UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CUIENCIAS VETERINARIAS

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA VETERINARIA
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA E INMUNOLOGIA

PRACTICA: MUESTRAS DE LECHE Y AGUA

• Determinación del Numero más Probable de
Coliformes Totales, Coliformes Fecales y Escherichia coli
Recuento de Aerobios Mesófilos
OBJETIVOS:
1. Esta práctica contempla los métodos de ensayo para la determinación del
Número Más Probable (NMP) de bacterias coliformes, y de coliformes fecales en
muestras de leche y muestras de agua potable, mediante la utilización de medios
líquidos.

2. Igualmente contempla el método a emplear para la determinación cuantitativa de

microorganismos aerobios en alimentos, mediante la utilización de placas de petri y un
medio de cultivo apropiado.

DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES

TOTALES, DE COLIFORMES FECALES Y Escherichia coli EN
MUESTRAS DE LECHE

NORMAS COVENIN A CONSULTAR:

COVENIN 1126-89 Alimentos.
Codificación y preparación de muestras para el análisis microbiológico

PRINCIPIO DEL ENSAYO

El método consiste en colocar determinadas cantidades de muestra y/o sus
diluciones, en cada uno de 3 ó 5 tubos de ensayo con tubos de fermentación
incorporados y un medio de cultivo apropiado. Después del período de
incubación a la temperatura correspondiente, se toma nota de los tubos que
presentan formación de gas y se confirman en un medio de cultivo apropiado.

PROCEDIMIENTO

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE

COLIFORMES TOTALES

Para la realización de este ensayo utilizaremos el siguiente método:

- Se inocula cada uno de 3 o 5 tubos de ensayo (que contengan caldo lauril
sulfato triptosa con tubo de Durhan) con 1 ml de la muestra y/o diluciones de
la misma. Se incuban a 35ºC - 37ºC por 24 a 48 horas.

- De cada tubo que presente gas (+) se transfiere un asa del cultivo a tubos
que contengan caldo lactosa bilis verde brillante al 2 % con tubo de Durham,
o se repica por estrías a placas que contengan agar Levine (EMB) o agar
Endo.

- Se incuba de 35 a 37ºC por 24 a 48 h y se observa la producción de gas o la

formación de colonias negras o púrpura oscuro, colonias mucoides, rosadas
con centro oscuro en el agar Levine (EMB), o colonias rojas rodeadas de
halos rojos en el agar Endo.

- La formación de gas en los tubos de caldo LBVB o la formación de colonias

características en las placas como se describió anteriormente, confirma la
presencia de organismos coliformes.

- Los tubos positivo de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) que fueron
confirmados como coliformes en caldo LBVB o en placas de agar Endo o
Levine, se anotan como positivos y los resultados se llevan a la tabla del
NMP que corresponda. (ver anexo)

DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES FECALES

Para la realización de este ensayo, se utilizará el siguiente método:

- A partir de los tubos de gas (+) en caldo Mac Conkey ó Caldo Lactosa Bilis
Verde Brillante (CLBVB) tubo de Durham, se inoculan con una asa,
respectivamente:
a.- Un tubo que contenga caldo lactosa bilis verde brillante al 2 % con tubo
Durham.
b.- Un tubo que contenga agua peptonada o caldo triptonado.

- Se incuban en baño de maría 44,5ºC ±0.1 º C por 24 a 48 horas.

- Se observa si hay formación de gas en los tubos de caldo LBVB y se

investiga la formación de indol, añadiendo 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovacs
al cultivo en agua peptonada o caldo triptonado al cabo de 24 h; el resultado
es positivo si se observa coloración roja en la capa alcohólica.

- Se consideran positivos los cultivos que den gas e indol. Estos resultadoss
(tubos positivos) se llevan a la tabla del NMP que corresponde (ver anexo).
 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Los resultados del NMP de Coliformes Totales y de coliformes fecales, se

expresan por mililitro o por gramo según la muestra haya sido medida o
pesada.

