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INTRODUCCIÓN
Por su minúsculo tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es
necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su
multiplicación in Vitro, en ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus
hábitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfieren
en el estudio del microorganismo de interés, al que además de proporcionar los nutrientes necesarios
para su crecimiento multiplicación.
OBJETIVOS:
En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la
experimentación. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio.
La rápida multiplicación de estas diminutas criaturas constituye también una ventaja experimental, ya que
se puede trabajar con muchas generaciones en un solo día, Es más, los conocimientos adquiridos en el
estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y
animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es
usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio.
La esterilización
La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los
microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad
dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de
materiales estériles. Entre éstos podemos destacar:
° La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir
el riesgo de infecciones en pacientes.
° El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado
en los laboratorios de microbiología.
° La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de
microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos,
cosméticos, alimentos, etc.)
Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método a aplicar en cada caso está
determinada por el tipo de producto a esterilizar.
1) Agentes físicos
El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor húmedo el cual destruye a los
microorganismos por desnaturalización de las proteínas y el calor seco que destruye a los
microorganismos por oxidación de sus componentes celulares. El calor es considerado como el método
de esterilización por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin
sufrir ningún tipo de daño.
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La radiación, o emisión y propagación de la energía a través
de un medio, puede ser utilizada como agente para la
eliminación de microorganismos. Así tenemos que las
radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización
de materiales termolábiles, como por ejemplo materiales
plásticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz
ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas
cerradas.
Esterilización con calor húmedo: El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz para
la destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada
por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas
reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:
Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como la
gelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguiente
procedimientos:
o Tindalización: hace uso del calor húmedo, para una buena esterilización se debe
realizar a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día.
o Ebullición: es el paso de un líquido al estado de vapor. El agua en ebullición representa
en forma eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel de
instrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al
hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, los
virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas.
o Pasteurización: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar las
temperaturas por ejemplo: 62ºC por 30 min.; 70ºC por 15 min. Se utiliza para preservar
alimentos como ser leche, cerveza.
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Vapor a presión: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como
grados de temperatura y tiempo de exposición, que junto con el tamaño del autoclave y el flujo del
vapor, la densidad y el tamaño de la carga en la cámara aumentan la tasa se muerte de los
microorganismos, en una temperatura de 121ºC – 132ºC durante 15 minutos o más.
Ventajas:
° Es más fácil segura y eficaz
° El uso del vapor es el procedimiento más rápido, el ciclo total de tiempo es más corto
° Es más barato y de obtención más fácil
° La mayoría de las autoclaves poseen controles automáticos y dispositivos de control
Desventajas:
° Se requiere mucho cuidado en la preparación y confección de bultos, en la carga y manejo del
autoclave, así como el secado de los artículos
° Los artículos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
° El vapor tiene que estar en contactó directo con todas las partes de los artículos
° Los ciclos de tiempo se ajustan según el tipo de material y tamaño de la carga
° El vapor puede no ser puro
Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. Los objetos
deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno
de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una
bolsa seca, donde la esterilización no será efectiva.
b) Esterilización por radiación: La ionización por radiación genera iones al liberar electrones de los
átomos, estos se desprenden violentamente con átomos adyacentes y se une a ellos, o bien se
desprenden del segundo átomo. La energía liberada se transforma en energía térmica o química la cual
causa la muerte de los microorganismos al romper la molécula del ADN e impide la división molecular y la
propagación de la vida. Las principales fuentes de radiación ionizante son las partículas Beta y rayos
gamma.
Ventajas:
° Penetra la morí parte de todos los materiales para esterilizarlos con confiabilidad
° Es el método de esterilización más eficaz
° No genera radiación residual
° Penetran en objetos grandes y voluminosos
2) Agentes mecánicos
Filtración: Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es
lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos
termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden
esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en un líquido. Técnicamente, la filtración no esteriliza
porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los
estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio.
Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas están compuestas de
nitrocelulosa, con un poro de diámetro constante. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa,
que también se utiliza como explosivo. El diámetro de poro es aproximadamente 0,45 µm; este tamaño es
lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y
algunas bacterias muy pequeñas. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana
acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío; los
microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtración es el método de elección para
esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los
medios.
