldo RV.
Tubos con los deferentes medios para pruebas bioqumicas.
Gradillas.
Frasco con 225 ml de APT 0,1%.
Caja de Petri con agar S-S.
Frasco o jarra para licuar las muestras.
Utensilios: chuchillos, tenedores, cucharas, esptulas, etc.

24

Asa bacteriolgica.
Asa de punta.

Equipos
Incubadora regulada a 37C
Bao Mara regulado a 41,5C
Balanza
Licuadora
III.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 25 g o medir 25 ml de la muestra de alimento y agregar en un frasco estril de 500

ml.
2. Agregar 225 ml de APT 0,1% (pre-enriquecimiento no selectivo).
3. Incubar en estufa regulada a 35 2C por 18 2 h.
4. Pasado este tiempo, inocular 0,1 ml de la muestra pre-enriquecida en un tubo con 10 ml
de Caldo RV e incubar en Bao Mara regulado a 41,5C por 24 3 h.
5. Pasado el tiempo de incubacin, inocular una asada del cultivo en caldo RV por el mtodo
de agotamiento o estriado en placas con agar XLD y S-S. Incubar las cajas a 35 2C por 24
3 h.
6. Observar las colonias tpicas lactosa negativa y sulfuro + tpicas de Salmonella spp. en agar
SS y XLD.
7. A partir del cultivo en agar selectivo escoger las colonias tpicas que estn ms aisladas
para realizar las pruebas bioqumicas que se especifican a continuacin:

TSI
Urea
Citrato de Simmons
LIA
Movilidad en SIM medio
Indol

8. Incubar a 35 2C por 24 3 h.
9. Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs al tubo con SIM medio
para determinar produccin de Indol y realizar la lectura e interpretacin de todas las
pruebas bioqumicas.
IV.

CUESTIONARIO

1. Enumere las fases del ensayo de deteccin de Salmonella spp. y describa para qu se
realiza cada una.
2. Haga una tabla para enumerar los medios de enriquecimiento selectivo y los agares de
aislamiento selectivo que se utilizan en el ensayo de deteccin de Salmonella spp. y
describir su composicin y fundamento.

25

3. Enumere y describa brevemente los mtodos rpidos usados para la deteccin de

Salmonella spp. en la industria alimentaria.
4. Investigue datos epidemiolgicos sobre casos de salmonelosis en Colombia y a nivel
mundial y por lo menos un caso de reporte de retiro de alimentos del mercado por
contaminacin con Salmonella spp.
5. Haga una tabla para enumerar por lo menos 10 alimentos en los cuales es requisito
detectar la presencia de Salmonella spp. y cul es la norma que lo establece en Colombia.
V.

BIBLIOGRAFA

ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. (1994) Manual de tcnicas y procedimientos. Programa

Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia,
Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln.
ICONTEC. (2007). Norma Tcnica Colombiana NTC 4574. Mtodo horizontal para la deteccin
de Salmonella spp.
LYNN, E Ann Mc Landsborough (2004). Food microbiology laboratory. Volumen 17 de CRC
series in contemporary food science. CRC Press, ISBN 0849312671, 9780849312670. 179 pgs.
RIBEIRO, Vinicius B., ANDRIGHETO, Cristiano, BERSOT, Luciano S. et al. (2007). Serological and
genetic diversity amongst Salmonella strains isolated in a salami processing line. Braz. J.
Microbiol. [online], vol. 38, no. 1 [cited 2007-11-10], pp. 178-182. Available from: [3]. ISSN
1517-8382.
WIKIPEDIA
(2014).
Salmonelosis.
Disponible
en:
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Salmonelosis&oldid=74337903 Fecha de consulta:
27 de mayo del 2014.

26

Prctica 8. Deteccin de Listeria monocytogenes

I.

INTRODUCCIN

Listeria monocytogenes, es un cocobacilo Gram positivo, anaerobio facultativo, no esporulado,

catalasa positiva, mvil a una temperatura menor a 30C y capaz de crecer en un amplio rango
de temperaturas (1C a 45C) y una elevada concentracin de sal (Wikipedia, 2014).
Listeria spp. ha sido aislada del suelo, agua, efluentes y heces humanas y animales. Los
alimentos que han sido implicados en casos de listeriosis son carnes de fiambre listas para
consumir y perros calientes, pats refrigerados o pastas untables a base de carne, leche y
productos lcteos no pasteurizados (crudos), queso blando hecho de leche no pasteurizada,
como el queso fresco, Feta, Brie y Camembert, marisco ahumado refrigerado, etc.
(FoodSafety.gov, 2014).
Esta bacteria causa una enfermedad llamada listeriosis que puede suponer graves riesgos para
ciertos grupos poblaciones. En general, las mujeres embarazadas, las personas de la tercera
edad y las personas con sistemas inmunitarios debilitados corren mayor riesgo
(FoodSafety.gov, 2014). Es una enfermedad poco frecuente en humanos, pero
extremadamente grave. Tiene poca morbilidad, pero muy alta mortalidad (30%) que en el caso
de grupos sensibles se eleva an ms (hasta un 70%). Tiene un perodo de incubacin muy
largo, unas 5 semanas, siendo muy difcil rastrear el alimento que la provoc. Los sntomas son
una primera forma intestinal asintomtica parecida a la gripe y despus puede causar en
embarazadas aborto, en nios, ancianos e inmunodeprimidos septicemia, meningitis,
endocarditis y neumona, y en adultos sanos meningitis, meningoencefalitis y trastornos
respiratorios (Wikipedia, 2014).
En la presente gua de laboratorio se presenta un mtodo cualitativo para determinar la
presencia de Listeria monocytogenes en un producto alimenticio.
II.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