Para la expresión de los resultados, se deben tomar en cuenta las siguientes

consideraciones:

- Si no se emplean volúmenes correspondientes a aquellos expresados en la

tabla (0.1; 0.01 y 0.001 ml) el resultado se debe multiplicar por la dilución
intermedia y dividirse por 100:

NMP/g o ml: Nº obtenido en la tabla X Dilución intermedia

100

- Cuando se emplean más de 3 series de la muestra y/o diluciones diferentes

de la misma, los resultados que se llevan a la tabla del NMP son los
correspondientes a 3 series consecutivas; tomando como primera aquella
que presente todos los tubos positivos.
- Cuando ninguna de las series presente ésta condición, se tomará aquella
cuya dilución intermedia muestre tubos positivos.

- En caso de que todos los tubos sean positivos, se tomarán en cuenta las
series de diluciones más altas de la muestra; expresándose el resultado
como estimado del NMP, "más de" el número de la tabla, multiplicado por la
dilución intermedia.
 TABLA Nº 1
Número Más Probable (NMP) por 1 g de muestra y 95% de límites de confianza
Usando tres tubos con porciones de 0,1; 0,01 y 0,01 g
Número de tubos positivos NMP NMP límite
0,1 0,01 0,001 /g ó /ml Más bajo Más alto
0 0 0 <3
0 0 1 3 0.5 9
0 1 0 3 <0.5 13
1 0 0 4 <0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1.300
3 3 1 460 71 2.400
3 3 2 1.100 150 4.800
3 3 3 >2.400
DETERMINACIÓN DEL NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES
TOTALES, DE COLIFORMES FECALES EN MUESTRAS DE AGUA
POTABLE

NORMAS COVENIN A CONSULTAR

COVENIN 1126-89 Alimentos. Identificación y preparación de muestras para el
análisis microbiológico
COVENIN 2614-89 Agua Potable. Toma de muestras

OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta Norma Venezolana contempla el método de ensayo de rutina para la
determinación del número más probable de bacterias coniformes en agua
potable.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

El método consiste en inocular volúmenes conocidos de una muestra de agua
potable en c/u de 5 ó 10 tubos de ensayo, con un medio de cultivo no selectivo,
doble concentrado, y con tubos de fermentación incorporados. Después del
período de incubación se observan los tubos que presentan formación de gas
y/o turbidez, se confirman en un medio de cultivo selectivo, y se obtiene el NMP
de bacterias coniformes, utilizando las tablas diseñadas para tal fin.

PROCEDIMIENTO
PRUEBA PRESUNTIVA

a.- Se inoculan volúmenes de 10 ml de muestra en cada uno de 5 tubos que

contengan caldo lauril sulfato triptosa doble concentrado con tubo de
fermentación invertido. Se mezcla suavemente.
Nota: Si se requiere mayor precisión en el método, se inoculan 10 tubos

b.- Se incuban a 35 +/- 0,5ºC. Después de 24 +/- 2 h, agite suavemente cada

tubo y observe la aparición de gas y turbidez, si ambas son negativas se
reincuban por 24 +/- 2 h adicionales.

c.- Se consideran como tubos positivos en la prueba presuntiva aquellos que

presenten cualquier cantidad de gas en el tubo Durham y/o turbidez en el
medio de cultivo, después de 24 a 48 horas de incubación.

PRUEBA CONFIRMATIVA

a.-. Se agita suavemente cada uno de los tubos positivos de la prueba anterior, y
se transfiere una asada del cultivo a tubos que contengan caldo lactosa bilis
verde brillante (2%), con tubo de fermentación invertido.

b.- Se incuba a 35 +/- 0,5ºC durante 48 horas.

 c.- Finalizado el periodo de incubación se consideran como tubos positivos en la
prueba confirmatoria aquellos donde se observa la aparición de gas.

d.- Se cuenta el número de tubos positivos obtenidos y el resultado se lleva a las

tablas de número más probable que corresponda (ver tabla anexa)

EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El resultado se expresa como número más probable de bacterias coliformes

por 100 ml de muestra.

En caso de que todos los tubos sean negativos, el resultado se expresa como
“menos de 2,2 o menos de 1,1” según se hayan inoculado 5 ó 10 tubos
respectivamente.

En caso de que todos los tubos sean positivos, el resultado se expresa como
“más de 16 o más de 23” según se hayan inoculado 5 ó 10 tubos
respectivamente.

