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EQUIPO 3.

Glvez Hernndez Omar


Flores Mendoza Brenda
Mortera Romero Paulina
Rivera Linares Beln
Cuestionario 1
PARTE I EXTRACCION Y PRECIPITACION POR SALADO
1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las protenas purificadas
Precisar secuencias de aminocidos
Investigar la funcin bioqumica
Aplicaciones teraputicas o biotecnolgicas
Establecer relaciones evolutivas
2. Dentro de la gua para purificar una protena se plantea que es importante
establecer cul va a ser el uso final de la protena purificada. Explica porque
Porque de acuerdo al uso que se le va a dar las cantidades requeridas y el costo es
diferente por lo tanto no hay procedimiento nico para la purificacin de protenas
3. Qu propiedades de la Lactato deshidrogenasa se provecharan en cada paso
de su purificacin?
Peso molecular: La informacin es til para detectar la protena a travs de
SDS-PAGE, tambin es importante cuando seleccionamos un mtodo de
filtracin en gel.
pl: seleccin de columna de intercambio inico, pH de trabajo
Solubilidad: Esto debe ser considerado para evitar la agregacin y
precipitacin de la protena.
Unin especfica: Ligandos tiles para separar la protena en cromatografa
por afinidad.
Estabilidad: Las caractersticas fsicas y qumicas de la protena son
importantes a lo largo del proceso
4. Por qu es importante mantener la mezcla de protenas a 4C?
Porque a una temperatura alta se podran desnaturalizar las protenas
5. De acuerdo con la reaccin que cataliza y su funcin el organismo Por qu
crees que se seleccion el musculo esqueltico de pollo para aislar la lactato
deshidrogenasa?
La LDH es una enzima que abunda en hgado, msculo esqueltico y eritrocitos;
tambin se encuentra en menor cantidad en corazn, rin y an menos en pncreas
y pulmn.
Se eligi el musculo esqueltico de pollo porque es fcil de encontrar, est en
abundancia y es barato.
6. Qu tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificacin y porque?
Columna de afinidad debido a que es una enzima y presenta afinidad especifica por
un cofactor (NAD+), se utilizara una resina de Cibacrn blue 3GA, y por este
mtodo normalmente se obtienen rendimientos altos y una mejor purificacin a
diferencia de intercambio inico y como eluyente se utilizara NAD+.

7. Existen varios mtodos en la literatura para purificar a la lactato


deshidrogenasa, Por qu existe esa variedad si todos purifican a la misma
protena?
Porque el mtodo de purificacin depende del uso final que se le dara a la protena
purificada.
8. Menciona al menos dos protenas que tienen actualmente un eso farmacutico
o mdico y cul es la fuente biolgica de la que se obtienen
Albumina, fuente biolgica hgado
Alfa glucosidasa, fuente biolgica materia vegetal

BIBLIOGRAFA.
http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/3825/1/58117A949.pdf
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?
action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=49
http://www.tuotromedico.com/temas/albumina_en_sangre.htm
https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/seccion2_815221.pdf
http://www.ehu.eus/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm
Cuestionario
PARTE II. PURIFICACIN POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO
INICO Y DE AFINIDAD
1. Por qu es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la o las fracciones con
alto contenido de sal en protocolo experimental antes de someterla a cromatografa de
afinidad o de intercambio inico?
Debido que en el proceso de desalado se retienen las sales, y la protena sale ms rpido
debido a su tamao as separndolas, tambin ayuda tener a la protena en condiciones
ptimas.
2. Cules otros usos tiene la cromatografa de exclusin molecular que no sea la de
ayudar a desalar una suspensin de protenas?
Cambios de buffers. Despus de cromatografas de intercambio inico, afinidad o
de interaccin hidrofbica.
Eliminacin de fenol de las preparaciones de cidos nuclicos.
Eliminacin de compuestos de bajo peso molecular marcados. I125, FITC de las
soluciones de marcaje de protenas.
Para reacciones entre macromolculas y reactivos de bajo peso molecular.
Eliminacin de productos, cofactores, inhibidores, etc. De las enzimas.
Purificacin de macromolculas.
Determinacin del peso molecular de las protenas.

