You are on page 1of 41

Manual de Procedimientos

Aislamiento, identificación
y caracterización de
Listeria monocytogenes

2008
AUTORES

Raquel Callejo

Mónica Prieto

Claudia Martínez

Lorena Aguerre

Florencia Rocca

Gisela Martínez

Servicio Bacteriología Especial


Departamento de Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”

Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv


para América del Sur
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria monocytogenes

CONTENIDO DEL MANUAL

• SECCIÓN I: INTRODUCCIÓN

• SECCIÓN II: INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes EN MUESTRAS CLÍNICAS

• SECCIÓN III: IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes

• SECCIÓN IV: IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE Listeria monocytogenes POR PCR

• SECCIÓN V: SEROTIPIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes CON ANTISUEROS

• SECCIÓN VI: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS


Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN I
1. INTRODUCCIÓN
El género Listeria está compuesto por bacterias gram positivas con bajo contenido G+C, estrechamente
relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus.
Son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, no capsulados, catalasa positiva, móviles entre 10
y 25ºC (Collins et al., 1991).
Listeria ha sido aislada de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran variedad de
alimentos y de heces humanas y animales. El habitat natural de estos microorganismos es probablemente la
materia orgánica vegetal en descomposición y los rumiantes domésticos contribuyen al mantenimientos de
Listeria spp. en el ambiente rural a través de un ciclo continuo de enriquecimiento oral-fecal (Fenlon, 1999).
La amplia distribución de L. monocytogenes se debe a la capacidad de sobrevivir durante períodos de tiempo
prolongados en diferentes medios.
El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri
y L. grayi. Las dos especies potencialmente patógenas son L. monocytogenes y L. ivanovii.
L. monocytogenes no fue considerado un patógeno animal hasta fines de la década del 70. A principios de los
años 80 emerge como uno de los patógenos humanos de origen alimentario más importante. A partir de ese
momento, la literatura sobre Listeria comenzó a incrementarse y a partir de 1983 una serie de brotes epidémicos
humanos en Norteamérica y Europa establecieron claramente a la listeriosis como una grave infección alimentaria
(Bille, 1990). Los alimentos más frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y
productos lácteos, patés y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados,
refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de cocción o calentamiento previo (Farber and Peterkin,
1991). Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva, así como también en el
almacenamiento en frío.
En la actualidad, se estima que L. monocytogenes es la principal causa de muerte originada por bacterias de
origen alimentario en USA, aproximadamente se registran 2500 casos de listeriosis humana por año, incluyendo
500 muertes (Mead et al., 2006).
En rumiantes, la infección por Listeria es transmitida por consumo de silaje en mal estado, en el cual la bacteria se
multiplica rápidamente, dando lugar a brotes en ganado (Fenlon, 1999).
El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un cromosoma circular de 2.944.528 pb
con un promedio de G+C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al 35.3% no se les conoce
función. En el caso de L. innocua posee un único cromosoma circular de 3.011.209 pb con un contenido promedio
de G+C del 37%. Dentro del género Listeria, estas dos especies presentan alto grado de homología en la
secuencia del 16S rRNA, siendo las de mayor cercanía taxonómica (Von Both et al., 1999).

1.1 Serovariedades
Existen hasta el momento 13 serovariedades reconocidas de L. monocytogenes; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a,
4ab, 4b, 4c, 4d, 4e y 7, clasificados en base a los antígenos somáticos (O) y flagelares (H). Sin embargo, tres de
ellas (1/2a, 1/2b y 4b), han sido aisladas en más del 90% de los casos humanos y animales (Low et al., 1993).
Otras serovariedades, como la 1/2c, ha sido encontrada como contaminante de alimentos (Espaze el al., 1991).
Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y L. seeligeri. L. innocua está representada sólo
por tres serovariedades y es considerada una variante no patógena de L. monocytogenes.
La serotipificación de L. monocytogenes es el primer método de subtificación y permite identificar rápidamente los
aislamientos que necesitan ser analizados posteriormente por electroforesis en campo pulsado (PFGE).
Tabla 1. Serovariedades asociadas de las diferentes especies de Listeria

Especie Serovariedad

Listeria monocytogenes 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7

Listeria ivanovii 5

Listeria innocua 4ab, 6a, 6b,

Listeria welshimeri 6a, 6b

Listeria seeligeri 1/2b, 4c, 4d, 6b

2
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.2 Epidemiología

Estudios realizados determinaron que L. monocytogenes es un patógeno con estructura clonal y el potencial
patogénico difiere entre los diferentes grupos clonales (Piffaretti et al., 1989; Wiedmann et al., 1997), así como en
la especificidad por el huésped y la adaptación a diferentes nichos ecológicos (Boerlin and Piffaretti, 1991).
Rasmussen et al. (1995) demostraron que L. monocytogenes se divide en tres linajes según la secuencia de los
genes de virulencia hly, iap y el gen fla que codifica para la flagelina.
Wiedmann et al., (1997) confirmaron la existencia de los tres linajes genéticamente distintos, mediante
ribotipificación y PCR-RFLP del gen de virulencia hly. El linaje I contenía las serovariedades 1/2b, 3b, 3c y 4b, el
linaje II comprendía las serovariedades 1/2a, 1/2c y 3a y el linaje III las serovariedades 4a y 4c.
Los aislamientos del linaje I incluían los clones epidémicos de L. monocytogenes que eran responsables de un
gran número de casos humanos de listeriosis (Sauders et al, 2006). Los aislamientos del linaje II provenían de
alimentos y ambiente (Kathariou, 2002), mientras que los aislamientos del linaje III eran fundamentalmente de
animales (Kathariou, 2002).
Estudios de subtipificación identificaron cuatro clones epidémicos (ECI, ECII, ECIII, ECIV) (Chen et al., 2007), Entre
los clones epidémicos, un cluster de la serovariedad 4b emergió como un grupo clonal cosmopolita, asociado a
varios brotes en diferentes países, relacionados con los siguientes alimentos: coles (Nueva Escocia, 1981), queso
blando (Suiza, 1983 a 1987 y California, 1981) y lengua de cerdo (Francia, 1992) (Kathariou, 2002). Ver Tabla 2.
El clon epidémico ECII fue identificado en USA (1998-1999), en un brote en varios estados, asociado a salchichas
y en el 2002 a un brote por carne de pavo feteada (Kathariou, 2002).
El clon ECIV (serovariedad 4b), causó un brote producido por paté (Reino Unido, 1988) y por vegetales (Boston, 1983).
El clon ECIII corresponde a aislamientos de la serovariedad 1/2a y fue la causa de un brote por salchichas (USA,
1989) y carne de pavo (USA, 2000). Estos aislamientos ECIII estaban relacionados epidemiológicamente, dado
que se encontraron en la misma planta procesadora de alimentos y correspondían a idénticos subtipos, de
acuerdo a diferentes estudios de subtipificación por métodos moleculares.
Sauders et al. (2006), demostraron que muchos casos esporádicos eran también producidos por clones
epidémicos. Por lo tanto, la identificación y el control de estos clones epidémicos son importantes para entender la
transmisión a largo plazo de L. monocytogenes y establecer sistemas eficientes de vigilancia para este patógeno.
L. monocytogenes no solamente ha sido un importante modelo para la investigación inmunológica sino que también ha
servido para el análisis de los mecanismos moleculares del parasitismo intracelular (Cossard and Menguad, 1989).

Tabla 2. Brotes de listeriosis en el mundo

Nº de Nº de
País Año Serotipo Alimento Referencia
casos muertes
Halifax, Canadá 1981 41 18 4b Coles Schlech et al.(1983)
Massachussets, USA 1983 49 14 4b Leche Fleming et al.(1985)
Vaud, Suiza 1983-87 122 34 4b Queso Bula et al.(1995)
California, USA 1985 142 48 4b Queso Linnan et al.(1995)
Reino Unido 1989-90 300 0 4b Paté McLauchlin et al. (1991)
Francia 1992 279 88 4b Lengua de cerdo Jacquet et al.(1995)
Francia 1993 39 0 4b Paté de cerdo Goulet et al.(1995)
Francia 1995 36 0 4b Queso blando Goulet et al.(1995)
Multiestados, USA 1998-99 40 4 4b Carne feteada CDC (1998)
Finlandia 1988-99 25 6 3a Manteca Lyytikainen et al. (2000)
Francia 1999 29 7 NI Lengua de cerdo WHO (2000)
Multiestados, USA 2000 29 4 4b Pavo feteado CDC (2002)
Carolina del Norte, USA 2000-01 12 0 4b Queso CDC (2002a)
Multiestados, USA 2002 46 7 NI Pollo y pavo CDC (2002b)
Québec, Canadá 2002 17 0 NI Queso Gaulin et al.(2003)
NI: serovariedad no informada

3
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.3 Patofisiología de la Infección por Listeria monocytogenes


Existen dos formas de presentación clínica de la infección:
a) listeriosis perinatal
b) listeriosis en el paciente adulto.
Las formas clínicas predominantes corresponden en ambos casos a la infección diseminada o a la infección
localizada en el sistema nervioso central. Es la infección de origen alimentario con mayor tasa de mortalidad en
humanos (20 al 30 % o mayor) a pesar del inicio del tratamiento antibiótico previo (McLauchlin, 1990).
La infección generalmente comienza alrededor de las 20 horas después de la ingestión del alimento contaminado
en los casos de gastroenteritis (Dalton et al., 1997), mientras que el período de incubación para la forma invasiva
es generalmente más larga, alrededor de 20 a 30 días.(Lindan et al.,1988). Los mismos períodos de incubación
han sido descritos para animales, tanto para la gastroenteritis como para la forma diseminada.
Los casos esporádicos tienen una tasa de incidencia muy baja, 2 a 8 casos anuales por millón de población en
Europa y USA (Farber and Peterkin, 1991). Por este motivo, L. monocytogenes parece tener un potencial
patógeno más bajo que otros microorganismos de transmisión alimentaria, lo cual está de acuerdo con la dosis
letal 50 (DL50), relativamente alta. El valor determinado para el ratón infectado experimentalmente por vía oral es
de 109 y por vía parenteral es de 105 a 106. La dosis mínima requerida para la infección humana no ha sido
determinada, pero el número de bacterias detectadas en alimentos responsables de casos esporádicos y
epidémicos de listeriosis sugiere que es alto. Esta dosis también depende de otros factores como el estado
inmunológico del huésped.
a) Listeriosis feto materna y listeriosis neonatal
La infección se produce por invasión del feto por vía placentaria y desarrollo de corioamnionitis. Como
consecuencia, puede ocurrir el aborto, generalmente a partir de los 5 meses de embarazo, el parto
prematuro o el nacimiento a término con infección generalizada del neonato, síndrome conocido como
granulomatosis infantiséptica.
Se caracteriza por la presencia de microabscesos piogranulomatosos diseminados en el cuerpo y con alta
mortalidad (Klatt et al., 1986). En la madre, la infección es generalmente asintomática y puede presentarse
como un síndrome gripal leve con escalofríos, fatiga, dolor de cabeza, muscular y articular alrededor de 2 a
14 días antes del aborto.
La listeriosis neonatal tardía se observa con menos frecuencia. Generalmente ocurre de 1 a 8 semanas
posteriores al parto y se presenta con un síndrome febril acompañado por meningitis y en algunos casos
gastroenteritis y neumonía. La vía de contaminación del neonato es por aspiración de exudados maternos
contaminados durante el parto. También se han registrado casos intrahospitalarios en unidades de
neonatología por transmisión horizontal a través de instrumental y las manos del personal de salud (Farber
et al., 1991). La mortalidad de la listeriosis neonatal tardía es más baja (10 al 20%), pero al igual que la
listeriosis temprana, puede dejar secuelas tales como hidrocefalia y retraso psicomotor (Lorber, 1996).
b) Listeriosis del adulto
La infección mas frecuente en el adulto es la invasión del sistema nervioso central (SNC) (55 al 70% de los
casos). Desarrolla generalmente como meningoencefalitis acompañada por cambios severos de la conciencia,
desordenes del movimiento y en algunos casos parálisis de los nervios craneales. La mortalidad de la infección
del SNC es del 20%, pero puede ser del 40 al 60% si está asociada a una enfermedad de base.
En ciertos grupos de riesgo, como enfermos de cáncer, L. monocytogenes es la causa más frecuente de
meningitis bacteriana (Lorber, 1996).
Otra forma frecuente de listeriosis es la bacteriemia o septicemia que tiene una alta tasa de mortalidad
(hasta el 70%), si esta asociada a una enfermedad inmunosupresiva.
Hay otras formas clínicas atípicas (5 al 10% de casos) tales como endocarditis, miocarditis, arteritis, neumonía,
pleuritis, hepatitis, colecistitits, peritonitis, abscesos localizados, artritis. En vacas la forma más frecuente es la
mastitis (Blenden et al., 1987). Investigaciones de brotes alimentarios han dado la evidencia de que un
síndrome gastrointestinal es la manifestación clínica de la infección por L. monocytogenes (Aureli et al., 2000).

