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(CURSO 2006/2007)
ÁREA DE INMUNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, GENÉTICA E INMUNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE VIGO
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PRÁCTICA Nº1
Un inmunógeno es cualquier sustancia que induce una repuesta inmunitaria. Todo los
inmunógenos son antígenos pero no todos los antígenos son inmunógenos. Aquellos antígenos
que no son capaces por si solos de causar una repuesta inmunitaria se denominan haptenos, son
moléculas de bajo peso molecular y deben conjugarse con una molécula “portadora” o “carrier”
que proporcione epitopes reconocibles por las células de sistema inmunitario.
1. T I P O S D E A D Y U V A N T E S
El antígeno libre suele dispersarse con rapidez desde los tejidos locales que drenan el sitio
de la inyección y una importante función de los adyuvantes es contrarrestar esto al proporcionar
un reservorio antigénico duradero, ya sea en una localización extracelular o dentro de los
macrófagos. Los principales adyuvantes son:
2. Preparar 200 µl del BSA en solución salina a una concentración final de 2 mg/ml.
(Concentración del antígeno 200 mg/ml)
3. Añadir en un tubo eppendorf 100 µl del adyuvante incompleto de Freund. Mientras se agita
el adyuvante, ir añadiendo gota a gota la solución antigénica (100 µl) Mezclar bien hasta
que se vea una emulsión pastosa.
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4. La emulsión ahora es espesa. Guardar en nevera a 4ºC.
Inyección: La concentración habitual para inyectar en una rata o ratón es de 50 a 100 µg.
Para un conejo la concentración varía entre 50 y 1000 µg. Antes de inyectarlo se debe diluir el
precipitado en salino con un volumen final de 250 µL.
Se requiere:
Inyección: La cantidad habitual para una rata o ratón es de 50-100 µg. Para un conejo
entre 50 - 1000 µg. Tomar la cantidad de antígeno necesario y añadir 109 unidades de B.
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pertussis (el preparado comercial inactivado por calor, contiene 20 x 10 unidades en 0.5 ml) e
inyectar al animal en un volumen final de 250 µl en salino.
2. V Í A S D E I N M U N I Z A C I Ó N
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intravenosa) y la rapidez o velocidad a la cual el inmunógeno debe ser liberado a los vasos
linfáticos y a la circulación.
• Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberación rápida del
antígeno en el ratón, la inyección se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola)
3. A N I M A L E S M Á S U T I L I Z A D O S
• Ratones: son animales de fácil manejo y son muy buenos para producir anticuerpos
monoclonales.
• Hámster: sobre todo para anticuerpos policlonales cuando tenemos poco antígeno.
• Cobayas (Guinea pigs): son animales bastantes pacíficos y sobre todo se utilizan para
producir anticuerpos policlonales.
• Pollos: sobre todo para obtener respuesta frente a antígenos de mamíferos muy
conservados.
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Dado que la respuesta de los animales va a ser diferente, deben de inmunizarse varios
individuos. En caso de los conejos se debe inmunizar al menos dos, siendo mejor 3 ó 4. En el
caso de los roedores se deben usar entre 3 a 6 animales.
4. NECESIDADES DE ANESTESIA
Tanto para la seguridad de los animales y de las personas que los manejan, como por
razones éticas, en todos los casos para la administración y la toma de muestras se debe sujetar e
inmovilizar a los animales correctamente y si es necesario, se debe de administrar anestesia
siempre que exista resistencia al manejo o suponga dolor a la administración de un producto o la
toma de muestras. En todos los casos debe de evitarse, en la medida de lo posible, producir
estrés o sufrimiento innecesario a los animales.
Excepto inmunógenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que sólo deben
inyectarse vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, el resto (proteína solubles, insolubles,
carbohidratos y ácidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa además de las vías
anteriores.
1. OBTENCIÓN DE SUERO
Se sangra el ratón por el plexo retrorbital con la ayuda de una pipeta Pasteur o un capilar,
obteniendo unos 500 µL de sangre. Se deja la sangre 1 hora a 37 ºC o toda la noche a 4ºC para
obtener la retracción del coágulo. Finalmente se centrifuga la sangre 5 min. a 13.000 r.p.m. para
separar el suero del coagulo.
2. D E T E R M I N A C I Ó N D E L A C O N C E N T R A C I Ó N D E A N T I C U E R P O S
FRENTE A BSA: ELISA INDIRECTO.
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El ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) es una técnica cuantitativa, que se
basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una señal o una reacción enzimática cuyo producto, puede ser
medido espectofotométricamente. Hay diversos tipos de ELISAS (directos, competitivos,
indirectos, tipo sandwich, etc..)