Tabla 2
Indices de NMP y límites de confianza de 95% para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5
tubos inoculados con 10 ml de muestra de agua potable
Nº de tubos Indice NMP/100 ml Limite de confianza de 95%
positivos Inferior Superior
0 ≤ 2,2 0 6
1 2,2 0,1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29,4
4 16 3,3 52,9
5 ≥ 16 8 infinito

Tabla 3
Indices de NMP y límites de confianza de 95% para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos, cuando se utilizan
10 tubos inoculados con 10 ml de muestra de agua potable
Nº de tubos Indice NMP/100 ml Limite de confianza de 95%
positivos Inferior Superior
0 ≤ 1,1 0 3
1 1,1 0,13 5,9
2 2,2 0,36 8,1
3 3,6 0,69 10,6
4 5,1 1,3 13,4
5 6,9 2,1 16,8
6 9,2 3,1 21,1
7 12 4,3 27,1
8 16,1 5,9 36,8
9 23 8,1 59,5
10 ≥ 23 13,5 Infinito
 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS EN PLACAS
DE PETRI (Norma COVENIN 902-87)

PRINCIPIO DE ENSAYO.

El método consiste en mezclar un volumen dado de una muestra

representativa y homogénea del alimento a examinar o de diluciones de la misma
con un medio de cultivo en placas de Petri. Después del período de incubación, se
determina el número de unidades formadoras de colonias (ufc) de las bacterias
mediante un contador de colonias.

PROCEDIMIENTO

1.- El material a ensayar consiste en una muestra representativa del alimento y

dicha muestra deberá codificarse y prepararse según la norma COVENIN 1126.
(ver anexo)

2.- Previo al análisis, las muestras deben mantenerse en condiciones apropiadas.

Todo el análisis debe realizarse en condiciones de asepsia. A partir de la primera
dilución obtenida se prepararán las diluciones necesarias utilizando el diluente
apropiado.

3.- Se coloca 1 ml de la muestra original ó 1 ml de las diluciones respectivas según

sea el caso, en placas de Petri por duplicado

4.- Se añade a cada placa de 12 a 15 ml del medio de cultivo previamente fundido

y temperado a 45ºC - 50ºC. Se mezcla convenientemente y se deja solidificar por 8
a 10 min. Sobre una superficie plana. No deben transcurrir más de 20 min. Desde
el momento de la preparación de la dilución hasta el agregado del agar.

5.- Se invierten las placas y se incuba bajo las condiciones siguientes:1

Tipo de Microorganismo Temperatura Tiempo

Psicotróficos 7ºC +/- 1ºC 10 días
Mesófilos 32ºC +/- 1ºC 48h +/- 3h
Termófilos 55ºC +/- 1ºC 48h

6.- Finalizado el período de incubación, se seleccionan preferentemente las

placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias. Con la ayuda de un cuenta
colonias o en su defecto, una lente de aumento, se cuentan todas las colonias,
incluyendo las que se observan como pequeños puntos, y se anota la dilución
correspondiente. Evite contar como colonias, partículas de muestras o pequeñas
burbujas.

1
NOTA: Debe mantenerse la humedad necesaria dentro de la estufa para prevenir la deshidratación del agar
(Las placas con el agar no deben perder más del 15% de su peso original)
7.- Si las placas de todas las diluciones tiene más de 300 colonias, se seleccionan
aquellas que tengan el valor más cercano a 300.

8.- Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 300 colonias, se
seleccionan aquellas que tengan el valor más cercano a 30.

9.- El número de colonias promedio de las dos placas de una misma dilución se
multiplica por la dilución correspondiente y este será el resultado final.

10.- Si placas de dos diluciones decimales consecutivas presentan entre 30 y 300

colonias, se multiplica cada recuento por la dilución correspondiente, se establece
el promedio y éste será el resultado final. Si el recuento más alto es superior a dos
veces el más bajo, se descarta y se toma como resultado el valor más bajo.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS.

Los resultados se expresan como recuento estándar por mililitro (ml) o gramo (g)
de muestra.

El número de colonias obtenido según 7 y 8, se multiplica por la dilución

correspondiente y se expresa como "Estimado del recuento estándar".