3. Qu intervalo de fraccionamiento de molculas tiene el Sephadex-G25 y que


aplicaciones tiene?
Aplicaciones: se usa en cromatografa de afinidad, cromatografa de protenas y
cromatografa de filtracin en gel como tambin para estudiar la aceleracin de la
cicatrizacin de la herida diabtica y el tratamiento del dao epitelial.
Exclusion limite Mr 5000
4. Qu es el volumen vaco en una columna de filtracin en gel?
Volumen del disolvente del espacio que rodea a las molculas o tambin llamado volumen
existente entre las esferas del gel.
5. A qu se refiere el trmino volumen muerto en una columna cromatogrfica?
Volumen de fase mvil requerido para eluir una especie no retenida.
6. Investiga la composicin de la matriz de intercambio inico que se us para
purificar a la LDH.
Macro-pep High S de BIORAD
Grupo functional SO3Copolmero de cido metacrlico
7. De acuerdo con PI de la LDH, si contaras con una columna de intercambio aninico
como DEAE-celulosa, a qu pH mantendras a tu protena y a qu pH mantendras el
amortiguador para eluir a la protena de la columna? Fundamenta tu respuesta.
Mantendremos a la protena y el pH del amortiguador con un pH mayor a su punto
isoelctrico ya que la LDH estar cargada negativamente.
8. Qu propiedad de la protena se utiliza para purificar a la protena mediante una
columna de intercambio catinico?
EL Punto Isoelctrico.
9. Qu debe contener el eluyente para la purificacin del LDH en la cromatografa
de intercambio inico que se propone en este protocolo y por qu?
Amortiguador a diferentes concentraciones de NaCl y mediante las diferente fuerza inica,
la LDH eluira por la competencia de los componentes del amortiguador con la matriz por
los sitios de unin.
10. Qu propiedad de la protena ests utilizando para purificarla por cromatografa
de afinidad y cul es el componente clave para la purificacin de la LDH en esta
columna?
La capacidad de afinidad por su cofactor (NADH)
Bibliografa:
Anlisis Qumico Cuantitativo, D. Harris 3ra edicin pp 101-102

http://www.reallaboratory.com/protocols/Molecular%20Biology
%20Protocols/RBMS02_03.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g2580?
lang=en&region=US&gclid=CPPy3Zyfw8sCFVBffgodzusHuw

Cuestionario
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.
A. Determinacin de la concentracin de protenas
1. Compara ambos mtodos de cuantificacin de protenas utilizados en la prctica y
enlista sus diferencias. Considera tanto el fundamento de las tcnicas como la
metodologa para llevarlas a cabo.

Destructivo

Absorbancia a
280nm
No

Interferencias

DNA, RNA

Absorvancia

280
50g/mL a
2mg/mL

sensibilidad
Cuantificacin mezcla de
proteinas

Bradford
Si
Flavonoides, Detergentes,
Sulfato de amonio
595
1g/mL a 1.5 mg/mL

No

Si

2. Qu desventajas tiene determinar la concentracin de protena por Abs 280 con


respecto al mtodo de Bradford en muestras que tienen una cantidad variable de
protenas, como en nuestras fracciones de la purificacin del lactato deshidrogenasa?
Contaminacin por cidos nucleicos ya que tambin absorben en la Regin de
280nm.
El contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente en varias
Protenas.
La solucin debe ser clara e incolora ya que la Turbidez puede producir resultados
errticos
Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este mtodo ya que una
mezcla de protenas no pueden ser cuantificadas por los diferentes valores del
coeficiente de extincin molar de cada protena.
3. Qu sustancias pueden interferir en el mtodo empleado?
Flavonoides
Detergentes

Sulfato de amonio

4. Investiga el intervalo de concentracin de protenas que detecta el mtodo.


1 L/ml -1.5 mL /ml y es ms sensible que la medida de absorbancia a 280 nm
5. Por qu es necesario construir una curva de calibracin en la determinacin
colorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford?
Para determinar la concentracin de una sustancia (analito) en una muestra desconocida
basado en la comparacin de una relacin lineal entre la concentracin y la absorbancia de
una muestra conocida.
6. Investiga qu otro mtodo existe para cuantificar protenas y explica su
fundamento.