1.4 Población de Riesgo

Las poblaciones de riesgo son: mujeres en estado de gravidez, ancianos, neonatos, personas
inmunocomprometidas (cáncer, transplantes renales, SIDA, diabetes, terapias inmunosupresoras, alcoholismo).

4
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.5 Sensibilidad a los Antimicrobianos

L. monocytogenes es sensible a penicilina, ampicilina, gentamicina, eritromicina, tetraciclinas, rifampicina,


cotrimoxazol y vancomicina. Las fluorquinolonas y las cefalosporinas presentan poca actividad.
Se han descrito en algunos aislamientos resistencias a macrólidos y a tetraciclinas que suelen estar codificadas
por plásmidos, aunque también hay casos de resistencia a tetraciclinas codificada cromosómicamente.

1.5.1 Información y criterios de interpretación para pruebas de sensibilidad por microdilución en caldo
1.5.2 Condiciones del estudio
Medio: Caldo Mueller Hinton y con ajuste de cationes y sangre lisada (2.5 ml al 5% v/v)
Inoculo: Suspensión directa de las colonias con turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland
Incubación: 35 ºC, en atmósfera normal durante 20 a 24 horas

1.5.3 Recomendaciones de Control de calidad mínimo


Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

1.5.4 Antimicrobianos que se prueban en el primer ensayo


Penicilina o ampicilina
Trimetoprima-sulfametoxazol

1.5.5 Comentarios generales


- Características de desarrollo en medios de rutina: frecuentemente fastidiosos; requieren medios suplementado
con sangre para un crecimiento adecuado; atmósfera normal; 20 a 24 horas
- Para algunos organismos y combinaciones de antimicrobianos: la ausencia o la rara presencia de cepas
resistentes excluye la definición de cualquier otra categoría además de “sensible”. Para cepas con resultados
que sugieren una categoría de “no sensible” se debe confirmar la identificación del microorganismo y las
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Por lo tanto, los aislamientos deberán ser conservados y
remitidos a un laboratorio de referencia para su confirmación.

Tipo de CIM (µg/ml)


Antibiótico Comentarios
antibiótico Criterio de interpretación
S I R
Penicilinas
Penicilina ≤2 - - Ver comentario general 2

Ampicilina ≤2 - - Ver comentario general 2


Inhibidores del metabolismos del folato
Trimetoprima-sulfametoxazol ≤0.5/9.5 1/19-2/38 ≥4/76

1.5.6 Información adicional


- Resistencia
Listeria monocytogenes presenta resistencia intrínseca a cefalosporinas
- Razones para la realización o no del ensayo
No se ha descripto resistencia a ampicilina o penicilina. El ensayo debe ser limitado a sospecha de falla
de tratamiento o a pacientes alérgicos a penicilina.
- Criterios interpretativos
Los criterios interpretativos para penicilina y ampicilina se han publicado en la edición más reciente del
documento M100 del CLSI. Criterios interpretativos para trimetoprima-sulfametoxazol se adaptan de los
criterios para Streptococcus spp. de acuerdo al documento M100 del CLSI. Las citas bibliográficas
utilizadas en la interpretación de los puntos de corte se incluyen en las referencias que se dan a
continuación:
- Hansen JM, Gerner-Smidt P, Bruun B. Antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes in Denmark
1958-2001.APMIS. 2005; 113:31-36
- Marco F, Almela M, Nolla-Salas J, et al. In vitro activities of 22 antimicrobial agents against Listeria
monocytogenes strains isolated in Barcelona, Sapin. Diagn Microbiol Infect Dis. 2000; 38(4):259-261
1.5.7 Referencias
Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidiouds
Bacteria; Approved Guideline. M45-A. Vol 26 Nº 19. Replaces M45-P. Vol. 25 Nº 26. CLINICAL AND
LABOARTORY STANDARTS INSTITUTE

5
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.6 Tratamiento
Los antibióticos de elección son la penicilina o la ampicilina solos o asociadas a gentamicina.
La combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado con éxito en pacientes alérgicos a penicilinas,
considerándose en la actualidad una terapia alternativa.

1.7 Patogénesis

El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infección, se debe a la capacidad que tiene de inducir
su propia fagocitosis por células fagocíticas y no fagocíticas del huésped, seguido por la replicación en el interior
de las mismas y su transferencia directa a otra célula. Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular,
se disemina protegido de las defensas del huésped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003).
Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del estómago, al menos
13 proteínas de estrés oxidativo y 14 proteínas de “shock” tóxico, son inducidas bajo condiciones de estrés en
L. monocytogenes (Vázquez-Boland et al., 2001b).
Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la células M próximas a las placas de
Peyer en el intestino delgado, multiplicándose luego en las células fagocíticas. Las bacterias son transportadas
por los macrófagos del intestino al hígado o al bazo, donde son destruidas por los neutrófilos y las células de
Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por células T del huésped es inadecuada, las listerias se multiplican en
los hepatocitos y en los macrófagos y son llevadas por la sangre a varios órganos, especialmente al cerebro y/o al
útero, donde atraviesan la barrera hematoencefálica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia
son producidos por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasión.
1.7.1 Factores de virulencia
Varios factores de L. monocytogenes que median los pasos claves de la infección, han sido identificados.
(a) Adhesión e invasión: Las células de Listeria inicialmente se adhieren a los enterocitos intestinales y
penetran la pared intestinal. El proceso es mediado por la internalina (InlA) y InlB (otro miembro de la
familia de internalinas, caracterizada por la presencia de unidades repetitivas de leucina) y/o otros factores
de internalización. En respuesta, las bacterias quedan dentro del fagosoma en las células del huésped.
La entrada de L. monocytogenes dentro de la célula humana es mediada por la interacción de la proteína
de superficie, internalina, con su receptor humano E-caderina. La interacción internalina-E-caderina es
especie específica y se basa en la presencia de un solo aminoácido de diferencia en el residuo 16 en la
molécula de E-caderina, el cual es prolina en humanos y ácido glutámico en ratón. Evidencias
epidemiológicas apoyan el rol de la internalina en la listeriosis humana, no solo para atravesar la barrera
intestinal, sino también para cruzar la barrera hematoencefálica y la placentaria.
(b) Vacuola primaria de lisis: La listeriolisina O (LLO) y la fosfolipasa C fosfatidil inositol específica (PI –PLC)
lisan el fagosoma para permitir el escape de las bacterias de la vacuola fagocítica.

(c) Desarrollo intracelular: La propagación bacteriana dentro del citosol es mediada por un transportador de
fosfato hexosa bacteriano (Hpt) y una ligasa protein lipoato (LpLA1) que permiten que L. monocytogenes
capte de la célula huésped fuentes de carbono.

(d) Diseminación de una célula a otra: Una vez que las bacterias se multiplicaron en el citosol de la célula
huésped, se desplazan utilizando la nucleación de filamentos de una proteína, actina (ActA). Esto produce
un movimiento dirigido de las bacterias hacia la membrana celular de la célula huésped y promueve
estructuras semejantes a pseudopodos que se extienden dentro de las células vecinas. Este mecanismo
hace que se infecte la célula y la bacteria quede dentro de una vacuola de doble membrana (Cossart et
al., 2003). (Tilney and Portnoy, 1989).

(e) Lisis de la vacuola de doble membrana: La fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC) de Listeria
junto con la LLO lisan la vacuola de doble membrana y liberan las bacterias que infectan la célula vecina.

6
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

Figura 1: Ciclo de vida intracelular de L. monocytogenes.


Centro: se muestra la internalización, la formación de la vacuola y el escape de la misma, la
polimerización de la actina, la motilidad basada en la actina y la diseminación.
Afuera: fotografías electrónicas mostrando LLO, PLCs, y ActA.

El esquema del ciclo de vida y las fotografías electrónicas corresponden a la publicación de Tilney y Portnoy (1989)

Los genes de virulencia de Listeria spp., se organizan dentro de unidades genéticas conocidas como islas de
patogenicidad (PAIs). Las PAIs son adquiridas por la bacteria por mecanismos de transferencia de información
genética horizontal, algunas veces como parte de un elemento móvil genético, por lo cual son importantes en la
evolución de la virulencia bacteriana.
Seis de los factores de virulencia responsables del parasitismo intracelular de L. monocytogenes ( prfA, plcA, hly,
mpl, actA y plcB ), están organizados en una isla cromosomal de 9kb conocida como grupo de genes de virulencia
PrfA dependiente; isla denominada como isla 1 de patogenicidad de Listeria (LIPI-1) (Figura 2) (Vázquez-Boland et
al., 2001a; Vázquez-Boland et al., 2001b).
El locus de virulencia está formado por tres unidades transcripcionales (Figura 2). La posición central está
ocupada por el monocistrón hly , que codifica para la LLO requerida para la ruptura de la vacuola fagocítica y la
liberación de la bacteria dentro del citoplasma. Corriente abajo del monocistrón hly , y en el mismo sentido de
transcripción se encuentra el operón lecitinasa de 5.7Kb que comprende tres genes: mpl, actA y plcB y tres
pequeños marcos de lectura abiertos (ORFs) adicionales (Figura 1). El gen act A codifica para la proteína ActA, el
gen plcB para la fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC), y el gen mpl codifica para la proteasa, la cual
procesa extracelularmente el propéptido inactivo de la PC-PLC.

Figura 2. Organización transcripcional y física del grupo de genes de virulencia (LIPI-1) de Listeria monocytogenes.