Si no hay colonias en ninguna placa, el recuento se reporta como "menos de 1"

multiplicado por la primera dilución de la muestra, y se expresa como "Estimado del
recuento estándar".
 ANEXO 1

Ejemplo de determinación del Número Más Probable (NMP)

1.- Si seleccionamos tres diluciones de la muestra:

1/100, 1/1.000, 1/10.000 y el número de tubos positivos para cada dilución es de 3, 1 y
0 respectivamente, cuando llevamos este número a la tabla del NMP, a 3, 1 y 0
corresponde un NMP de 43 coliformes. Multiplicando por la dilución intermedia (1/1000)
y dividiendo 100 se obtiene un valor de 430 coliformes/ml o por g según la muestra se
haya pesado o medido.

2.- Si las diluciones preparadas son:

1/10, 1/100, 1/.1000, 1/10.000 y el número de tubos positivos para cada dilución es de
3, 3, 3, 3 respectivamente, se escogen los valores correspondientes a las tres
diluciones más altas (1/100, 1/1.000, 1/10.000) y el número que se lleva a la tabla del
NMP será 3,3,3. A ese valor corresponde un estimado del NMP de “más de” 2.400,
multiplicado por la dilución intermedia (1/1000) y dividido por 100

2.400 x 103 coliformes/ml ó g

más de = -------------------------------------------------------- =
100
más de 24.000 coliformes/ml ó g

3.- Cuando se emplean series de 5 tubos, se procede en la misma forma, pero utilizamos la
tabla del NMP correspondiente.
 ANEXO 2

Norma COVENIN, 1126-89

ALIMENTOS. IDENTIFICACIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

PREPARACION DE LA MUESTRA

CONDICIONES GENERALES

1.- El sitio donde se realizará el análisis microbiológico deberá reunir las

condiciones de asépsia indispensables. El material y equipo a utilizar deben estar
convenientemente preparados. Identificados y listos para su uso.

2.- Cuando se abra el recipiente con la muestra debe evitarse cualquier tipo de
contaminación.
NOTA: Si no se dispone de cabinas especiales, deben abrirse primero los productos
que se supone tienen menor carga microbiana (pasteurizados, precocidos) y por último
los crudos o desecados. Esto es con la finalidad de prevenir la contaminación del área
de trabajo y así evitar contaminaciones cruzadas.

3.- Las latas, jarras y otros recipientes cerrados deberán lavarse y secarse;
desinfectar el área de preparación de la muestra mediante algún agente
adecuado tal como el alcohol de 70º. El cual se elimina a la llama (flameado). No
se debe flamear aquellos envases o empaques que puedan dañarse o explotar.
NOTA: En caso de que se requieran condiciones de asepsia más estrictas
(prueba del deterioro microbiológico) deben utilizarse además otros desinfectantes,
tales como el alcohol yodado (2% de yodo) y compuestos derivados de amonio
cuaternario. Deben utilizarse cabinas especiales (flujo laminar). Si no se dispone
deberán utilizarse áreas desinfectadas y protegidas de las corrientes de aire.

4.- Cuando el producto este envuelto en cartón, papel celofán, papel aluminio o
cualquier otro material de empaque similar, éste deberá limpiarse con una tela o
esponja humedecida con un agente desinfectante (alcohol de 70º) para eliminar la
contaminación superficial y el polvo. Debe darse una atención especial al área de
abertura del empaque o envase.

5.- Debe tomarse una muestra representativa del alimento.

 TRATAMIENTO DE LA MUESTRA SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

1.- Si se trata de alimentos líquidos o material que fluya libremente, envasados en

recipientes pequeños, debe agitarse por 25 veces haciendo un ángulo de 45º con
el vaso o por rotación del recipiente hasta que el contenido sea homogéneo. En el
caso de que los recipientes sean grandes y de difícil manejo, se deben tomar
muestras representativas y trasvasarlas asépticamente a envases estériles más
pequeños.

2.- Si la muestra está congelada, se deja descongelar en su recipiente original (o

en el cual se recibió en el laboratorio), por un período de 15 minutos a 45ºC en
baño de agua mezclando continuamente o 18 horas entre 2 y 5ºC.
Si la muestra congelada puede trabajarse fácilmente (ejm: un helado) se
procede sin descongelar.