El ELISA indirecto consiste en inmovilizar el antígeno (en nuestro caso BSA) en un soporte
físico y los anticuerpos que capturan el antígeno (suero de ratón) se revela con un segundo
anticuerpo (anti-inmunoglobulinas de ratón) acoplado a una enzima. Este tipo de ELISA se utiliza
cuando se dispone de un antígeno puro o razonablemente purificado. Las fases para realizar un
ELISA son:
• Inmovilización del antigenos a un soporte sólido: Incubar a 4ºC durante toda la noche el
fondo de una placa de 96 pocillos con 50 µL de BSA a una concentración de 2µg/mL (5ml de
BSA)
• Bloqueo: Para evitar uniones inespecificas, bloquearemos los huecos libres del fondo del
plastico con proteina leche. Añadir a cada procillo 150 µL de leche al 1% en PBS (15ml por
placa) y dejar incubar a 4ºC durante toda la noche. Lavar la placa tres veces con PBS.
• Recta patrón, muestras, blancos, control positivo: en la placa de ELISA se va a colocar por
triplicado un blanco, un suero del ratón antes de inmunizar, un control positivo y el suero del
ratón despues de inmunizado, según el siguiente esquema:
- En los pocillos A1, A2 y A3 se añaden 50µL de PBS con 1% de leche a cada uno de los
tres pocillos. Será nuestro blanco, nos dará el fondo.
- En los pocillos A7, A8 y A9 se añaden 100 µL del suero del ratón antes de inmunizar, y
se hacen diluciones seriadas a lo largo de las columnas 7, 8 y 9.
- En los pocillos A10, A11 y A12 se añaden 100 µL del suero del ratón despues de
inmunizar, y se hacen diluciones seriadas a lo largo de las columnas 10, 11 y 12.
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Esquema:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanco Blanco Blanco 1/64 1/64 1/64 Pre In. Pre In. Pre In. Pos In. Pos In. Pos In.
B Positivo Positivo Positivo 1/128 1/128 1/128 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
C Recta Recta Recta 1/256 1/256 1/256 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4
D 1/2 1/2 1/2 1/512 1/512 1/512 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8
E 1/4 1/4 1/4 1/1024 1/1024 1/1024 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16
F 1/8 1/8 1/8 1/2048 1/2048 1/2048 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32
G 1/16 1/16 1/16 1/4096 1/4096 1/4096 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64
H 1/32 1/32 1/32 1/8192 1/8192 1/8192 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128 1/128
• Lavados: Lavar la placa con PBS tres veces. No se debe dejar que la placa se seque.
• Lavados: Lavar tres veces la placa con PBS. No se debe dejar que la placa se seque.
• Revelado y lectura de la Absorbancia: Unos minutos antes del lavado se debe disolver 75µL
ABTS al 20X en 1,5 mL de buffer citrato 0.1 M pH 4.3 (0,55 mg/ml) Añadir a esta mezcla 3
gotas de agua oxigenada y mezclar bien. A continuación, añadir 50 µL de esta solución en
cada uno de los pocillos y dejar que la reacción de color ocurra (esperar entre 5-10 min) Parar
la reacción añadiendo 50 µL de acido cítrico 0.1 M con 0,01% de azida sódica y leer en el
lector de ELISA a 450 nm.
¿Por qué no interfiere la albúmina presente en la leche con la albúmina que pegamos al
fondo del pocillo?
Existen dos tipos: cabinas de flujo vertical el usuario queda protegido por una pantalla de
vidrio o plástico transparente, el personal solo introduce los brazos y todo el material de trabajo
dentro de la cabina; y las cabinas de flujo frontal el aire cargado con aerosoles del cultivo es
proyectado hacia el usuario, no está recomendada para trabajar con material infeccioso, se usa
prácticamente en cultivo de tejidos vegetales. Todo el material que se introduce dentro de la
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cabina: gradillas, recipientes, micropipetas, etc. debe ser esterilizado o limpiarse con etanol al
70% o con una solución antiséptica.
2. Coger el vial del congelador y pasarlo directamente al baño con mucho cuidado y
mantenerlo en movimiento (hasta que quede una pequeña bolita de hielo). Limpiar el vial
con etanol. Rápidamente llevar el vial a una caja con hielo y llevarla a la cabina de flujo
laminar.
3. Recoger las células con una pipeta Pasteur y pasar las células al tubo de 15ml preparado
anteriormente. Centrifugar a 1.200 r.p.m. durante 5 min.
5. Pasar 500 µL al pocillo A1 de la placa de 24, poner 250 µL en los pocillos A2y A3. Rellenar
con medio hasta un volumen final de 2 mL.
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PRACTICA Nº2: GENERACIÓN, SUBCLONACIÓN Y EXPANSION DE
HIBRIDOMAS: ANTICUERPOS MONOCLONALES.