7
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.8 El Proteoma de Listeria monocytogenes

La determinación completa de la estructura genética y proteica de L. monocytogenes y el conocimiento de las


funciones interconectadas de la arquitectura celular de este microorganismo, son fundamentales para comprender
la supervivencia y el crecimiento de este patógeno alimentario en el ambiente, en alimentos y en los casos
humanos de listeriosis.
Los estudios proteómicos han sido enfocados hacia la respuesta del organismo frente a un stress general, así
como también hacia situaciones de stress más específicas, que son importantes para la supervivencia y
crecimiento en diferentes condiciones relacionadas con alimentos, biofilms y procesos infecciosos.
La propiedad de L. monocytogenes de sobrevivir y crecer a temperaturas de refrigeración hace importante
determinar los mecanismos por los cuales los patógenos alimentarios llevan a cabo dicha actividad. Phan-Thanh,
and Gormon (1997), encontraron 32 proteínas que eran producidas al doble, frente a un shock térmico, que consistía
en llevar la bacteria de 25 ºC a 49 ºC de temperatura. Los mismos autores encontraron 38 proteínas que
aumentaban al doble o más, al llevar la bacteria de 25 ºC a 4 ºC. Dos de las proteínas expresadas durante el shock
al frío fueron identificadas (Bayles et al., 1996), como proteínas ribosomales S6 y factor de elongación Tu (EF-Tu).
De la misma manera, L. monocytogenes tiene la capacidad de tolerar condiciones de alta osmolaridad. Es capaz
de crecer en presencia de NaCl 10% y ha sido aislada de alimentos con alta concentración de sal. La exposición a
3.5% NaCl durante 30 minutos resulta en la producción de proteínas generales de stress DnaK y Crc y las
enzimas alanina dehidrogenasa, gliceraldehido 3 fosfato dehidrogenasa (Gap), y Cys K que interviene en la
síntesis de cisteína (Duché et al., 2002). Después de estar a 3.5% NaCl por 60 a 90 minutos, se expresan
proteínas relacionadas a largos períodos de aclimatación, en condiciones de alta osmolaridad. Estas proteínas se
conocen como de aclimatación a sales e incluyen Gbu, EF-Tu, GuaB, CcpA, PTS manosa específica, Pdh A y
Pdh D (subunidades de la piruvato dehidrogenasa).
El desarrollo y persistencia de biofilms conteniendo L. monocytogenes es una importante área de investigación, ya
que los biofilms son prevalentes en las plantas procesadoras de alimentos y los biofilms pueden reducir la
efectividad de los tratamientos de sanitización dispuestos para eliminar Listeria y otros microorganismos.
De las 8 proteínas reguladoras de L. monocytogenes caracterizadas en biofilms (Trémoulet et al., 2002), PdhD y
CysK fueron identificadas como proteínas de stress salino en medios mínimos. PdhD e YvyD eran proteínas que
tenían mayor expresión en medio mínimo que en BHI con y sin el agregado de 6% de NaCl. El hallazgo que PdhD,
CysK e YvyD son altamente expresadas tanto en un medio mínimo, como en un biofilm desarrollado en un medio
agarificado complejo, indica que las bacterias en el biofilm están respondiendo a limitaciones nutricionales
similares a las de bacterias en un medio mínimo.
Los perfiles de proteínas de células planctónicas desarrolladas en glucosa fueron comparadas con los perfiles de
células privadas de glucosa en biofilms. La comparación reveló que las bacterias del biofilm privadas de glucosa,
incrementaban la expresión de 14 proteínas, de las cuales 5 pudieron ser identificadas.
Estos avances en el conocimiento serán utilizados para desarrollar mejores estrategias de intervención y métodos
de detección para salvaguardar la producción de alimentos.

8
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.9 Bibliografía

• Aureli P, G C Fioruci, D Caroli, G Marchiaro, O Novara, L Leone, and S Salmaso. 2000. An outbreak of
febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N Engl J Med.
342:1236–1241.
• Bayles D O, B A Annous, and B J Wilkinson. 1996. Cold stress proteins induced in Listeria monocytogenes
in response to temperature downshock and growth at low temperatures. Appl Environ Microbiol. 62:1116–111.
• Blenden D C, E H Kampelmacher, and M J Torres-Anjel. 1987. Listeriosis. J Am Vet Med Assoc.
191:1546–1551.
• Cossart P, Pizarro-Cerda J, Lecuit M. 2003. Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes:
functional mimicry to subvert cellular functions. Trends Cell Biol. 13: 23–31.
• Chen Y, W Zhang, and S J Knabel. 2007. Multi-virulence-locus sequence typing identifies single nucleotide
polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains of Listeria monocytogenes. J Clin
Microbiol. 45:835–846.
• Cossart P, and J Mengaud. 1989. Listeria monocytogenes, a model system for the molecular study of
intracellular parasitism. Mol Biol Med. 6:463–474.
• Dalton C B, C C Austin, J Sobel, P S Hayes, W F Bibb, L M Graves, B Swaminathan, M E Proctor, and P
M Griffin. 1997. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N Engl J
Med. 336:100–105.
• Duché O, F Trémoulet, P Glaser, and J Labadie. 2002. Salt stress proteins induced in Listeria
monocytogenes. Appl Environ Microbiol 48:1494-1498.
• Farber J M, P I Peterkin, A O Carter, P V Varughese, F E Ashton, and E P Ewan. 1991. Neonatal
listeriosis due to cross-infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting. J Infect Dis. 163:927–
928.
• Farber J M, and P I Peterkin. 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol Rev. 55:476–
511.
• Kathariou, S. 2002. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety perspective. J Food
Prot. 65:1811–1829.
• Klatt E C, Z Pavlova, A J Teberg, and M L Yonekura. 1986. Epidemic neonatal listeriosis at autopsy. Hum
Pathol. 17:1278–1281.
• Lorber B. 1996. Listeriosis. Clin Infect Dis. 24:1–11.
• Linnan M J, L Mascola, X D Lou, V Goulet, S May, C Salminen, D W Hird, M L Yonekura, P Hayes, R
Weaver, A Audurier, B D Plikaytis, S L Fannin, A Kleks, and C V Broome. 1988. Epidemic listeriosis
associated with Mexican-style cheese. N Engl J Med. 319:823–828.
• McLauchlin, J. 1990. Human listeriosis in Britain, 1967–1985, a summary of 722 cases. 2. Listeriosis in non-
pregnant individuals, a changing pattern of infection and seasonal incidence. Epidemiol Infect. 104:191–201.
• Mead, P S, E F Dunne, L Graves, M Wiedmann, M Patrick, S Hunter, E Salehi, F Mostashari, A Craig, P
Mshar, T Bannerman, B D. Sauders, P Hayes, W Dewitt, P Sparling, P Griffin, D Morse, L Slutsker, and
B Swaminathan. 2006. Nationwide outbreak of listeriosis due to contaminated meat. Epidemiol Infect
134:744–751.
• Phan-Thanh, L, and T Gormon. 1997. Stress proteins in Listeria monocytogenes. Electrophoresis 18:1464–1471.
• Tilney, LG, and DA Portnoy. 1989. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular
bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J Cell Biol. 109:1597–1608.
• Trémoulet F, O Duché, A Namane, B Martinie, and J C Labadie. 2002. Comparison of protein patterns of
Listeria monocytogenes grown in biofilms or in planktonic mode by proteomic analysis. FEMS Microbiol Lett.;
210 (1):25-31
• Sauders, B D, Y Schukken, L Kornstein, V Reddy, T Bannerman, E Salehi, N Dumas, B J Anderson, J P
Massey, and M Wiedmann. 2006. Molecular epidemiology and cluster analysis of human listeriosis cases in
three U.S. states. J Food Prot. 69:1680–1689.
• Vázquez-Boland J, Domínguez-Bernal G, Gónzalez-Zorn B, Kreft J, Goebel W. 2001ª. Pathogenicity
Islands and Virulence Evolution in Listeria. Microb Infect; 3: 571-584.
• Vázquez-Boland J, M Kuhn, P Berche, T Chakraborty, G Domínguez-Bernal, W Goebel, B González-
Zorn, J Wehland, J Kreft. 2001.Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clin Microbiol
Rev. 14(3): 584-640.

9
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN II
INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes EN MUESTRAS CLÍNICAS

1. HEMOCULTIVOS

Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar
mascara protectora.
• Utilizar siempre guantes
• Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes

1.1 Definiciones
El diagnóstico bacteriológico de la bacteriemia depende del estudio de los hemocultivos.
Debido a la sensibilidad de los métodos de cultivo, el procedimiento debe ser controlado cuidadosamente desde la
etapa pre-analítica (recolección de la muestra) para evitar la interpretación errada de la recuperación de
microorganismos que corresponden a comensales de piel.
El volumen total de sangre debe ser extraído por punción venosa a partir de dos sitios anatómicos distintos para permitir
la evaluación en el laboratorio ante la aparición de un microorganismo comensal de piel aislado en un solo hemocultivo

1.2 Recolección y transporte de muestra


1.2.1 Materiales
• Alcohol etílico al 70% o yodo povidona
• Frascos para hemocultivo
• Guantes
• Jeringa y aguja para extracción venosa

1.3 Procedimiento para la obtención de muestra


1.3.1 Técnica aséptica. Instrucciones
• Lavarse las manos con agua y jabón y secarse con gasa estéril o toalla descartable
• Quitar la tapa protectora del frasco y desinfectar con iodo povidona
• Lavar la piel del paciente con agua y jabón; secar con gasa estéril o desinfectar con alcohol etílico al 70%
• Colocar el lazo, palpar la vena a punzar
• Desinfectar la piel con iodo povidona, con movimientos circulares del centro hacia afuera.
• Toma de muestra
• El operador antes de comenzar la tarea deberá colocarse camisolín, barbijo y guantes
• Punzar la vena seleccionada y extraer sangre, la cantidad dependerá del tipo de frasco a utilizar, en general
se usa en dilución al 10%.
• SI PIERDE LA VENA, DEBE DESINFECTARSE NUEVAMENTE LA PIEL, UNA VEZ SELECCIONADA LA
NUEVA VENA, USAR JERINGA Y AGUJAS NUEVAS
• Inclinar el frasco antes de colocar la sangre para evitar reflujo
• Inocular la sangre y homogeneizar por rotación para evitar la coagulación
• Descartar el material utilizado, desinfectar sector de trabajo con lavandina, quitarse guantes y barbijo y
colocar todo en la bolsa de residuos
• Rotular la muestra y colocarla en la bolsa de transporte
• Remitir al laboratorio
10
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

NOTA: El intervalo en la toma dependerá de la gravedad del cuadro y la urgencia en el inicio del antibiótico
No es costo / efectivo sacar más de 2 muestras de hemocultivo, excepto en situaciones donde es
necesario descartar microorganismos contaminantes Ej. Pacientes con dispositivos en los cuales se aislan
estafilococos coagulasa negativa, Corynebacterium sp., que pueden NO ser contaminantes.