Materiales (estriles)
- Utensilios.
- Frasco de vidrio boca ancha.
- Tubos de 16 x 160 mm con tapa rosca.
- Asa bacteriolgica.
- Asa de punta.
- Vaso para licuadora.
- Portaobjeto.
- Cajas de Petri
Medios de cultivo, reactivos e insumos
- Muestra de alimento.
- Caldo Fraser concentracin.
- Oxoid Listeria agar cromognico (OCLA)
- SIM medio.
- Agua oxigenada.
- Agar base sangre.
- Sangre de cordero defibrinada.
- Perxido de hidrgeno al 3%

27

Equipos:
- Incubadora regulada a 35C.
- Incubadora regulada a 30C
- Licuadora.
- Balanza.
III.

PROCEDIMIENTO

Enriquecimiento selectivo
a. Tomar 25 gramos de la muestra de distintas porciones del producto a analizar.
b. Colocar esta cantidad de muestra en un frasco de licuadora y adicionar 225 ml de caldo
Fraser concentracin.
c. Homogenizar durante 30 segundos, transferir a un frasco estril e incubar a 30C durante
24 2 horas.
Aislamiento selectivo
a. Agitar suevamente el frasco de enriquecimiento selectivo y con un asa estril tomar 10 l
de la muestra y sembrar por agotamiento en un agar selectivo para Listeria (OCLA).
b. Incubar por 24 h a 35C.
Confirmacin de Listeria monocytogenes
a. Observar la formacin de colonias verde fluorescentes (verde-amarillo) con un halo opaco
alrededor de la colonia, caractersticas de L. monocytogenes.
b. Seleccionar como mnimo cinco colonias aisladas tpicas y realizar las siguientes pruebas
bioqumicas:
Reaccin de la catalasa: se toma una colonia aislada y se suspende en una gota de
perxido de hidrgeno al 3% en una lmina portaobjetos. La formacin inmediata de
burbujas de gas indica una reaccin positiva.

Hemlisis en agar sangre: Estriar una colonia aislada en agar sangre de cordero al 5% e
incubar a 35C por 24-48 h. Observar las placas con luz brillante y evidenciar la
presencia de hemlisis estrecha.

Prueba de movilidad: Se inocula con asa recta por puncin central en tubos con medio
SIM y se incuba a 25C 2C por 2 a 5 das. Se observa el crecimiento tpico en forma
de sombrilla alrededor de la puncin.

IV.

CUESTIONARIO

1. Consulte sobre la composicin, empleo e interpretacin de los medios que se usan para la
determinacin de Listeria monocytogenes.
2. Elabore un cuadro donde describa el perfil bioqumico de las diferentes especies del
gnero Listeria.
3. Haga una tabla con 10 alimentos en los que es necesario determinar la presencia de L.
monocytogenes a nivel nacional y/o internacional y mencione la normativa que lo
establece.
4. Haga un diagrama de flujo del proceso de laboratorio para hacer Investigacin de L.
monocytogenes segn la NTC 4666. (Disponible en la biblioteca o en la UTA).
5. Investigue las pruebas rpidas y su fundamento disponibles para la deteccin de L.
monocytogenes en alimentos.

28

6. Cmo define microorganismo emergente? Cul es su importancia? Mencione 4 ejemplos

de bacterias emergentes relacionadas con ETA.
V.

BIBLIOGRAFA

AFNOR UNI 03/04-04/05 (2003) Validation certificate for alternative analytical method
according to standard ISO 16140:
Foodsafety.gov
Listeria.
Disponible
http://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci%C3%B3n/causas/bacteriasvirus/listeria/xtz/

en:

ICONTEC. NTC 4666 (1999). Mtodo horizontal para la deteccin de Listeria monocytogenes.
Parte 1. Mtodo de deteccin.
MCLANDSBOROUGH, L. A. (2004). Food microbiology laboratory. Vol. 17 de CRC series in
contemporary food science. CRC Press, ISBN 0849312671, 9780849312670. 179 pginas
MARZOCCA, M. A. y otros (2004) Deteccin de Listeria monocytogenes en distintos productos
alimenticios y en muestras ambientales de una amplia cadena de supermercados de la ciudad
de
Baha
Blanca.
Obtenido
el
15
de
octubre
de
2009
en
http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v36n4/v36n4a06.pdf
SANCHEZ, F, et al. (2006). Incidencia de especies de Listeria en una planta productora de
alimentos congelados. Ciencia UANL enero-marzo, ao/vol. IX, nmero 001 pp. 51.56
WIKIPEDIA
(2014).
Listeria
monocytogenes.
Disponible
en:
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Listeria_monocytogenes&oldid=77447860

29

Prctica 9. Determinacin de esporas de Clostridium sulfito

reductor (ECSR) en agua
I.