Mtodos de absorcin 280nm


Las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en uv, principalmente debido
a los residuos de triptfano y la tirosina de las protenas. Dado que cada protena tiene una
composicin nica de aminocidos aromticos, el coeficiente de extincin (e280) o su
absortividad molar (em) deben ser determinados para protenas individuales para la
estimacin del contenido protico.
Mtodo rpido y relativamente sensible (varias veces ms sensible que el mtodo de biuret)
,no existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer , no destructivo utilizado
en deteccin post-columna de las protenas.
Mtodos derivados colorimtricos
Biuret.- Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH
de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de
coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la
reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad

del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en


preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Lowry.- Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la
muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas.
Este mtodo consta de dos etapas:
1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un
color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el
cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos
da lugar a un complejo de color azul intenso.
BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura
intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo
analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas
con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo
proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy
sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos
Referencias.
https://analisisinstrumentalmeh.files.wordpress.com/2011/04/anc3a1lisis-delasprotec3adnas.pdf
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS
%20PARA%20LA%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE
%C3%8DNAS.pdf

Cuestionario
Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS
1En cul de los pasos de la purificacin se obtuvo una mayor cantidad de LDH?
En la fraccin purificada C mediante la cromatografa de afinidad.
2. Cul de los dos mtodos de purificacin cromatogrfica produce una mayor
cantidad de LDH, la cromatografa de afinidad o la de intercambio inico?
La cromatografa de afinidad ya que en la cromatografa de intercambio inico presentaron
varios contaminantes.
3. Usualmente, en una purificacin se utilizan la cromatografa de intercambio inico
y la de afinidad como pasos secuenciales, una despus de otra, pero por costos hemos
utilizado slo una de ellas. Con los resultados que obtuvo tu equipo y los otros
equipos, predice cul sera el resultado si primero se realizara la cromatografa de
intercambio catinico y luego la cromatografa de afinidad.
Se mejorara la purificacin de la LDH ya que por la cromatografa por intercambio inico
se podran eliminar las dos bandas que se observan en la parte superior del gel (presentes al
usar solo la cromatografa por afinidad) y con la cromatografa por afinidad se eliminaran
todos los contaminantes que se observo dejo la cromatografa por intercambio inico.
4. Cuntos contaminantes se tienen en la mezcla de protenas obtenida en el proceso
cromatogrfico final?
Se puede inferir que existen dos contaminantes por la presencia de dos bandas en la parte
superior del gel.
5. Elabora un esquema de purificacin para la protena malato sintasa a partir de
semillas de girasol. Para ello busca:
A) Cul es la funcin de la protena
Cataliza la condensacin y posterior hidrlisis de la Acetil-CoA y glicoxilato para formar
malato y CoA
B) En qu material biolgico se encuentra
Organismo.- Escherichia coli (strain K12)
C) En qu compartimento subcelular se encuentra
Locacin.- Citoplasma
D) Busca la informacin estructural y/o fisicoqumica de la protena.

E) Realiza un diagrama de flujo del protocolo de purificacin propuesto,


fundamentando el porqu de cada paso de purificacin, indicando en cada paso en
dnde est la protena. Recuerda que tiene caractersticas muy distintas a la lactato
deshidrogenasa por lo que no necesariamente se tienen que usar los pasos de
purificacin usados en este protocolo experimental.
Bibliografa:
o

UniprotKB P37330 (MASZ_ECOLI). Consultado el 16 de Marzo del 2016.


Disponible en: www.uniprot.org/uniprot/P37330

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