1.3.2 Volumen de sangre y número de muestras

CANTIDAD DE SANGRE A EXTRAER POR PUNCIÓN VENOSA

Volumen recomendado de extracción Sistema de hemocultivo Sangre a inocular

Hemocultivo pediátrico convencional 0.5 a 3.0 ml de sangre por frasco


Neonatos: 0,5 a 2 ml
1 mes a 2 años: 2 a 3 ml
Lisis - centrifugación 1.5 ml de sangre por cada tubo
>de dos años: 3 a 5 ml
Adolescentes: 10 a 20 ml
BacT / Alert 0.5 a 3.0 ml de sangre por frasco

1ml de sangre por cada 10 ml de


Hemocultivo convencional
medio líquido

Adultos : 10 a 30 ml Lisis - centrifugación 10 ml de sangre por cada tubo

BacT / Alert 10 ml de sangre por botella

NÚMERO DE MUESTRAS E INTERVALOS DE TIEMPO ENTRE LAS TOMAS

Diagnóstico presuntivo Número de muestras e intervalos de tiempo entre tomas

a. Aguda: Tomar 2 muestras de sitios diferentes durante las 2


primeras horas de evaluación y comenzar la antibiótico terapia
b. Subaguda: se tomarán 2 hemocultivos y se esperará el resultado
(95 % de ellos serán positivos en 48 horas), caso contrario se
Endocarditis con bacteriemia solicitan nuevos hemocultivos
continua de baja magnitud c. Sospecha de endocarditis e ingesta previa de antibiótico:
pacientes con antecedentes de ingesta de antibiótico en 2
semanas previas, dependiendo de condición clínica, pueden
requerir más de una serie de hemocultivos separadas de
24 - 48 horas

Listeria monocytogenes

Tomar 2 muestras de dos sitios diferentes antes


Sepsis aguda, meningitis, de comenzar la terapia antimicrobiana
osteomielitis, artritis, En casos de presunción de bacteriemia intermitente
neumonía, pielonefritis (abscesos, artritis, osteomielitis) se podrían justificar
obtener tres muestras en 24 horas

11
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.4 Flujograma

Hemocultivo

Microscopía Agar Sangre


Agar tripteína soya
Caldo nutritivo

Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilo Gram +
catalasa +

Pruebas bioquímicas confirmatorias


(Ver SECCIÓN III)

Serotipificación

1.5 Procesamiento de hemocultivo en el laboratorio


1.5.1 Materiales
• Ansa
• Descartador de agujas
• Estufa 35-37 ºC
• Incinerador de ansas
• Jeringa de 3 ml con aguja
• Placas con agar tripticasa soya
• Placas con agar tripticasa soya con sangre ovina al 5%

1.5.2 Procedimiento
• Incubar las botellas de hemocultivo a 35 ºC durante 5 días.
• Mantener las condiciones de incubación para permitir la recuperación del microorganismo y en lo posible
incubar con agitación o rotación de las botellas.
• Examinar las botellas diariamente tanto si la detección de desarrollo positivo es automatizada o por
inspección visual.
En caso de sistemas manuales de detección de desarrollo, realizar al menos un subcultivo a ciegas en agar sólido
a partir de las botellas que no presentan signos visibles de desarrollo bacteriano
En caso de aparición de signos de desarrollo bacteriano en la botella, subcultivar inmediatamente en agar sangre
y realizar un extendido en portaobjeto para coloración de gram

12
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.6 Caracterización inicial y reporte de resultados


1.6.1 Materiales. Equipamiento

• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio

NOTA: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o la muestra, así como protegerá al operador

1.6.2 Reactivos y medios

• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya con 5 % de sangre ovina para prueba de CAMP
• Bilis esculina agar
• Equipo colorantes para Gram
• Estrías de agar tripticasa soya
• Medio SIM
• Peróxido de hidrógeno al 3% (prueba de catalasa)

1.6.3 Procedimiento

Día 1 Comentarios

• Observación de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos En los primocultivos, muchas veces
L. monocytogenes no evidencia beta hemólisis
• Desarrollo de colonias pequeñas con beta hemólisis positiva
• Siembra de bilis esculina, prueba de CAMP y medio SIM a Las pruebas se detallan en
temperatura ambiente la SECCIÓN III

Día 2

Identificación presuntiva de L. monocytogenes


• Bilis esculina positiva, movilidad positiva (“paraguas”),
prueba de catalasa positiva a partir de medio sin sangre Confirmar según detallado en
la SECCIÓN III

13
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

2. LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO

Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar
mascara protectora.
• Utilizar siempre guantes
• Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes

2.1 Recolección y transporte de muestra


2.1.1 Materiales
• Tubo plástico estéril tapa rosca

2.1.2 Muestra
• El LCR se obtiene por punción lumbar o a partir de derivaciones ventriculares
• El LCR se obtiene por aspiración transcutánea, por lo tanto se trata de un fluido estéril y cualquier
microorganismo recuperado en la siembra del material debe ser considerado un patógeno potencial.
2.1.3 Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito

• No refrigerar
• Rotular la muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar,
derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• Registrar las características fisicoquímicas del LCR (volumen, celularidad, características macroscópicas)

IMPORTANTE: Las características fisicoquímicas del LCR en una infección por Listeria pueden confundirse con
las observadas en las meningitis virales, pudiendo desorientar el diagnóstico. El LCR se
caracteriza por la presencia de más de 1000 células por mm3, pudiendo encontrarse según la
evolución del cuadro, polimorfonucleares o mononucleares; la proteinorraquia varía desde un
valor normal hasta aproximadamente 700 mg/100 ml; la glucorraquia baja en la mitad de los
casos. El aspecto del LCR rara vez es purulento. El microorganismo puede observarse o no al
Gram pero habitualmente desarrolla en los medios de cultivo comunes.

2.2 Microscopía de la muestra


2.2.1 Materiales. Equipamiento
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio

Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al
operador

2.2.2 Reactivos
• Aceite de inmersión
• Equipo de colorantes para Gram

14
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

2.2.3 Procedimiento

Día 1 Comentarios

• Colocar 5 a 6 gotas de la muestra en un portaobjeto y extender


El número de L. monocytogenes en el
• Dejar secar dentro de la cabina de bioseguridad LCR puede ser menor a 103 UFC/ml, por
• Colorear con la técnica de Gram, observar e interpretar lo tanto la concentración por
centrifugación para la coloración de Gram
• La observación de cualquier número de cocobacilos Gram es importante para el diagnóstico rápido
positivos debe ser informado inmediatamente al médico tratante

2.3 Aislamiento e identificación


2.3.1 Materiales. Equipamiento
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Estufa de cultivo 35 – 37 ºC con atmósfera de 5% de CO2

2.3.2 Medios de cultivo


• Agar tripteína soya
• Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
• Caldo nutritivo

2.3.3 Procedimiento

Día 1 Comentarios

• Centrifugar la muestra para concentrar


• Aspirar el fluido desde el fondo del tubo utilizando
una pipeta estéril y colocar 2 ó 3 gotas en una
placa de agar tripticasa soja con sangre ovina al
El número de L. monocytogenes en el LCR
5% y en una placa de agar tripticasa soya sin
puede ser menor a 103 UFC/ml,
sangre. Sembrar en técnica de aislamiento en
por lo tanto la concentración por centrifugación mejora
cuatro cuadrantes
la recuperación por cultivo
• Inocular también en caldo tioglicolato o caldo
nutritivo. Incubar placas a 35 - 37 ºC en
atmósfera de 5% de CO2 por 24 - 48 horas.
Incubar caldos a 35 – 37 ºC en atmósfera normal

Día 2 Comentarios

• Examinar las placas y caldos a las 24 horas para Colonias sospechosas: pequeñas convexas,
detectar evidencia macroscópica de desarrollo transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa
bacteriano. En caso negativo, reincubar La observación microscópica de bacilos pequeños o
• Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias
de colonias sospechosas en placa de agar tripteína pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva
soya representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que
debería ser informada al médico tratante en forma
• Subcultivar en estría de agar tripteína soya inmediata

Día 3 Comentarios

En caso de microscópica positiva a partir del Gram


• A partir del subcultivo en estría proseguir la directo de la muestra con cultivos negativos a las 24
identificación confirmatoria (Ver SECCIÓN III) horas, reincubar las placas y caldos por al menos una
semana y observar diariamente

15
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

2.4 Flujograma

LCR

Análisis fisicoquímico Centrifugar


Microscopía

Agar sangre
Agar tripteína soya
Caldo nutritivo

Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilo Gram +
catalasa +

Pruebas bioquímicas confirmatorias


(Ver SECCIÓN III)

Serotipificación

16
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

3. MATERIA FECAL
El procedimiento se adaptó con modificaciones menores del descrito por Sauders y col. (2005)
3.1 Recolección y transporte de muestra
3.1.1 Materiales
• Frasco estéril tapa rosca para coprocultivo

3.1.2 Muestra
• El estudio de L. monocytogenes en materia fecal puede ser requerido en caso de cuadros de gastroenteritis
febril asociado al consumo de alimentos contaminados o estudios de portación en investigaciones
epidemiológicos.
• La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con
antimicrobianos. Se recoge una muestra de una evacuación espontánea reciente, en frasco estéril. En caso
de no poderse obtener la muestra, se realiza una hisopado rectal. Para los estudios epidemiológicos de
portación fecal, las muestras de heces son más productivas que los hisopados rectales.
3.1.3 Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio refrigerada en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito
• Rotular muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• La muestra debe ser procesada inmediatamente se puede mantener a 4 ºC por 48 horas.
• Para muestras que requieran mayor tiempo de almacenamiento, congelar a –20 ºC y enviar al laboratorio
acondicionada con hielo seco

3.2 Aislamiento e identificación

3.2.1 Materiales. Equipamiento


• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Estufa de cultivo 35 – 37 ºC
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio

3.2.2 Consideraciones de bioseguridad


• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
3.2.3 Reactivos y Medios de cultivo
• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya
• Agar tripteína soya con 5% sangre ovina
• Caldo Fraser
• Caldo nutritivo
• Medios selectivos (agar Oxford modificado MOX)
• Equipo para coloración de Gram
• Peróxido de hidrógeno al 3%

17
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

3.2.4 Procedimiento

Día 1 Comentarios

• Colocar 1 g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de caldo UVM

• Incubar 24 horas a 30 ºC

Día 2 Comentarios

• Sembrar 0.1 ml de UVM en medio selectivo agar MOX

• Sembrar 0.1 ml de UVM en 10 ml de caldo Fraser

• Incubar a 30 ºC por 24 horas

Día 3 Comentarios

• Observar presencia de colonias sospechosas en el agar


Oxford y subcultivar hasta 5 colonias en medio sólido
(agar sangre, agar tripticasa soya), y medio líquido (caldo A las 24 horas las colonias típicas de
nutritivo). Incubar medios sólidos a 35 ºC por 18-24 horas L. monocytogenes en agar MOX, son pequeñas,
y medio líquido a 22 ºC rodeadas de halo de ennegrecimiento debido a la
hidrólisis de esculina
• Sembrar 0.1 ml de caldo Fraser en agar MOX e incubar a
30ºC por 24 horas

Día 4 Comentarios

• Observar beta hemólisis, realizar prueba de catalasa La observación de bacilos o


coloración de gram y observar movilidad en fresco cocobacilos gram positivos, móviles,
beta hemolíticos, catalasa positiva, indica
• Si el desarrollo de colonias sospechosas en agar selectivo es sospecha de Listeria monocytogenes.
negativo a las 24 horas, observar nuevamente y en el caso de Confirmar identificación según descripto
aparición de colonias proseguir como descripto en día 3 en la SECCIÓN III

18
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

3.3 Flujograma

Suspender 1g o 1 ml de materia fecal en 10 ml de Caldo UVM


Incubar 48 horas a 30 ºC

MOX Fraser

Incubar 24 horas a 30 ºC Incubar 24 horas a 30 ºC

Sembrar en MOX

Incubar 24 horas a 30 ºC

Colonias sospechosas

Agar sangre
Agar tripteína soya
Caldo nutritivo

Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilos Gram +
catalasa +

Pruebas bioquímicas confirmatorias


(Ver SECCIÓN III)

Serotipificación

Referencias
Sauders B, D Pettit, B Currie, P Suits, A Evans, K Stellrecht, D Dryja, D Slate and M Wiedmann. 2005.Low
Prevalence of Listeria monocytogenes in human stool. J Food Prot. 68: 178-81.