3.- Si el material es sólido deben tomarse porciones de diferentes sitios del

producto para tener una muestra representativa.

4.- Cuando se tenga un material de difícil manejo debe colocarse en un recipiente

grande y estéril, romperse en pequeños trozos, usando métodos adecuados bajo
condiciones asépticas y de allí se toma una muestra, la cual se transfiere a un
recipiente estéril.

5.- Si el contenido del envase es heterogéneo, se prepara una mezcla

homogénea de todo su contenido o se analizan porciones separadas del mismo
dependiendo del propósito del ensayo.
NOTA: En caso de alimentos que presenten una cubierta natural (huevos, ostras, etc),
la modificación en la preparación de la muestra se especificará en la norma particular.

HOMOGENEIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES

MUESTRA SÓLIDA

1.- Se pesan 10, 25 o 50 grs ± 0.1 de la muestra en una jarra, frasco apropiado o
en bolsas de polietileno estériles, previamente tarados.

2.- Se añaden 90, 225 o 450 ml de diluente respectivamente (solución tampom

fosfato o agua peptonada al 0.1 %)
3.- Se homogeneiza por no más de 2 minutos a 8.000 rpm. Debe esperarse 2 a 3
minutos hasta que desaparezca la espuma formada. En el caso de emplearse un
homogeneizador mecánico (Stomacher) se agita la muestra por un tiempo de 60
segundos.
NOTA 1: En el caso de alimentos sólidos cuya flora microbiana está limitada ala
superficie (maní, nueces, almendras, pasas, aceitunas sin deshuesar u otros) se pesan
50 grs y se añaden 50 ml del diluente se agita vigorosamente 50 veces en un ángulo de
45 º. Cada ml de la solución de enjuague será equivalente a un gr de muestra.

NOTA 2: Cuando se analicen alimentos con alto contenido de grasa (mayor de 20%) o
polvo que formen grumos, pueden añadirse al diluente, agentes humectantes tales
como el tergitol 7 anionico (1% p/v) para facilitar la emulcificación (ejemplo: quesos,
cremas de leche, mantequilla, chorizo, albúmina)

NOTA 3: Se recomienda tomar siempre que sea posible la mayor cantidad de muestra
(50 gr) a fin de obtener resultados más confiables.

MUESTRAS LÍQUIDAS

1.- Se miden con una pipeta 10 u 11 ml de la muestra y se transfieren a un frasco

de dilución que contengan 90 o 99 ml de diluente (buffer fosfato o agua
peptonada). En el caso de muestras muy viscosas (Ej.: chicha, jarabes, leche
condensada, yogurt, crema de leche, pulpas de frutas), estas deben pesarse. En
el caso de muestras liquidas con elevada cantidad de gas (refrescos, malta, agua
mineral gasificada) , deben trasvasarse a un recipiente estéril y agitar con rotación
durante 15 a 30 minutos hasta que liberen el gas.

2.- La muestra se agita luego 25 veces, bien sea por un movimiento del brazo en
un ángulo de 45 grados o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
NOTA: La homogeneización de la muestra, bien sea sólida o líquida en la forma antes
descrita, corresponde a la primera dilución (10-1)

3.- A partir de la primera dilución obtenida en el punto 1 y 2 se procede de

inmediato a preparar las diluciones necesarias de la siguiente forma:

a - Se mide 1 ml de la dilución 10-1 y se transfiere a un tubo que

contenga 9 ml de diluente o 10 u 11 ml de la dilución 10-1 y se
transfiere a un frasco de dilución que contenga 90 o 99 ml
respectivamente de diluente para obtener 10-2. Se agita el frasco o
tubo utilizado 25 veces, bien sea con un movimiento del brazo en un
ángulo de 45 º o por rotación del recipiente en diferentes sentidos.
 b.- Se repite este procedimiento a fín de obtener las otras diluciones
necesarias para el análisis 10-3, 10-4, etc, o aquellas que según la
experiencia necesite el alimento o microorganísmo objeto de análisis.
NOTA: La inoculación del medio se debe llevar a cabo dentro de los 20 minutos
siguientes a la preparación de las diluciones.