INTRODUCCIN

El grupo bacteriano sulfito reductor est integrado por grmenes pertenecientes al gnero
Clostridium, que tienen en comn reducir el sulfito a sulfuro. Se caracterizan por tener una
morfologa bacilar, ser Gram positivos, anaerobios estrictos o facultativos y capaces de formar
esporas (Acosta y Gonzlez, 1995, p 298). Las especies de Clostridium estn ampliamente
distribuidas en el ambiente, habitando el tracto gastrointestinal tanto de humanos como de
animales (Wikipedia, 2014). Dentro de este grupo existen dos especies importantes en la
industria alimentaria por su capacidad de producir toxi-infecciones: Cl. perfringens y Cl.
botulinum.
La enfermedad alimentaria causada por Cl. perfringens puede ocurrir cuando los alimentos
como la carne se cocinan sin el mantenimiento del calentamiento o la refrigeracin adecuados
antes de servir. Es frecuente la presencia de pequeas cantidades de Cl. perfringens en las
carnes crudas, aves, sopas deshidratadas, salsas, verduras crudas y especias (Rhodehamel &
Harmon, 2001). Los sntomas, que incluyen calambres abdominales intensos y diarrea, se han
atribuido a una enterotoxina producida durante la esporulacin del organismo en el intestino
(Rhodehamel & Harmon, 2001).
La intoxicacin causada por Cl botulinum o botulismo alimentario se presenta tras un perodo
de incubacin de 24 horas a 4 das despus de la absorcin de la toxina, vara desde formas
leves que no requieren atencin mdica hasta un cuadro grave que puede provocar la muerte
en 24 horas por una parlisis flcida descendente simtrica que ocasiona insuficiencia
respiratoria. Los sntomas comienzan con afectacin de los nervios craneales (diplopa,
disartria, disfagia), agravndose progresivamente la debilidad motora, que pasa a cuello,
brazos, trax y piernas. Puede haber nuseas, vmitos y dolor abdominal antes o despus del
comienzo de la parlisis. Hay adems mareos, visin borrosa y boca seca (Prez-Prez, 2003).
El recuento de Clostridium sulfito reductor se suele usar para evaluar la calidad higinica del
agua y productos de origen animal y se basa en el recuento de colonias de clulas vegetativas
o sus esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio de cultivo especfico,
incubadas en condiciones anaerbicas durante un tiempo y temperatura determinadas.
El propsito de esta prctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las herramientas
necesarias para determinar el nmero de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR) a
partir de una muestra de agua por mtodos de siembra profunda en tubo.
II.

INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
- Muestra de agua (100 mL) residual (Cada grupo debe traer la muestra al laboratorio el
da de la prctica).
- Agar sulfito polimixina-sulfadiazina (SPS).
- Agua peptonada tamponada (APT) 0,1%.
- Parafina estril o agar-agar.

30

Material
-

Pipetas de 10 ml.
Pipetas de 1 ml.
Gradillas para tubos.
Tubos de ensayo con 3 ml de parafina o agar-agar esteril.
Tubos de ensayo vacos estriles.
Tubos de ensayo con 15 ml de agar SPS fundido.
Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada tamponada 1%.

Equipos
- Bao de agua con temperatura constante a 80C.
- Bao de agua con temperatura constante a 50C.
- Incubadora regulada a 35C.
III.
1.

PROCEDIMIENTO
Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar.

2.

A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alcuotas de 10 mL con una

pipeta estril y depositarlas en cada uno de los tubos estriles.

3.

Una vez que estos tubos contienen los 10 mL de agua, mantenerlos en un bao de agua a
80 C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las formas vegetativas y
permanezcan solamente las formas esporuladas.

4.

Tomar los tubos con SPS agar a 50 C y proceder a su inoculacin profunda, de la siguiente
manera:

Con una pipeta estril tomar 5 mL de dicha agua e introducirla hasta el fondo del tubo
que contiene el agar.

Con mucho cuidado se va depositando el agua a lo largo de todo el tubo desplazando la

pipeta al exterior procurando que el total de la muestra quede en el agar y no se airee.

Rpidamente pasar el tubo a la llave del agua para enfriarlo.

Despus aadir una capa de vaselina parafina estril de unos 3 mm de espesor para
conseguir condiciones de anaerobiosis.

Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.

Es aconsejable rotular cada tubo convenientemente.

NOTA:
Si se sospecha que el agua est muy contaminada, se puede inocular 5 mL de muestra en un
tubo y 5 mL de las diluciones 10-1, 10-2..........
5.

Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37C (1C) durante 24 h (2 h).

6.

Transcurrido el perodo de incubacin, contar las colonias de color negro que aparezcan en
la totalidad de los cuatro tubos inoculados.