4. OTROS MATERIALES
• Materiales de sitios normalmente estériles: Además de sangre y líquido cefalorraquídeo; líquido articular,
liquido amniótico, líquido pericárdico, líquido pleural, placenta y tejido fetal.
La siembra se realiza en los medios indicados en el procedimiento descripto para líquido cefalorraquídeo

• Materiales de sitios no estériles : Se deberá incluir un paso de enriquecimiento en caldo nutritivo incubado en
frío (4 ºC) y/o siembra en caldos y medios selectivos según el procedimiento descripto para materia fecal.
19
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN III: IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes

1. TABLA 1. Diferenciación de géneros relacionados

Listeria Lactobacillus Erisypelothrix Enterococcus

Microscopía cocobacilar bacilar bacilar cocos

Catalasa + - - -
Vancomicina S R R S/R
Movilidad + - - -/+

Producción SH2 - - + -
Bilis Esculina + - - +
NaCl 6.5% + - - +
Beta hemólisis V - - V

• Bacilos Gram positivos


• Catalasa positiva
Listeria spp. • Metabolismo fermentador
• Lipofilismo negativo
• Pigmento negativo

2. TABLA 2. Diferenciación fenotípica de especies del género Listeria


L. ivanovii subesp.

L. monocytogenes

L. welshimeri
londoniensis

L. seeligeri
Características
L. innocua

L. ivanovii
L. grayi

Hemólisis beta - - ++ ++ + + -
Prueba de CAMP
S. aureus - - - - + + -
R. equi - - + + -/+ - -
Fermentación de:
Manitol + - - - - - -
L-ramnosa V V - - + - V
D-Xilosa - - + + - + +
Hidrólisis de hipurato - + + + + No determinado No determinado
Reducción de nitratos - - - - - No determinado No determinado

1/2a,1/2b,1/2c,
4ab 1/2a, 1/2b
3a, 3b, 3c, 4a, 1/2b, 4c
Serotipo Específico 6a 5 5 1/2c, 4b
4ab, 4b, 4c, 4d, 6a, 6b
6b 4d, 6b
4e, 7

Patogenicidad murina - - + ? + - -
Suelo, Suelo,
alimento, alimento, heces.
Ecología No No
Heces. Patógeno No patógeno No patógeno
patógeno patógeno
Patógeno humano y
animal animal

20
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN IV

1. PROTOCOLO PCR-MULTIPLEX PARA IDENTIFICACIÓN DE SEROTIPOS DE Listeria monocytogenes

Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes

1.2 Preparación de ADN templado

1.2.1 Materiales
• Bolsas rojas para descarte de material patológico
• Bloque térmico 100 ºC
• Gradilla para tubo eppendorf
• Guantes, guardapolvo
• Microcentrífuga
• Pipeta y tips para preparación de templado
• Tips con filtro: 100 μl, 200 μl
• Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml

1.2.2 Reactivos
• Agua tridestilada estéril
• Buffer lisis para PCR

1.2.3 Procedimiento
• Sembrar la cepa en agar nutritivo o agar sangre en reaislamiento para obtener colonias aisladas
• Suspender con ansa 3 ó 4 colonias en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril con 50 μl de buffer lisis para PCR
• Calentar a 99 ºC en bloque térmico durante 15 minutos
• Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar 100 μl de agua tridestilada estéril
• Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto
• Utilizar el sobrenadante como templado
• Guardar en freezer de -20 ºC

NOTA: Descartar material de plástico en bolsa roja

21
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.3 PCR
1.3.1 Materiales
• Bolsas rojas para descarte de material patológico
• Cuba de electroforesis y fuente de poder
• Gradillas para tubo eppendorf
• Gradilla refrigerada para tubos de PCR
• Guantes, guardapolvo
• Hielo
• Kit de pipetas para PCR. Rangos: 200-1000 μl, 20-200 μl, 5-40 μl, 0.5-10 μl
• Pipeta y tips para siembra de geles
• Pipeta y tips para siembra de templado
• Termociclador
• Tips con filtro: 10μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl
• Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
• Tubos para PCR 0.2 ml estériles
• Sistema de documentación de geles: Software Gel Doc
1.3.2 Reactivos
• Agarosa para biología molecular
• Agua tridestilada estéril
• Buffer de corrida 6X
• Buffer TAE 1X
• Marcadores de peso molecular
• Oligonucleótidos
lmo0737 For: 5´AGGGCTTCAAGGACTTACCC3´
Rev: 5´ACGATTTCTGCTTGCCATTC3´

lmo1118 For: 5´AGGGGTCTTAAATCCTGGAA3´


Rev: 5´CGGCTTGTTCGGCATACTTA3´

ORF2819 For: 5´AGCAAAATGCCAAAACTCGT3´


Rev: 5´CATCACTAAAGCCTCCCATTG3´

ORF2110 For: 5´AGTGGACAATTGATTGGTGAA3´


Rev: 5´CATCCATCCCTTACTTTGGAC3´

Prs For: 5´GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG3´


Rev: 5´CAAAGAAACCTTGGATTTGCGG3´
• Reactivos para PCR (dNTPS, Taq polimerasa, buffer polimerasa y MgCl2)
• Solución de bromuro de etidio
1.3.3 Áreas de trabajo

Estadío PCR Área de trabajo


Preparación mezcla de reacción Área 1
Siembra de templado Área 2
Ciclado Área 3
Electroforesis Área 3
Teñido geles Área 4
Documentación geles Área 4

Consideraciones generales: Trabajar siempre con guantes.


Cambiar de guantes al cambiar de área de trabajo.

22
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.3.4 Procedimiento
Realizar la PCR según el siguiente protocolo

Reactivos 1 reacción

Agua tridestilada estéril 35,3 μl

Buffer 10X 5 μl

MgCl2 50mM 1.5 μl

dNTPs (2,5mM) 1 μl

Oligonucleótidos 5 μl

Taq 5U/ul 0,2 μl

ADN templado 2 μl

VOLUMEN TOTAL 50 μl

1.3.5 Preparación de mezcla de reactivos para PCR (mezcla de reacción)


• Debe realizarse en el área establecida para dicho propósito (Área 1)
• Utilizar pipetas designadas para PCR exclusivamente
• Calcular volúmenes de reactivos según el número de muestras
• Añadir dos tubos extra para los controles. Control de contaminación: tubo con todos los reactivos
reemplazando el volumen de ADN templado por agua tridestilada estéril. Control positivo: utilizar como
templado una muestra que haya arrojado un resultado positivo previamente
• Descongelar a temperatura ambiente, durante 15-20 minutos, todos los reactivos excepto la enzima Taq polimerasa
• Retirar la Taq polimerasa del freezer en el momento de realizar la mezcla de reacción y mantenerla en hielo
• Realizar la mezcla de reacción en tubo eppendorf estéril de 1.5 ml según protocolo de reacción
• Agregar la Taq polimerasa al final
• Rotular y colocar los tubos de PCR en gradilla refrigerada
• Fraccionar 48 μl en cada tubo

1.4 Siembra del templado


• Trabajar en Área 2
• Utilizar pipeta y tips exclusivos para siembra de ADN templado
• Registrar en planillas de PCR el número de muestras y detalle de las mismas

1.5 Ciclado
Cargar en el termociclador el siguiente programa de amplificación

Número de ciclos Estadío Temperatura Tiempo

1 ciclo Desnaturalización 94 ºC 3 minutos

Desnaturalización 94 ºC 40 segundos

35 ciclos Annealing 53 ºC 1.15 minutos

Extensión 72 ºC 1.15 minutos

1 ciclo Extensión 72 ºC 7 minutos


23
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.6 Electroforesis
• Preparar un gel de agarosa al 2% en buffer TAE 1X
• Agregar 10 μl de buffer de corrida 6X a cada muestra y sembrar 10 μl por calle
• Sembrar 6 μl de marcador de peso molecular 100 pares de bases (5 μl de marcador + 1 μl buffer de corrida 6X)
• Realizar electroforesis a 100 voltios durante 40 minutos
• Teñir el gel en solución de bromuro de etidio durante 30 minutos
• Documentar resultado
1.7 Precauciones generales
• Utilizar guantes en todos los pasos, inclusive para retirar los tubos del termociclador una vez finalizado el ciclado
• Descartar el material de plástico (tips, eppendorf), en bolsa roja
• Manipular con cuidado el gel para ser teñido, evitando salpicaduras de la solución de bromuro de etidio.
Utilizar siempre guardapolvo y guantes
• Una vez documentado, descartar el gel en bolsa roja
1.8 Interpretación de los resultados
• Se pueden obtener 5 perfiles de bandas diferentes: P-1/2a, P-1/2b, P-1/2c, P-4b y P-list (ver figura 1)
• Para las cepas que no se obtengan fragmentos de amplificación, repetir una vez mas desde el paso 1
1.9 Reactivos y soluciones
1. Agua tridestilada estéril
Autoclavar agua tridestilada en frascos o botellas con tapa a rosa de 100ml y 50 ml
2. Bromuro de etidio. Solución stock (10mg/ml)
Agregar 1 g de bromuro de etidio a 100 ml de agua destilada. Agitar con agitador magnético durante varias
horas para asegurarse que el colorante se haya disuelto. Envolver el recipiente en papel metálico o transferir
la solución a un frasco color caramelo y mantener a temperatura ambiente

NOTA: El bromuro de etidio es un mutágeno poderoso y es moderadamente tóxico.


Deben utilizarse guantes, máscara o barbijo, cuando se manipula la solución durante las pesadas.

Solución para teñido de geles (1 μg/ml)


Solución stock de bromuro de etidio 10 μl
Agua destilada 100 ml

Los materiales contaminados con bromuro de etidio deben ser descartados en recipientes debidamente
identificados.
3. Decontaminación de soluciones acuosas de bromuro de etidio (Lunn y Sansone 1987)
• Agregar 1 gramo de carbón activado por cada 1000 ml de solución de bromuro de etidio a descartar
• Mantener 1 hora a temperatura ambiente agitando intermitentemente
• Filtrar la solución a través de papel de filtro Whatman Nº1
• Descartar el filtrado
• Sellar el filtro con carbón activado, colocar en bolsa plástica y descartar en bolsa de residuos patológicos

Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd edition. Sambrook, Fritsch and Maniatis

4. Buffer de corrida (Solución 6X)


El propósito del buffer de corrida es aumentar la densidad de la muestra para facilitar la carga de ADN en
la calle del gel, agregar color a la muestra simplificando el proceso de carga y además posee colorantes
que migran en un campo eléctrico hacia el ánodo a velocidades predecibles. El azul de bromofenol migra a
través de un gel de agarosa aproximadamente 2,2 veces más rápido que el cianol xileno,
independientemente de la concentración de agarosa.