I. Inmunización del animal con un antígeno: Se realiza una primera inmunización y luego se
realizan varias inmunizaciones de recuerdo. El número y la frecuencia de las inmunizaciones
es variable. Por último se da una inmunización de refuerzo (booster) tres días antes de
sacrificar al animal. Las vías de inmunización pueden ser subcutánea, intraperitoneal, y en
ocasiones, intravenosa. Si tenemos poco antígeno o es poco inmunogénico se puede
inmunizar directamente en el bazo o en los nódulos linfáticos.
II. Fusión celular: se va a realizar entre los linfocitos del bazo del animal inmunizado (aporta la
especificidad del anticuerpo) y una línea celular tumoral (mieloma) que aporta la inmortalidad.
El mieloma no debe de producir inmunoglobulinas propias, debe de ser capaz de inducir la
fusión con alta eficacia y poseer los marcadores necesarios para seleccionar las células
fusionadas (gen HGPRT deficiente) en el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La
fusión celular se ve favorecida por el polietilenglicol (PEG).
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PROTOCOLO DE FUSIÓN Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS
Se deben descongelar unos diez días antes y cuando ya tengamos las monocapas bien
formadas en Flasks grandes, se pasan a los “roller” (se deben poner unos cinco días antes de la
fusión), se deja una noche sin mover para que se forme una monocapa e irles cambiando el
medio todos los días, aumentando el volumen, en caso de que el día anterior a la fusión no
tengamos células suficientes no quitar todo el medio al cambiarlo.
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4 . Ir añadiendo muy lentamente (gota a gota) y moviendo el pellet con la pipeta de cristal 1
ml de PEG a 37ºC (Merck PEG, MW 1500 en 10 mM Hepes y 0,85% salino)
5 . Seguir moviendo las células con la misma pipeta durante 2 min.
6 . Preparar dos tubos con 10 y 12 mL de DMEM sin FCS a 37ºC.
7 . Añadir 1 mL del tubo de 10 mL en 1 min. (moviendo la pipeta), repetir. Añadir de la misma
forma otro mL en 30 s , repetir. Añadir el resto de los 10 mL en 2 min.
8 . Añadir los 12 mL gota a gota, sin mover la pipeta ni el tubo. Mantener a 37ºC durante 20-
30 min.
9. Centrifugar las células durante 5 min. a 1.200 r.p.m. Resuspender el pellet en 12 mL de
DMEM al 20% FCS/HAT.
10. Se plaquea en una placa de 24 pocillos de la siguiente manera:
• FILA A: 1 mL en cada pocillo de los 12 iniciales (dilución 1/1) Nos sobran 6 mL y
añadimos otros 6 mL de DMEM al 20% FCS/HAT.
• FILA B: repartimos 1 mL en cada pocillo (dilución ½) Nos quedan 6 mL y añadimos
otros 6 ml de medio DMEM al 20% FCS/HAT.
• FILA C: repartimos 1 mL en cada pocillo (dilución 1/4) Nos quedan 6 mL y
añadimos otros 6 ml de medio DMEM al 20% FCS/HAT.
• PILA D: repartimos 1 mL en cada pocillo.
Añadimos en todo los pocillos 1 mL de medio DMEM al 20% FCS/HAT, de forma que el
volumen final de todos los pocillos sea de 2 mL.
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PRÁCTICA Nº3: PICAR CLONES
Bajo una lupa y en la cabina de flujo laminar se observa la placa de 24 pocillos resultante
de la fusión celular y se transfieren individualmente cada unos de los clones a un pocillo de la
placa de 24. Picar 48 clones y llevar los pocillos con medio DEMEM al 20% de FCS/HAT hasta un
volumen final de 2 mL.
A. PBS 1X
B. Filtros: MILLEX
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D. MTT (Sigma M5655)
E. HCl 5N
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Esquema:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200MIL 200MIL 200MIL SOLO SOLO SOLO
A CÉLULAS CÉLULAS CÉLULAS MEDIO MEDIO MEDIO
SOLO SOLO SOLO
B 1/2 ½ 1/2
MEDIO MEDIO MEDIO
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
C 1/4 ¼ 1/4
CON FCS CON FCS CON FCS
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
D 1/8 1/8 1/8
CON FCS CON FCS CON FCS
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
E 1/16 1/16 1/17
SIN FCS SIN FCS SIN FCS
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
F 1/32 1/32 1/32
SIN FCS SIN FCS SIN FCS
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
G 1/64 1/64 1/64
CON TX100 CON TX100 CON TX100
C.+ MEDIO C.+ MEDIO C.+ MEDIO
H 1/128 1/128 1/128
CON TX100 CON TX100 CON TX100
B. PRACTICA Nº 5:
3. Solubilizar por aspiración repetida con la ayuda de la micropipeta hasta conseguir que el
precipitado se disuelva y el medio coja un color azul-violáceo. Medir la absorbancia a
570nm. La absorbancia detectada es proporcional a la proliferación.
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