31

IV.
CALCULOS Y PRESENTACION DE RESULTADOS:
Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se calcular de la
siguiente manera:
- Si se han sembrado 20 mL de muestra, el resultado es directo.
- En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente frmula:
Nmero de ECSR/20 mL= (Nmero de colonias/volumen real de la muestra inoculada en mL) x
20.
LOS RESULTADOS SE EXPRESARAN ASI:
Nmero de ECSR: ____/20 mL.
V.

CUESTIONARIO

1.

A qu se debe la posible presencia de Clostridios sulfito reductores en agua?

2.

Explique el significado del recuento de ECSR en agua y alimentos.

3.

Cul es la composicin y el fundamento de la formacin de colonias de color negro en el

agar SPS?

4.

Haga un diagrama de flujo del procedimiento (9) y expresin de resultados (10) para hacer
el recuento de Clostridium sulfito reductores e identificacin de Clostridium perfringens
segn la NTC 4834.

5.

Haga una tabla para enumerar por lo menos 10 alimentos a los que se le debe realizar
recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor, sus lmites microbiolgicos, y cul es
la norma que lo establece.

VI.

BIBLIOGRAFA

ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995). Fundamentos para el anlisis microbiolgico de los

alimentos. Barranquilla.
AYCACHI, R. Prctica No. 14. Aislamiento e Identificacin de Clostridium perfringens. Escuela
Profesional de Biologa. Universidad de Nacional Pedro Ruiz Gallo.
INTERNATIONAL ORGANIZATION OF STANDARIZATION (2004). Mtodo horizontal para la
enumeracin de Clostridium perfringens. Tcnica de recuento de colonias. ISO 7937.
MARTINEZ, K. Gua Prctica No. 6. Recuento de Clostridium sulfito reductor-Esterilidad
Comercial. Universidad de Santander.
PASCUAL, M.R y CALDERN, V. (1999) Microbiologa alimentaria. Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. 2 Ed. Ediciones Das de Santos.
PEREZ-PEREZ, H, Rubio C, Pozuelo MR, Revert C y Hardisson A. (2003). Botulismo y toxina
botulnica. Rev. Toxicol. 20: 8-12

32

RHODEHAMEL, EJ & Harmon, SM (2001). BAM: Clostridium perfringens. Disponible en:

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070878.htm
Consultado 12 de mayo de 2014
WIKIPEDIA.
La
enciclopedia
libre
(2014).
Clostridium.
Disponible
en:
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Clostridium&oldid=73821102 Fecha de consulta: 21
de mayo del 2014.

33

Prctica 10. Recuento e identificacin de Staphylococcus

coagulasa positiva
I.

INTRODUCCIN

Staphylococcus aureus (coagulasa positiva) es un coco Gram positivo, anaerobio facultativo,

productor de coagulasa y catalasa, que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza.
Su hbitat natural es la piel, fosas nasales y garganta de animales y seres humanos y se estima
que una de cada tres son portadoras de esta bacteria.
Adems de producir enfermedades localizadas (piel y mucosas) y sistmicas, S. aureus se ha
identificado como el agente causal de intoxicacin alimentaria afectando el aparato
gastrointestinal y produciendo la intoxicacin estafiloccica por alimentos. Los sntomas de
esta intoxicacin son nuseas, vmitos, calambres abdominales, ocasionalmente diarrea,
malestar general y dolor de cabeza. stos pueden aparecer entre los 30 minutos y 8 horas
despus de haber consumido el alimento contaminado con las toxinas estafiloccicas. Esta
intoxicacin no es considerada como una enfermedad grave; sin embargo, se han presentado
muertes, principalmente en ancianos y nios. Su grado de severidad depende de la cantidad
de enterotoxina ingerida, el estado inmunolgico del individuo y su edad. No se tiene un dato
exacto de la cantidad de enterotoxina que produce la intoxicacin, pero se ha estimado que va
desde 100 ng hasta 1 mg (Mota & Fernndez, 2012).
En esta prctica de laboratorio se dar la orientacin necesaria a los estudiantes sobre la
metodologa para el recuento e identificacin de estafilococos coagulasa positiva en productos
destinados al consumo humano.
II.

INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
Muestra de alimentos: queso fresco, producto crnico, producto lcteo, sopa instantnea.
Agua peptonada 0,1% + 2% de citrato de sodio.
Agar Baird Parker (BP).
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI).
Plasma de conejo liofilizado.

Materiales
Pipetas de 1 ml.
Tubos de ensayo con 9 ml de diluyente.
Frascos con 90 ml de diluyente.
Caja de Petri con agar BP.
Frasco o jarra para homogenizar muestras.
Utensilios (cuchillos, tenedores, cucharas, etc.).
Asa de Drigalsky.

Equipos
Incubadora regulada a 35C
Balanza.
Licuadora.
III.