Azul de bromofenol 0.25 g


Cianol xileno 0.25 g
Glicerol 30 ml
Agua estéril 70 ml

Fraccionar en frascos color caramelo y almacenar a 4 ºC


24
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

5. Buffer lisis para PCR

SDS 10% 2.5 ml


NaOH 1N 5.0 ml
Agua tridestilada estéril 100 ml
Preparar y almacenar a temperatura ambiente en frasco estéril con tapa a rosca

6. Buffer Tris acetato (TAE) Solución madre 50X (Disponible comercialmente)


Tris base 242 g
Ácido acético glacial 57.1 g
EDTA 0.5M (pH 8) 100 ml
Solución de trabajo
TAE 50X 10 ml
Agua tridestilada estéril 500 ml
7. Set de dNTPs (solución 10mM para 1 ml)
dATP 100 ul
dCTP 100 ul
dGTP 100 ul
dTTP 100 ul
Agua tridestilada 600 ul
8. Oligonucleótidos. (solución stock)
lmo0737 R + 63,1 ul TE 1X
lmo0737 F + 58,3 ul TE 1X
lmo1118 R + 56,2 ul TE 1X
lmo1118 F + 61 ul TE 1X
ORF2819 R + 49,5 ul TE 1X
ORF2819 F + 43,1 ul TE 1X
ORF2110 R + 47,6 ul TE 1X
ORF2110 F + 55,8 ul TE 1X
Prs R + 52,6 ul TE 1X
Prs F + 49,1 ul TE 1X
Solución de trabajo de oligonucleótidos (dilución 1/10)
De la solución stock de cada oligonucleótido hacer una dilución 1/10 con agua tridestilada estéril
para preparar la solución de trabajo.
Preparación de mezcla de oligonucleótidos (100 ul)
lmo0737 R 10 ul
lmo0737 F 10 ul
lmo1118 R 15 ul
lmo1118 F 15 ul
ORF2819 R 10 ul
ORF2819 F 10 ul
ORF2110 R 10 ul
ORF2110 F 10 ul
Prs R 2 ul
Prs F 2 ul
Agua tridestilada 6 ul
9. Taq polimerasa (500U) (Disponible comercialmente)
Provista con el buffer polimerasa (10X) y el MgCl2 (50mM)
10. Marcador de peso molecular de ADN (Disponible comercialmente)
Tamaño de los fragmentos: de 200pb a 1000pb

25
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

Figura 1

Perfil P-1/2a: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2a y 3a


Perfil P-1/2c: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2c y 3c

Perfil P-4b : corresponde a L. monocytogenes serotipo 4b, 4d y 4e


Perfil P-1/2b: corresponde a L. monocytogenes serotipo 1/2b ,3b y 7

Perfil List: corresponde a L. monocytogenes serotipo 4a y 4 c, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimeri y L. seeligeri

26
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN V
1. SEROTIPIFICACIÓN CON ANTISUEROS

1.2 Principios de la reacción de aglutinación


Los microorganismos aislados convencionalmente y confirmados por caracterización bioquímica como
Listeria monocytogenes, pueden ser serotipificados utilizando antisueros
Cuando un antisuero específico es agregado a una suspensión celular, ocurre una reacción antígeno-anticuerpo
produciendo una reacción positiva posible de ver a ojo desnudo.

1.3 Procedimiento
1.3.1 Método de aglutinación en portaobjeto para la determinación del antígeno de superficie polivalente (O)
• Sembrar una placa de agar infusión cerebro corazón, incubar 18-24 horas
• Preparar suspensión celular en cloruro de sodio 0.2% a partir de la placa con una concentración final de 10 mg/ml
• Calentar la suspensión a 121º C durante 30 minutos
• Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos
• Volcar el sobrenadante y resuspender el precipitado con pequeñas cantidades de cloruro de sodio 0.2%
1.3.2 Prueba de aglutinación
• En un portaobjeto limpio marcar los bordes con marcador para vidrio para evitar el corrimiento del líquido.
Pueden utilizarse vidrios de mayor superficie para más de una aglutinación procediendo de la misma forma
que con el portaobjetos.
• Colocar una gota de antisuero OI/II, una del OV/VI y una gota de solución fisiológica
• Colocar una ansada de la suspensión celular cerca de cada gota de antisuero y solución fisiológica
• Homogeneizar bien la suspensión
• Colocar el portaobjeto o vidrio sobre un fondo oscuro y observar los patrones de aglutinación a ojo desnudo
• Considerar una aglutinación positiva fuerte cuando aparezca dentro del minuto de realizada la mezcla. Se
debe determinar si ocurre o no autoaglutinación entre la solución fisiológica y la suspensión celular.
1.3.3 Prueba de aglutinación en porta objetos utilizando antisueros individuales
• Cuando los aislamientos de L. monocytogenes producen aglutinación positiva con los antisueros polivalentes
se debe continuar con los antisueros individuales
1.3.4 Aglutinación positiva para antisuero OI/II
• Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OI y OIV y proceder de igual forma que con los
antisueros polivalentes
1.3.5 Aglutinación positiva para antisuero OV/VI
• Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OVI, OVII, OVIII y OIX y proceder de igual forma que
con los antisueros polivalentes.
1.3.6 Método en tubo para la determinación del antígeno somático (H)
• Como L. monocytogenes posee solamente de 1 a 4 flagelos, se recomienda aumentar la movilidad,
realizando tres pasajes del cultivo en medio infusión cerebro corazón semisólido con tubos de Craigie´s,
partiendo de un cultivo fresco en medio líquido infusión cerebro corazón
• La suspensión celular utilizada para la determinación se prepara en medio infusión cerebro corazón incubado
a 30º C durante toda la noche, agregando cantidades iguales de suspensión celular y solución fisiológica
con formalina al 1% v/v
• Colocar dos gotas de cada antisuero somático en diferentes tubos y agregar 0.5 ml de la suspensión celular
en cada uno
• Agitar los tubos e incubar en baño termostatizado (50 - 52º C), durante una hora.
• Observa si ocurre o no aglutinación. Evitar agitar los tubos durante la observación, ya que la aglutinación
puede romperse fácilmente
• Considerar una aglutinación visible a ojo desnudo como positiva

27
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

1.4 Determinación de serotipos


El serotipo de los aislamientos de L. monocytogenes será determinado de acuerdo a la siguiente tabla

Serotipo Antígeno O Antígeno H


1/2 a I, II, (III) AB
1/2 b I, II, (III) ABC
1/2 c I, II, (III) BD
3a II, (III), IV AB
3b II, (III), IV, (XII), (XIII) ABC
3c II, (III), IV, (XII), (XIII) BD
4a (III), (V), VII, IX ABC
4 ab (III), V, VI, VII, IX, X ABC
4b (III), V, VI ABC
4c (III), V, VII ABC
4d (III), (V), VI, VIII ABC
4e (III), V, VI, (VIII), (IX) ABC
7 (III), XII, XIII ABC

1.5 Precauciones
• Todos los cultivos e instrumentos tales como vidrios o tubos utilizados en estas pruebas deben ser
esterilizados con una solución de hipoclorito de sodio al 0,1% por más de una hora o autoclavados a 121º C
durante 20 minutos.
• Estas pruebas de serotipificación deben ser utilizadas solamente para cepas de L. monocytogenes aisladas
de alimentos.
• No colocar los antisueros en el freezer, esto puede producir precipitaciones.
• Estos reactivos contienen 0.08% de azida de sodio como conservante.

28
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

SECCIÓN VI
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

1. CALDO BASE FRASER (medio comercial)


1.1 Fundamentos: El caldo base Fraser con el agregado de suplementos es recomendado para el
enriquecimiento, aislamiento y cultivo de Listeria monocytogenes a partir de alimentos
y especimenes ambientales. Proteosa peptona, hidrolizado enzimático de caseína,
extracto de carne, extracto de levadura son nutrientes esenciales para el desarrollo.
Cloruro de litio inhibe el desarrollo de enterococos. Todas las especies de Listeria
hidrolizan esculina a esculitina que, junto con los iones férricos, forman un complejo
marrón oscuro a negro. Citrato férrico amónico favorece el desarrollo de L. monocytogenes.
1.2 Ingredientes: Proteosa peptona .......................................................5 g
Hidrolizado enzimático de caseína............................ 5 g
Extracto de levadura ................................................. 5 g
Extracto de carne ...................................................... 5 g
Cloruro de sodio .......................................................20 g
Cloruro de litio ........................................................... 3 g
Fosfato disódico .......................................................12 g
Fosfato monopotásico ...........................................1.35 g
Esculina ..................................................................... 1 g
Citrato férrico amónico ............................................0.5 g
Agua destilada......................................................1000 ml
pH final 7.2 ± 0.2 a 25 ºC
1.3 Preparación: Suspender 57.85 g de medio deshidratado en 990 ml de agua destilada. Calentar a
ebullición hasta disolución completa. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar
a 45-50 °C y agregar estérilmente el contenido de un vial rehidratado de suplemento
(F2674). El suplemento de enriquecimiento Fraser contiene 25 mg de clorhidrato de
acriflavina y 4 mg de ácido nalidíxico. Mezclar y fraccionar convenientemente.
Mantener el medio preparado a 8 ºC protegido de la luz directa.
Nota: Cloruro de litio es nocivo. Evite contacto corporal e inhalación de vapores. En caso de contacto con la
piel, lavar con agua inmediatamente.
1.4 Características: Medio deshidratado: homogéneo, color amarillo. Mantener en lugar seco de 2 a 25 ºC
Medio preparado: amarillo, con fina precipitación. Luego del agregado del
suplemento, la solución es amarillo fluorescente con ligera precipitación.
1.5 Control de calidad: Positivo: desarrollo positivo, esculina positiva (con ennegrecimiento)
Listeria monocytogenes ATCC 19111
Negativo: desarrollo negativo, esculina negativa (sin ennegrecimiento)
Enterococcus faecalis ATCC 29212; Escherichia coli ATCC 25922;
Staphylococcus aureus ATCC 25923

2. CALDO CEREBRO CORAZÓN (BHI)

2.1 Ingredientes: Extracto de cerebro de ternera..............................12.5 g


Extracto de corazón de buey..................................... 5 g
Triptosa.....................................................................10 g
Cloruro de sodio ........................................................ 5 g
Fosfato disódico ..................................................... 2.5 g
Agua destilada......................................................1000 ml
pH final 7,4 ± 0.2 a 25 ºC
2.2 Preparación del medio: Disolver por calentamiento y agitación. Fraccionar en tubos. Esterilizar a 121 ºC
durante 15 minutos.
2.3 Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio

29
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

3. CALDO DE ENRIQUECIMIENTO (Medio BLEB)


3.1 Medio base
3.1.1 Ingredientes: Caldo tripteína soja ................................................. 30 g
Extracto de levadura ................................................ 6 g
Agua destilada .................................................... 1000 ml
3.1.2 Preparación: Agregar los componentes deshidratados al agua destilada y calentar suavemente
hasta su completa disolución. Ajustar pH ± 7,3. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC.
3.2 Suplemento 1
3.2.1 Ingredientes: Acriflavina HCl ........................................................ 23 mg
Agua destilada......................................................... 10 ml
3.2.2 Preparación: Disolver acriflavina HCl en agua destilada. Esterilizar por filtración.
3.3 Suplemento 2
3.3.1 Ingredientes: Acido nalidíxico (sal sódica) .................................... 46 mg
Solución de NaOH 0.05 M ...................................... 10 ml
3.3.2 Preparación: Disolver el ácido nalidíxico en la solución de NaOH 0.05 M. Esterilizar por filtración.
3.4 Suplemento 3
3.4.1 Ingredientes: Cicloheximida ......................................................57.5 mg
Etanol 96% v/v .......................................................... 4 ml
Agua destilada .......................................................... 6 ml
3.4.2 Preparación: Disolver la cicloheximida en mezcla etanol / agua. Esterilizar por filtración.