3) Agentes químicos
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Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad
de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los
microorganismos (proteínas, membranas, etc.)
Esterilización por gas oxido de etileno: Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes
comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El
poder bactericida depende de la concentración del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de
exposición. La actividad esporicida se produce por aniquilación de los grupos terminales hidroxilo,
carboxilo, amino y sulfridrilo.
Ventajas:
° Es un buen sustituto eficaz cuando los artículos no pueden ser esterilizados por calor
° Es anticorrosivo y no daña el material
° Penetra totalmente todo el material poroso
° No deja película sobre los instrumentos
Desventajas:
° Es un proceso complicado por lo que se debe usarse indicadores biológicos
° La esterilización lleva más tiempo, es un proceso lento y largo
° Necesita equipo especial y costoso
° Puede formar productos secundarios tóxicos
° Necesita ser ventilado por lo menos 24 horas
° Por frecuentes esterilizaciones pueden formar y aumentar residuos totales de gas en artículos
porosos
° En contacto con la piel produce vesículas y aún quemaduras
° Si se inhala puede ser irritante para las mucosas
Desventajas:
° Puede ser irritante, por lo tanto se debe enjuagar exhaustivamente con agua estéril
° Es una solución con olor
° Es costoso
Todos los procesos de esterilización se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para
ello se pueden utilizar indicadores físicos, químicos y/o biológicos, los cuales deben ser colocados en
cada carga de esterilización.
Indicadores físicos
Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores de presión y los termómetros los
cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de esterilización. También existen
los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer
durante cuánto tiempo ésta se mantuvo.
Indicadores químicos
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La mayoría de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas
cintas están impregnadas con una sustancia química que cambia de color cuando el material ha sido
sometido al proceso de esterilización. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que
muchas veces sólo indican que se llegó a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo ésta
se mantuvo. También existen cintas diseñadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas
cintas son un poco más seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilización fue el adecuado.
Indicadores biológicos
Son preparaciones de una población específica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente
resistentes a un proceso de esterilización en particular.
Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilización, en el sitio que se considera que
es más difícil que llegue el vapor y después del proceso, se deben incubar durante 24 horas en
condiciones adecuadas. Si después de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por
ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el proceso de esterilización no fue satisfactorio.
Con este tipo de indicadores se controlan la esterilización por vapor a presión, por calor seco y la
esterilización con óxido de etileno.
Una vez que un material está estéril puede mantener esta condición si está protegido en la forma
apropiada. Es decir, la duración de la esterilidad de un material no está relacionada directamente con el
tiempo, sino con factores que comprometen su exposición al medio ambiente.
Los materiales estériles pierden su esterilidad:
° Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su
transporte o almacenamiento.
° Al humedecerse el material de empaque.
Es importante no manipular los materiales estériles con las manos húmedas, ni colocarlos sobre
superficies mojadas. Al almacenar los materiales estériles se deben tomar una serie de precauciones,
tales como:
Medios de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones
físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el
Laboratorio de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso,
asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser
preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un
medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.
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Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
° Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las
que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se
conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
° Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida
cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. (Para bacterias
como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)
° Líquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente útiles para hacer diluciones, para
homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas
liofilizadas.
° Sólidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que
es posible observar las características típicas de un solo tipo de microorganismo.
° Semisólidos: Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a
0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaerofílicos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes
básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo
deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además
de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
∼Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren
productos de calidad.
∼Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
∼Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
∼Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización.
∼Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que
señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25_), con poca humedad
y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra
fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o
decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a
menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados
para evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura
de papel (Craft).
Definiciones:
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Asepsia: es la ausencia de microorganismos, un estado libre de gérmenes. Conjunto de procedimientos
que impiden la llegada de microorganismos a un medio, por ejemplo: técnicas de aislamiento, etc.
Antisepsia: proceso de destrucción de los microorganismos contaminantes de los tejidos vivos. Conjunto
se procedimientos destinados a destruir a los gérmenes patógenos o no patógenos, por ejemplo:
antisépticos, etc.
Contaminado: se refiere a toda superficie, animado o inanimada, que se sabe aloja microorganismos.
Desinfección: es el uso de procedimientos físicos o químicos para destruir a la mayoría de los
microorganismos: bacterias y otros microorganismos relativamente resistentes por ejemplo
mycobacterias, virus lipídicos, hongos.