PROCEDIMIENTO

34

Mtodo de recuento en placa

1. Pesar 10 g de la muestra.
2. Agregar la muestra a 90 ml del diluyente (dilucin 10-1).
3. Homogenizar la muestra, agitndola en licuadora hasta que se desmenuce.
4. Preparar las dems diluciones (10-2, 10-3).
5. Inocular 0,1 ml de dos diluciones consecutivas por duplicado en cajas de Petri con Agar BP.
6. Esparcir el inculo en forma masiva con esptula de Drigalsky.
7. Incubar a 35C por 24 48 horas.
8. Pasado el tiempo de incubacin, elegir las placas que contengan entre 15 y 150 colonias
aisladas y contar todas las colonias que muestren las dos reacciones caractersticas
diagnsticas de liplisis y protelisis: se desarrolla una colonia negra que producen halos y
anillos caractersticos de margen estrecho y blanco y que aparecen rodeadas por zonas
claras que contrastan con la opacidad del medio.
9. Con la ayuda del cuadro 1, determinar el nmero de colonias a evaluar, tomando en
cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus en el agar BP y llevar a cabo la prueba de
la coagulasa.
Cuadro 1. Nmero de colonias a evaluar de S. aureus
Nmero total de colonias sospechosas en una
Nmero de colonias sospechosas a
caja de BP
caracterizar bioqumicamente
Menos de 50 UFC
3
51-100 UFC
5
101-150 UFC
7

Prueba para determinar produccin de la enzima coagulasa

1. Pasar las colonias elegidas a tubos de Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI) e incubar
durante 20-24 horas a 35C.
2. En un tubo de vidrio estril, verter 0,1 ml del cultivo obtenido en caldo BHI y aadir 0,3 ml
de plasma de conejo EDTA reconstituido.
3. Incubar a 35C durante 6 horas.
4. Examinar los tubos cada hora con el fin de detectar la presencia de cogulos hasta las 6
horas. La aparicin de un cogulo bien diferenciado es indicativo de la actividad coagulasa.
En la siguiente figura se presentan los distintos tipos de cogulos que pueden observarse. Hay
que hacer notar que la reaccin 1+ no se considera evidencia positiva de la produccin de
coagulasa. La reaccin 2+ se caracteriza porque el coagulo se eleva por encima del nivel del
lquido cuando el tubo se inclina casi horizontalmente. Hay que tener cuidado a la hora de
diferenciar entre un cogulo verdadero y una formacin similar a un saco (pseudocogulo). La

35

diferenciacin puede basarse en que los pseudocogulos se deshacen al agitar el tubo

suavemente.

INTERPRETACIN
NEGATIVA
No se observa evidencia de la formacin de fibrina.
1+ Aparecen cogulos muy pequeos desorganizados.
POSITIVA
2+ Aparece un cogulo pequeo organizado.
3+ Aparece un gran cogulo organizado.
4+ Aparece coagulado todo el contenido del tubo.
4+ El cogulo se mantiene aun cuando se invierte el tubo.

IV.

CUESTIONARIO

1. Investigue sobre el agar Baird Parker (BP) su composicin, el agente selectivo, el agente
diferencial y las caractersticas de las colonias de S. aureus. Mencione otros medios que
se puedan usar para el aislamiento de este microorganismo.
2. Qu otras pruebas bioqumicas, adems de la coagulasa, se pueden usar para identificar
cepas enterotoxgenicas de S. aureus? Describa el procedimiento de cada una de ellas.
3. Investigue en la NTC 4779 el ejemplo de cmo se hace el clculo y la expresin de
resultados para el recuento de Estafilococos coagulasa positiva.
4. Haga una tabla en la que mencione mnimo 10 ejemplos de alimentos en los que se debe
hacer recuento de S. aureus, los ndices mximos (m y M) permisibles y las normas que lo
establecen.
5. Investigue por lo menos 6 casos reportados de brotes de intoxicacin estafilocccica a
nivel nacional e internacional.
6. Qu indica un alto recuento de S. aureus en alimentos?

36

V.

BIBLIOGRAFIA

BENNETT RW. and Lancette GA. (2001). BAM: Staphylococcus aureus. Disponible en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071429.htm
Consultado: 6 de mayo de 2014.
CHANS,
R.G.
(2002).
Estafilococos.
Disponible
en:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf Consultado: 22 de febrero de 2008
DINGES, M, Orwin P, Schlievert P. (2000). Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol
Rev. Vol. 13:16-34.
INPPAZOPS/OMS. Instituto Panamericano de Proteccin de Alimentos y ZoonosisOrganizacin Panamericana de la Salud. (2000). Sistema de Informacin Regional para la
Vigilancia de Enfermedades Transmitidas por Alimentos: Brotes de intoxicacin estafiloccica
de 1993 hasta 2000.
LABORATORIO DE TECNOLOGA EDUCATIVA. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Universidad de Salamanca. (2005). Investigacin y Recuento de Staphylococcus aureus.
Obtenido
el
01
de
octubre
de
2009
en:
http://virus.usal.es/web/demo_microali/Saureus/SaureusPlaca.html
MERCADO, C. (2007). Los mbitos normativos, la gestin de la calidad y la inocuidad
alimentaria: una visin integral. Agroalim. Vol. 12(24): 119-31.
MOTA L. y Fernndez E. (2012). Intoxicacin estafiloccica por alimentos. Disponible en:
http://www.alimentacion.enfasis.com/articulos/65372-intoxicacion-estafilococica-alimentos.
Consultado: 6 de mayo de 2014.
THATCHER, F.S. y CLARK, D.S. (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia.
Zaragoza.