3.5 Preparación del medio completo


La base y los suplementos deben ser guardados separadamente, protegidos de la luz
y refrigerados entre 2 y 5 ºC. Para completar la preparación del medio, agregar a
225 ml del medio base: Suplemento 1 = 1 ml; Suplemento 2 = 2 ml; Suplemento 3 = 2 ml
Pueden fraccionarse múltiplos de 1 ml, 2 ml y 225 ml para el uso apropiado.

3.6 Control de calidad: Controlar la esterilidad de las soluciones.


Control de desarrollo: Incubar 24-48 horas a 30-37°C
Positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111 / Listeria grayii ATCC19120
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 / Staphylococcus aureus ATCC 6538P

4. CALDO LISTERIA UVM (medio comercial) Caldo selectivo de enriquecimiento


4.1 Fundamentos: Caldo selectivo de enriquecimiento LISTERIA UVM es preparado según la fórmula
descripta por Donnelly y Baigent y por MacCalin y Lee. Es utilizado para el
procedimiento de enriquecimiento en dos pasos para el aislamiento de Listeria a partir
de muestras de productos cárnicos.
4.2 Ingredientes: Extracto de carne .......................................................5 g
Cloruro de sodio ...................................................... 20 g
Fosfato dibásico de sodio........................................ 12 g
Triptosa.................................................................... 10 g
Extracto de levadura ..................................................5 g
Fosfato monobásico de potasio ............................1.35 g
Esculina ..................................................................... 1 g
Acido nalidíxico......................................................0.02 g
Acriflavina HCl .....................................................0.012 g
Agua destilada......................................................1000 ml
4.3 Preparación del medio: Suspender 54.4 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar
hasta disolución completa. Fraccionar. Esterilizar a 121 ºC durante 10 minutos.
4.4 Características del medio: Medio deshidratado: homogéneo, color beige
Medio preparado: suavemente opalescente, con fina precipitación, color ámbar
4.5 Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
30
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

5. CALDO NITRATO (Reducción de nitrato)


5.1 Fundamentos: Algunos microorganismos utilizan el nitrato para obtención de energía reduciéndolo a
nitrito o nitrógeno gas. Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo de
reducir nitrato a nitrito y/o nitrógeno gas. La presencia de nitrito en el medio se revela
con alfa-naftilamina y ácido sulfanílico, formándose un compuesto de color rojo. La
reducción de nitrito a nitrógeno molecular puede observarse por la producción de gas
en el medio o por el agregado de zinc.
Para esta prueba pueden emplearse medios líquidos y medios semisólidos

5.2 Ingredientes: Peptona ................................................................... 20 g


Nitrato de potasio ...................................................... 2 g
Agua destilada .................................................... 1000 ml
5.2.1 Para gérmenes exigentes
Caldo infusión corazón............................................ 25 g
Nitrato de potasio .......................................................2 g
Agua destilada .....................................................1000 ml

5.3 Preparación del medio: En ambos casos ajustar pH a 7.0. Distribuir aproximadamente 4 ml en tubos 16/150
con campanitas de Durham invertidas. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Controlar que no queden burbujas dentro de las campanitas.

5.4 Realización de la prueba: Inocular a partir de cultivo de 24 horas. Incubar 48 horas a 35 ºC

5.5 Lectura e interpretación: Observar las campanitas para detectar presencia de gas. Sobre el caldo determinar
la presencia de nitrito agregando 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B

5.6 Reactivos para la determinación de nitrito


SOLUCION A SOLUCION B
Acido sulfanílico...............8 g Dimetil-α-naftilamina..........5 g
Acido acético glacial….300 g Acido acético glacial.......300 g
Agua destilada……….1000 ml Agua destilada .............1000 ml

5.7 Interpretación de resultados:


Reducción de nitrato a nitrito positiva (sin producción de gas): cultivo + reactivos → rojo
Reducción de nitrato a nitrito positiva (con producción de gas): cultivo + reactivos → incoloro + zinc → incoloro
Reducción de nitrato a nitrito negativa: cultivo + reactivos → incoloro + zinc → rojo

5.8 Control de calidad: Reducción de nitrato positiva con producción de gas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Reducción de nitrato positiva sin producción de gas: Escherichia coli ATCC 25922
Reducción de nitrato a nitrito negativa: Enterococcus faecalis ATCC 29212

6. COLORACIÓN DE GRAM
6.1 Realización de la prueba: A partir de una colonia típica efectuar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y
fijar suavemente por calor. Teñir por el método de Gram
6.2 Lectura e interpretación: Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Listeria spp. son cocobacilos o
bacilos pequeños Gram positivos

31
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

7. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
7.1 Fundamentos: Este medio evalúa la capacidad de un microorganismo de hidrolizar almidón por
acción enzimática. Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidón al
0,1%. Utiliza lugol como revelador (solución de yodo utilizada en coloración de Gram)
7.2 Ingredientes: Agar-agar................................................................. 20 g
Extracto de carne .......................................................3 g
Cloruro de sodio .........................................................5 g
Almidón soluble ....................................................... 10 g
Agua destilada......................................................1000 ml
Como medio basal pueden utilizar medios comerciales (Agar infusión corazón, agar
tripteína soya, agar Base Sangre, otros).
7.3 Preparación del medio: Solución A: en 500 ml de agua destilada disolver el agar por calentamiento
Solución B: disolver el almidón en 250 ml de agua destilada, calentando suavemente.
No calentar en exceso debido a que el sobrecalentamiento puede hidrolizar el
almidón. Enfriar la solución A a 60 ºC. Mezclar la solución A y la solución B y
completar con el agua destilada restante. Ajustar pH a 7.2 – 7.5. Fraccionar
volúmenes adecuados para plaquear. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Plaquear.
7.4 Reactivo revelador: Solución de Lugol
Cristales de yodo....................................................... 5 g
Ioduro de potasio..................................................... 10 g
Agua destilada........................................................100 ml
7.4.1 Preparación: Solución madre: Disolver el ioduro de potasio en agua destilada. Agregar los cristales
lentamente y agitar hasta disolución. Filtrar y almacenar en frasco color caramelo.
Solución de trabajo: Diluir la solución madre 1:5 con agua destilada. Fraccionar en
frascos color caramelo. Preparar solución fresca cada 3 semanas.
7.5 Realización de la prueba: Inocular la superficie del medio en spot o en línea con la cepa a estudiar. Pueden
probarse varias cepas en una misma placa. Incubar a 35 ºC durante 48 horas.
7.6 Lectura e interpretación: Inundar la placa con lugol. La placa vira al color azul por la reacción del lugol con el
almidón. Una zona clara alrededor de la siembra indica que el microorganismo ha
hidrolizado el almidón.
Reacción positiva: zona clara alrededor del cultivo
7.7 Control de calidad: Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778
Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

8. HIDRÓLISIS DE HIPURATO
8.1 Fundamentos: Determina la capacidad de algunos microorganismos de hidrolizar hipurato sódico
produciendo ácido benzoico, manifestándose al añadir solución de cloruro férrico
8.2 Ingredientes: Caldo infusión corazón............................................ 25 g
Hipurato de sodio .................................................... 10 g
Agua destilada......................................................1000 ml
8.3 Preparación del medio: Disolver el caldo en agua destilada. Agregar el hipurato de sodio y disolver por
calentamiento. Ajustar pH a 7.4. Fraccionar 3 ml por tubo. Esterilizar a 121º C durante
15 minutos. Antes del uso o de la conservación, marcar el nivel del medio en cada tubo
con marcador para controlar la posible evaporación.
8.4 Reactivo revelador: Cloruro férrico 12%
8.4.1 Ingredientes: Cloruro férrico x 6 H2O ............................................ 12 g
Acido clorhídrico concentrado .................................2.5 ml
Agua destilada........................................................ 100 ml
8.4.2 Preparación: A 75 ml del agua destilada agregar 2.5 ml de ácido clorhídrico por las paredes del
recipiente. Luego adicionar 12 g de cloruro férrico. Disolver agitando suavemente. Llevar
a 100 ml con agua destilada estéril. La solución debe ser de color anaranjado.
8.5 Realización de la prueba: Inocular el medio con 1 ó 2 colonias de cultivo de 24 – 48 horas o de caldo denso.
Sembrar control negativo con Streptococcus grupo A ó un tubo sin inocular y control
positivo con cepa conocida de Streptococcus agalactiae.
32
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

8.6 Lectura e interpretación: Incubar a 35 ºC durante 7 días (10-14 días para cepas de lento desarrollo). Incubar
controles a igual temperatura. Antes de agregar el reactivo, llevar a volumen el caldo
hasta la marca con agua destilada estéril. Si el cultivo es densamente turbio,
centrifugar y usar el sobrenadante. Estérilmente, transferir 0.8 ml del sobrenadante a
tubos pequeños. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico. Agitar suavemente. Esperar 10-15
minutos, agitando ocasionalmente. La aparición de un precipitado que permanece
luego de 10 minutos de leída la reacción, indica resultado positivo. Si el precipitado se
redisuelve y no se mantiene luego de 10 minutos, la reacción debe ser considerada
negativa. Una alternativa metodológica más rápida es realizar una suspensión densa
del cultivo en 0,4 ml de solución acuosa al 1% de hipurato de sodio e incubar a 35 ºC
durante 2 horas. El producto final de la hidrólisis del hipurato es glicina y se detecta
agregando 5 gotas de ninhidrina (ninhidrina 3.5 g, acetona 50 ml, 1-butanol 50 ml),
incubar nuevamente 10 minutos.
Reacción positiva: desarrollo de color púrpura intenso
8.7 Control de calidad: Control positivo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615
Control negativo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813

9. MEDIO BASE DE ANDRADE (Utilización de hidratos de carbono)


9.1 Ingredientes: Proteosa peptona .................................................... 10 g
Extracto de carne ...................................................... 3 g
Cloruro de sodio ........................................................ 5 g
Indicador de Andrade .............................................. 10 ml
Agua destilada......................................................1000 ml
9.2 Indicador de Andrade
9.2.1 Ingredientes: Proteosa peptona .................................................... 10 g
Fucsina ácida ..........................................................0.5 g
Agua destilada........................................................100 ml
Hidróxido de sodio 1N ............................................. 16 ml
9.2.2 Preparación: Disolver la fucsina ácida en agua destilada, luego agregar hidróxido de sodio 1N.
Si luego de algunas horas la fucsina ácida no está lo suficientemente decolorada
agregar 1 ó 2 ml más de hidróxido de sodio 1N. El contenido de colorante de los
diferentes productos o lotes de fucsina ácida varía ampliamente y la cantidad de
hidróxido de sodio 1N necesario para cada producto debe especificarse en el rótulo.
El reactivo mejora al envejecer por lo tanto es conveniente preparar cantidades
suficientes para almacenar.
9.3 Hidratos de carbono: Se recomienda agregar al medio base esterilizado y enfriado a 60 ºC soluciones
estériles de hidratos de carbono.
9.3.1 Ingredientes: Hidrato de carbono .................................................. 10 g
Agua destilada .......................................................100 ml
9.3.2 Preparación: Preparar solución al 10% de cada hidrato de carbono con agua destilada y tubo estéril.
Los hidratos de carbono que pueden ser autoclavados: adonita, dextrosa, dulcita,
inositol, manita, salicina. Los medios que contengan glicerol deben autoclavarse
10 minutos a 121 ºC. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 minutos
Los hidratos de carbono que no deben ser autoclavados: arabinosa, celobiosa,
lactosa, ramnosa, sacarosa, xilosa. Estos deben ser esterilizados por filtración.
Filtrar la solución en forma estéril, a través de una membrana filtrante de 0.22 µ.
Realizar control de esterilidad de la solución filtrada en caldo nutritivo.
9.4 Preparación del medio: Mezclar los ingredientes del medio base, disolver mediante calentamiento suave
Ajustar el pH 7,1 – 7,2 luego de agregar el indicador. Fraccionar en volúmenes de
9 ml en tubos de vidrio con tapa a rosca. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC.
Agregar 1 ml de la solución de hidrato de carbono a 9 ml del medio base estéril.
Si se preparan volúmenes pequeños, mantener la relación. Concentración final 1%
9.5 Realización de la prueba: Inocular al medio completo una ansada ó 0,1 ml de un cultivo líquido
Incubar durante 24-48 horas a 35 ºC
9.6 Lectura e interpretación: Reacción positiva (acidificación): viraje al rosado
Reacción negativa: medio sin cambio. Dado que algunas cepas de Listeria fermentan
los hidratos de carbono lentamente, si el perfil de fermentación no es aceptable luego
de 48 horas, los medios deben ser incubados durante 48 horas más.
9.7 Control de calidad: Controlar la esterilidad de las soluciones
33
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