Esterilización: la esterilización es la destrucción total de todos los microorganismos, incluso de las formas
más resistentes como esporas bacterianas, virus no lipídicos y hongos. Con el uso de los procedimientos
físicos o agentes químicos.
Limpieza: reducción sustancial del contenido microbiano, sin que llegue a la desaparición completa de los
microorganismos patógenos
Séptico: presencia de microorganismos patógenos en los tejidos vivos.
MATERIAL:
EQUIPO:
SUSTANCIAS:
*Composición: Peptona de gelatina (10g), lactosa (5g), sacarosa (5g), fosfato dipotásico (2g), agar
(13.5g), eosina (0.4g) y azul de metileno (0.065g).
*pHf = 7.2 ±0.2
*Composición: Peptona de caseína (17g), peptona de carne (3g), lactosa (10g), mezcla de sales
biliares(1.5g), NaCl (5g), rojo neutro (0.03g), cristal violeta (0.001g), agar-agar (13.5g).
*pH (37ºC) = 7.1 ±0.1
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puntiformes de Streptococcus fecales (enterococos) de color rojo y de algunos estafilococos cuyas
colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido.
∼Puede usarse en la diferenciación de Mycobacterium.
*Composición: Extracto de carne (1.0g), mezcla de peptonas (10.0g), NaCl (75g), D-Manitol (10.0g), agar
(15.0g), rojo de fenol (0.025g)
*pHf = 7.4 ±0.2
∼Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales clínicos diversos
(orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.).
∼La degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio de rosado a amarillo.
∼Debido a su alto contenido de NaCl, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio.
Generalmente se incuban las placas unas 36hrs. Apareciendo las colonias de estafilococos no
patógenos de tamaño pequeño y rodeadas de una zona roja; en cambio las colonias de estafilococos
patógenos fermentadores del manitol, dan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla.
Caldo nutritivo
∼Es un medio líquido, elaborado de acuerdo a la fórmula del APHA y en el cuál se pueden desarrollar
gran variedad de microorganismos que no son muy exigentes en cuanto a sus necesidades
nutricionales.
∼Se emplea ampliamente en muchos procedimientos de laboratorio, tal y como viene preparado o bien
adicionado de indicadores, carbohidratos, líquidos orgánicos, sales, etc.
Medio SIM
*Composición: Peptona de caseína (20.0g), peptona de carne (6.1g), sulfato de hierro y amonio (0.2g),
tiosulfato de sodio (0.2g), agar (3.5g).
*pHf = 7.3 ±0.2
PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS:
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Pesar 9g Hidratar:
MEDI y colocar Agregar
O en un 250ml de
EMB matraz agua
destilada
Homogenizar:
Con calor y agitación (ya
Esterilizar: que contiene Agar);
(en matraz y mezclar y dejar en reposo
autoclave) a no 5min. Calentar agitando
más de 121ºC frecuentemente y hervir
durante 15min. durante 1min. Aprox.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
CONCLUSIONES:
Por medio de esta práctica al investigar la teoría y realizar la preparación de un medio de cultivo, se logró
la elaboración adecuada de los mismos, así como la selección apropiada para el uso que se les dará
posteriormente a los medios del método de esterilización que eliminaría los restos microbianos que
pudiesen haber quedado en el medio de cultivo ya que si existe alguno de estos, ya no sería adecuado
para el uso que se le pudiera llegar a dar.
También se observó (con la teoría) que de acuerdo al tipo de bacteria que se requiera sembrar, será el
tipo de medio de cultivo, esto, ya que cada bacteria requiere cierto tipo de nutrientes para subsistir y
formar sus colonias, además de que cierto tipo de medios de cultivo, nos pueden mostrar de acuerdo a su
composición ciertas características que presentan determinado tipo de bacterias, ya sea por su pH y que
este sea indicado por los indicadores de los medios o por que reaccione con ciertos componentes del
medio creando colores o formas.
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Por último, se aprendió a envolver correctamente los medios de cultivo y que estos cuando se almacenan
en cajas de petri deben colocarse inversamente para evitar su deshidratación por evaporación y de esta
manera no tener que desechar las muestras.
REFERENCIAS:
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