37

Prctica 11. Recuento e identificacin de Bacillus cereus

I.

INTRODUCCIN
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio o anaerobio facultativo, formador de
esporas y mvil. Hidroliza la lecitina de la yema del huevo y no fermenta el manitol.
Es un microorganismo ubicuo abundante en la naturaleza. Se encuentra frecuentemente
en el suelo, polvo, vegetales, cereales, harinas, especias, plantas medicinales y algunos
alimentos crudos o procesados.
B. cereus puede producir dos enterotoxinas, la toxina diarreica y la toxina emtica,
relacionadas con dos formas de presentacin de esta toxiinfeccin: la primera, se
caracteriza por el dolor abdominal y la diarrea sin sangre que tiene un perodo de
incubacin de 4-16 h despus de la ingestin con sntomas que duran 12-24 h; la segunda,
se caracteriza por un ataque agudo de nuseas y vmitos y se produce dentro de 1-5 h
despus del consumo de alimentos contaminados (Acosta et al., 1995) (Martino et. al
2010).
Las cepas de B. cereus son muy variables en cuanto a su crecimiento y caractersticas de
supervivencia. Algunas son psicotrofas, siendo capaces de crecer a 4-5C pero no a 3035C, mientras que otras cepas son mesfilas y pueden crecer entre los 15C y los 50-55 C.
En general, no obstante, la temperatura ptima de crecimiento vara de 30 a 40C. Las
formas esporuladas, al igual que en el gnero Clostridium, son muy termo resistentes y
slo se eliminan mediante la esterilizacin (Tallent et. al., 2012).
La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua
vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicacin si
las medidas higinico sanitarias y de elaboracin de alimentos no son las adecuadas.
En la siguiente prctica de laboratorio los estudiantes aprendern la metodologa para el
recuento e identificacin de B. cereus en alimentos por medio del recuento en placa y su
importancia como indicador en la industria alimentaria.

II.

INSUMOS, MATERIALES Y EQUIPOS

Insumos
Agua peptonada tamponada (APT) 0.1%
Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixona (MYPA) de Mossel
Agar sangre de cordero
Materiales
Cuchillos-cucharas
Pipetas 1 y 10ml
Asa bacteriolgica
Gradilla
Tubos de ensayo
Algodn y alcohol al 70%
Asa de Drigalsky

38

Equipos
Licuadora
Balanza
Incubadora regulada a 30C
III.

PROCEDIMIENTO (ISO 7932:2004)

Recuento en placa
1. Preparar y homogenizar la muestra, realizando las respectivas diluciones
2. Marcar cuatro cajas de Petri que contienen agar Cereus segn Mossel con fecha, muestra,
dilucin y No. del grupo.
3. Adicionar 0,1 ml de cada una de las diluciones en las cajas marcadas.
4. Extender la muestra con el asa de Drigalsky sobre toda la superficie del medio, y esperar
que se absorba el inculo.
5. Incubar por 18-24 horas a 30C.
6. Seleccionar las cajas que contengan menos de 150 colonias y contarlas colonias
caractersticas (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares, con un halo denso a su
alrededor debido a la lecitinasa).
7. Tomar al menos tres colonias caractersticas y hacer una siembra por agotamiento en una
caja de agar sangre de cordero con el asa bacteriolgica.
8. Incubar durante 24 horas a 30C y observar la -hemlisis positiva de B. cereus.
IV.

CUESTIONARIO

1. Explique cul es el fundamento de Agar Manitol Yema de Huevo con Polimixina (MYPA) de
Mossel. Especifique cules son los compuestos selectivos, diferenciales y las caractersticas
de las colonias.
2. Haga un diagrama de flujo del mtodo de recuento de B. cereus segn la NTC 4679:2006
(disponible en el LMA_UTA).
3. Haga una tabla en la que mencione las diferentes pruebas bioqumicas que se pueden usar
para la confirmacin de B. cereus y su perfil bioqumico.
4. Investigue pruebas rpidas para la identificacin de B. cereus
5. Enumere cinco alimentos y su respetiva norma a los cuales se les exige la enumeracin de
B. cereus en Colombia.
6. Investigue por lo menos tres brotes causados por B. cereus a nivel nacional o internacional.
V.

BIBLIOGRAFA
ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995.) Fundamentos para el anlisis microbiolgico de
los alimentos. Barranquilla.

39

ESCOBAR DUQUE, MB. (1994).Manual de tcnicas y procedimientos. Programa

Latinoamericano de microbiologa e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia,
Facultad de Salud Pblica Hctor Abad Gmez. Medelln.
ICMSF. (1984). Microorganismos de los alimentos. Tcnicas de anlisis Microbiolgico. Vol.
1, 2da edicin, Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa.
MARTINO, Tamara K et al. Bacillus cereus y su implicacin en la inocuidad de los
alimentos.: Parte II. Rev Cubana Salud Pblica [online]. 2010, vol.36, n.1, pp. 139-148 .
MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. (1998). Anlisis Microbiolgico de
Alimentos. Serie de Publicaciones cientficas No. 10. Santa fe de Bogot.
TALLENT, S.M., Rhodehamel, E.J., Harmon, S.M., and Bennett, R.W. (2012). BAM: Bacillus
cereus
Bacteriological
Analytical
Manual
Chapter
14.
Disponible
en:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070875.htm
Consultado 20 de mayo de 2014.

40

Practica 12. Evaluacin de esterilidad comercial de

conservas
I.

INTRODUCCIN

El enlatado o conserva se define como un proceso de conservacin de alimentos en recipientes

cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamiento trmico que garantiza la
destruccin de todas las formas bacterianas vegetativas y esporuladas, o de cualquier enzima.
El proceso trmico puede ser aplicado a cualquier producto alimenticio siempre y cuando se
envase en un recipiente adecuado. La principal exigencia es que el envase, una vez cerrado
hermticamente, no se deteriore durante la manipulacin o el almacenamiento. Los
recipientes utilizados pueden ser metlicos, plsticos, de vidrio y de hojalata.
Los enlatados, generalmente esterilizados, pueden permanecen sin contaminarse a
temperatura ambiente durante largos periodos de tiempo y tienen una vida til que puede
variar entre seis meses y varios aos.
Las caractersticas principales exigibles en una conserva o enlatado son la inocuidad para el
consumidor y el mantenimiento inalterable de sus caractersticas organolpticas durante
largos periodos de tiempo.
Se suelen tener en cuenta dos conceptos importantes respecto a la esterilidad de las
conservas:
1. Esterilidad biolgica: existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, as como
la inactivacin de enzimas celulares y microbianas.
2. Esterilidad comercial: NO deben existir formas vegetativas, esporas o toxinas de
microorganismos capaces de alterar el producto o causar enfermedad al consumidor. Las
enzimas celulares y microbianas debern ser inactivadas. En la esterilidad comercial se
toleran esporas pertenecientes a la familia Bacillaceae no patgeno, no toxignicos e
inertes, es decir, incapaces de germinar.
Las alteraciones biolgicas de los enlatados pueden ser causadas por la supervivencia de
microorganismos debido a deficiencias en el tratamiento trmico empleado o por fallas en
cierre del enlatado, las cuales facilitan la invasin del producto por microorganismos a travs
de grietas o la reproduccin de los mismos en la conserva. La mayor parte de las alteraciones
biolgicas sufridas son producidas por grmenes termfilos (esporulados), como son, algunas
especies de los gneros bacterianos Bacillus y Clostridium.
En la siguiente prctica se pretende dar a conocer la metodologa para evaluar la esterilidad
comercial de alimentos enlatados o conservas
II.

MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

Insumos
Conservas o enlatados (2 por grupo)
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI)
Almidn 0,1%
Alcohol al 70%

41

Agua tibia
Parafina o agar agar estril
Materiales
Reactivos para coloracin de Gram
Abrelatas estriles
Cuchillos-cucharas
Asa bacteriolgica
Cajas de Petri vacas
Tubos estriles
Toallas desechables o papel filtro
Pipetas graduadas
Laminas portaobjetos
Equipos
Balanza
Incubadora regulada a una temperatura de 35 C
Incubadora regulada a una temperatura de 55 C
Microscopio con objetivo de inmersin
Potencimetro
III.

PROCEDIMIENTO

Para la evaluacin de la esterilidad comercial de los enlatados es necesario dividir el

procedimiento en varias etapas que se describen a continuacin.
PRE-INCUBACIN
1. Tomar dos conservas en lata para realizar el estudio de esterilidad comercial.
2. Retirar las etiquetas de los envases (en caso de tenerlas).
3. Anotar cuidadosamente y exactamente todos los defectos o seales de alteracin tales
como abombamiento, oxidacin, microfugas, deformaciones, etc.
4. Lavar bien los envases con agua tibia jabonosa y escobilln en caso de ser necesario.
5. Enjuagar con agua tibia.
6. Secar las latas con toallas de papel desechables.
INCUBACIN
1. Envolver los alimentos envasados en papel filtro o en toallas de papel absorbente con el fin
de descubrir microfugas durante el perodo de incubacin.
2. Marcar las latas con el No. de identificacin, fecha y temperatura de incubacin.
3. Incubar una lata a 35C y la otra a 55C durante 8 das.
4. Agitar en invertir la posicin de los envases diariamente.
5. Observar todos los das con el fin de descubrir microfugas y abombamiento, si un envase
presentase microfugas o abombamientos, se debe examinar inmediatamente.
PREPARACIN DE LAS LATAS PARA SU ANLISIS
1. Es necesario que los envases se estabilicen a temperatura ambiente durante 1 hora.

42

2. Examinar la conserva para comprobar posibles Alteraciones: abombamiento, oxidacin y

deformacin. Olor: putrefacto, fecal, a cido sulfhdrico, a queso, a acido butrico. Aspecto:
textura blanda, dura. Consistencia: liquida, o viscosa; presencia de elementos extraos.
3. Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y los envases a analizar.
4. Flamear rpidamente la parte a ser abierta, en caso de estar las latas abombadas tomar
precauciones para evitar un peligro.
5. Abrir los envases con ayuda de un abrelatas o tijeras estril.
6. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de Petri la superficie expuesta al aire.
ANLISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA
1. Pesar 0,1 gramo del contenido de cada envase, homogenizando previamente a fin de que
la muestra sea representativa.
2. Disponer de 4 tubos con caldo Cerebro Corazn con almidn al 0,1% para el envase
incubado a 35C y 4 tubos para el envase incubado a 55C.
3. Adicionar el contenido pesado de cada envase en cada uno de los tubos con caldo cerebro
corazn con 0,1% de almidn.
4. Verter una capa de 1 cm de parafina estril o agar agar al 2% en 4 tubos (2 de los envases a
35C y 2 de los envases a 55C), con el fin de crear condiciones de anaerobiosis.
5. Una vez hecha la siembra, medir el pH con la ayuda de un potencimetro.
6. Incubar los 4 tubos de la lata a 35C y los 4 tubos de la lata a 55C (4 en aerobiosis y 4 en
anaerobiosis) durante 72 horas.
7. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez en el tubo.
8. Considerar que el producto es estril comercialmente o satisfactorio, cuando mximo un
tubo en aerobiosis muestra turbidez.
IV.

INTERPRETACIN

INCUBACIN EN CALDO BHI

V.

Si ninguno de los 4 tubos aerobios da positivo y ninguno de los 4 tubos anaerobios

muestra crecimiento, se reportar en el informe prueba de esterilidad comercial
satisfactoria.
Si hay crecimiento aerbico en el medio incubado a 35C para latas normales, indica
esterilidad no satisfactoria o contaminacin en el laboratorio.
Para descartar problemas ambientales se debe examinar si no hay crecimiento en los
tubos incubados a 55C; en este caso se debe verificar la muestra en cuanto a olor y
apariencia normal, pH o presencia de bacterias en el examen microscpico de la lata
original lo cual corroborara concepto de Prueba de esterilidad comercial no
satisfactoria.
Si hay crecimiento a 35C y ausencia de crecimiento a 55C confirman el concepto de
esterilidad no satisfactoria. Para este caso se debe sembrar en agar nutritivo a 55C y
confirmar la presencia de esporas despus de 75h causantes de una descomposicin
agria.
CUESTIONARIO

1. Consulte las normas y criterios existentes para el anlisis microbiolgico de conservas.

2. Investigue el mtodo para evaluar la esterilidad comercial de leche de larga vida.
3. Adems de la prueba de esterilidad comercial, qu otros ensayos de microorganismos
indicadores se pueden determinar en las conservas?

43

VI.

BIBLIOGRAFA

ESCOBAR DUQUE, Mara Beatriz. Programa de Microbiologa e higiene de los alimentos.

Medelln, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional de salud pblica Hector Abad Gmez,
1990. ca. 150h. QW85 E8-90.
MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Anlisis Microbiolgico de Alimentos.
Serie de Publicaciones cientficas No. 10 Santa fe de Bogot, 1998.

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TEMPORALIZACIN

Prctica

Sesin 1

Sesin 2

Sesin 3

Sesin 4

Sesin 5

Lectura
prueba
confirmativa
Siembra
en
placa (E. coli)

Pruebas
Lectura placas
bioqumica
Siembra para
Lectura
e
pruebas
interpretacin
bioqumicas
de resultados

Inoculacin e
Lectura
e
incubacin de
Factores fsicos
interpretacin
cepas
de resultados
microbianas
Preparacin
Preparacin de
de muestras y
muestras
y
Recuento
diluciones
diluciones
y
colonias
Siembra
en
RAM.
placa
Preparacin
de
las
Coliformes y E. muestras
coli
Siembra
prueba
presuntiva
Mohos
levaduras

Ambientes
superficies

Anlisis
agua

Salmonella

Listeria

ECSR

Lectura
prueba
presuntiva
Siembra
prueba
confirmativa

Preparacin
y de
las Recuento
muestras
colonias
Siembra
y

Toma
muestras
Siembra

de

de

Recuento
colonias

Filtracin,
de siembra
e Recuento
incubacin de colonias
muestras

de

de

de

Lectura
e
PreAislamiento
Siembra
en
Enriquecimien
interpretacin
enriquecimien
en
agar pruebas
to selectivo
de
pruebas
to no selectivo
selectivo
bioqumicas
bioqumicas
Lectura
e
Enriquecimien Aislamiento
Pruebas
de interpretacin
to selectivo
selectivo
confirmacin de
pruebas
bioqumicas
Preparacin
de
las Recuento
muestras
colonias
Siembra

de

45

S. aureus

Preparacin
de
las
muestras
Siembra

Recuento de
Siembra
en Lectura
e
colonias
pruebas
interpretacin
Siembra
en
bioqumicas
de resultados
medio general

Bacillus cereus

Preparacin
de
las
muestras
Siembra

Recuento de
Siembra
en Lectura
e
colonias
pruebas
interpretacin
Siembra
en
bioqumicas
de resultados
medio general

Esterilidad
comercial

Preparacin
Inspeccin,
de
las
Lectura
e
preparacin e muestras para
interpretacin
incubacin de su
anlisis
de resultados
las muestras microbiolgic
o

46