10. MEDIO BICAPA SANGRE DE CABALLO (HL)

10.1 Capa base


10.1.1 Ingredientes: Agar base Columbia .............................................1000 ml
10.1.2 Preparación del medio: Preparar el medio de acuerdo a las especificaciones. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC.
Colocar 10 ml por placa de Petri de 100 mm de diámetro. Dejar solidificar.
10.2 Capa superior
10.2.1 Preparación del medio: Añadir 4 ml de sangre estéril de caballo a 100 ml del agar base enfriado a 46 ºC.
Mezclar para homogeneizar. Agregar rápidamente 5 a 6 ml en la parte superior de la
capa base, inclinando las placas para difundir uniformemente la capa superior. Las
placas refrigeradas pueden almacenarse hasta 2 semanas. El pH final es 7,2 ± 0,2
10.3 Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio

11. MEDIO LMP AGAR BASE (selectivo para Listeria)

11.1 Fundamentos: Las vitaminas y minerales, peptonas y extracto de carne proporcionan nitrógeno, el
cloruro de sodio mantiene el equilibrio del medio. La glicina se utiliza para mejorar la
recuperación de Listeria spp.. El cloruro de litio y feniletanol se incorporan para la
inhibición de contaminantes. El suplemento selectivo Listeria se añade
luego de la esterilización para inhibir estafilococos, bacilos y especies de Proteus.

11.2 Ingredientes: Digerido de caseína pancreática............................... 5 g


Proteosa peptona Nº 3 .............................................. 5 g
Extracto de carne ...................................................... 3 g
Cloruro de sodio ........................................................ 5 g
Cloruro de litio ........................................................... 5 g
Glicina anhídrido.......................................................10 g
Feniletanol ...............................................................2.5 g
Agar ..........................................................................15 g
Agua destilada..................................................... 1000 ml
pH 7.3 a 25 ºC

11.3 Suplemento selectivo (Vial por 1 ml)


11.3.1 Ingredientes: Moxalactam ............................................................0.01g
11.3.2 Preparación: Reconstituir cada vial liofilizado agregando estérilmente 2 ml de agua destilada estéril.
Invertir varias veces el vial para homogeneizar la solución.

11.4 Preparación del medio: Suspender 50.5 g del medio deshidratado en agua destilada y calentar hasta
disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar
estérilmente el suplemento. Distribuir en placas de Petri y solidificar.
11.5 Características del medio: Medio deshidratado homogéneo y claro. En solución medio color ámbar ligeramente
opalescente. Suplemento liofilizado blanco o amarillento, seco. En solución limpio,
amarillo pálido.
11.6 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas

11.7 Lectura e interpretación: Observar las colonias bajo luz de transmisión oblicua. Colonias características de
Listeria muestran un color gris a azul con una base de apariencia cristalina

11.8 Control de calidad: Listeria monocytogenes ATCC 19114: Buen desarrollo


Bacillus subtilis ATCC 6633: Inhibición parcial
Enterococcus faecalis ATCC 29212: Inhibición completa
Escherichia coli ATCC 25922: Inhibición completa
Staphylococcus aureus ATCC 25923: Inhibición completa

34
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

12. MEDIO OXFORD MODIFICADO (selectivo para Listeria)

12.1 Fundamentos: Es un medio de cultivo selectivo y diferencial, contiene nutrientes necesarios para el
desarrollo de Listeria spp. Es diferencial para Listeria spp. debido a que el producto de
la hidrólisis de esculina en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de
color negro. La selectividad para Listeria spp., se obtiene por el agregado del suplemento
selectivo para Agar base Oxford modificado, debido a que contiene antibióticos que
inhiben total o parcialmente el desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra.

12.2 Agar base


12.2.1 Ingredientes: Agar base Columbia ................................................ 39 g
Esculina ..................................................................... 1 g
Citrato férrico de amonio ........................................ 0.5 g
Cloruro de litio ......................................................... 15 g
Agua destilada..................................................... 1000 ml

12.3 Suplemento (para 500 ml de medio)


12.3.1 Ingredientes: Cicloheximida .........................................................200 mg
Sulfato de colistina .................................................. 10 mg
Acriflavina ................................................................2.5 mg
Cefotetan ....................................................................1 mg
Fosfomicina ................................................................5 mg
Etanol 96% v/v........................................................ 2.5 ml
Agua destilada........................................................ 2.5 ml
12.3.2 Preparación: Disolver ingredientes sólidos en la mezcla de etanol / agua. Esterilizar por filtración.

12.4 Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a
121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente los suplementos.
Ajustar pH ±7.0. Distribuir en placas de Petri (15 ml aproximadamente) y solidificar
12.5 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas

12.6 Lectura e interpretación: Las colonias características de Listeria spp. se muestran como pequeñas, grisáceas,
rodeadas de halo negro. A las 48 horas se puede observar colonias con reflejos
verdosos y centro deprimido

MOX positivo MOX negativo

12.7 Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio


Listeria monocytogenes ATCC 19114: Buen desarrollo. Colonias pequeñas, oscuras, con halo oscuro
Listeria ivanovii ATCC 19119: Buen desarrollo. Colonias pequeñas, oscuras, con halo oscuro
Escherichia coli ATCC 25922: Desarrollo inhibido
Enterococcus faecalis ATCC 29212: Desarrollo inhibido
Proteus mirabilis ATCC 43071: Desarrollo inhibido

35
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

13. MEDIO PALCAM (selectivo para Listeria)


13.1 Fundamentos: Es un medio de cultivo selectivo y diferencial que contiene los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano. Es diferencial debido a que Listeria spp. hidroliza esculina que en
presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de color negro. Es selectivo para
Listeria spp., por el agregado del suplemento selectivo para agar base Palcam que
contiene antibióticos que inhiben en forma total o parcial el desarrollo de la flora presente
en la muestra y permiten la recuperación de Listeria spp.
13.2 Agar base
13.2.1 Ingredientes: Agar base Columbia ................................................ 39 g
D(-) manitol.............................................................. 10 g
Citrato férrico de amonio ........................................ 0.5 g
Esculina .................................................................. 0.8 g
D(+) glucosa ........................................................... 0.5 g
Cloruro de litio ......................................................... 15 g
Rojo de fenol .........................................................0.08 g
Agua destilada..................................................... 1000 ml
13.3 Suplemento (para 500 ml de medio)
13.3.1 Ingredientes: Agar base Columbia ................................................ 39 g
Esculina ......................................................................1 g
Citrato férrico de amonio .........................................0.5 g
Sulfato de polimixina B...............................................5 mg
Ceftazidima.............................................................. 10 mg
Acriflavina ............................................................... 2.5 mg
Agua destilada........................................................ 2.5 ml
13.4 Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a
121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente el suplemento.
Ajustar pH ± 7.2. Distribuir en placas de Petri (15 ml aproximadamente)

13.5 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas

13.6 Lectura e interpretación: Las colonias típicas de Listeria spp. se observan como verde grisáceas, rodeadas de
halo negro y pueden mostrar centro oscuro. A las 48 horas puede observarse
colonias con centro deprimido

Palcam positivo Palcam negativo

13.7 Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio


Listeria monocytogenes ATCC 19112: Muy buen desarrollo. Colonias grises a verdosas con centro y halo negro
Staphylococcus aureus ATCC 25923: Desarrollo positivo. Colonias amarillas con halo amarillo
Enterococcus faecalis ATCC 29212: Desarrollo positivo. Colonias grises con halo marrón verdoso

36
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

14. MEDIO SIM


14.1 Fundamentos: Medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y sulfuro
de hidrógeno en un mismo tubo. La movilidad se manifiesta por turbidez
alrededor de la punción de siembra. El triptofano puede ser oxidado para formar indol.
El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich,
originando un compuesto de color rojo. Los microorganismos productores de
sulfhídrico se observan por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
14.2 Ingredientes: Tripteína ...................................................................20 g
Peptona bacteriológica............................................6.1 g
Sulfato de hierro y amonio ......................................0.2 g
Tiosulfato de sodio ..................................................0.2 g
Agar .........................................................................3.5 g
Agua destilada......................................................1000 ml
pH final 7.3 ± 0.2
14.3 Preparación del medio: Suspender 30 g de medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar
agitando y hervir durante un minuto. Fraccionar aproximadamente 4 ml por tubo.
Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Solidificar en posición vertical
14.4 Realización de la prueba: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda
con aguja recta. Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe alcanzar dos
tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Realizar la
siembra en línea recta. Incubar durante 24 horas, a 35-37 °C.
14.5 Lectura e interpretación: Observar el desarrollo alrededor de la línea de punción. En cultivos positivos se
produce una zona de difusión del desarrollo más allá de la línea de siembra.
Los cultivos de Listeria spp. son móviles y producen un desarrollo típico en forma de
paraguas. Si fuera negativo, proseguir incubando otros 5 días y observar nuevamente
14.6 Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212

15. PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS


15.1 Fundamentos: Si las características morfo-fisiológicas y la reacción de catalasa indican Listeria spp.,
inocular placas de agar sangre para determinar la reacción hemolítica.
15.2 Realización de la prueba: El medio utilizado es agar sangre, constituido por un medio básico, adicionado con
5% de sangre desfibrinada de carnero. Secar la superficie del agar antes de su uso.
Dibujar un cuadriculado en la base de la placa marcando tantos espacios como
cepas a estudiar. Tomar una colonia típica a partir de una placa de TSA / TSYEA, y
depositar en forma de toque en cada espacio. Incubar 24-48 horas a 35 - 37°C.
15.3 Lectura e interpretación: En cultivos beta hemolíticos se observa una zona clara e incolora que rodea a la
colonia, debido a la destrucción total de los glóbulos rojos.
15.4 Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio

16. PRUEBA DE CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen)


16.1 Fundamentos: Para esta prueba se utilizan cepas de Staphylococcus aureus y Rhodococcus equi
productoras de betalisina. Algunas especies de Listeria producen una proteína
extracelular (factor CAMP), la cual actúa sobre los eritrocitos en forma sinérgica con
la betalisina. Se pueden emplear placas de agar sangre ovina, pero es preferible usar
el método de la doble capa.
16.2 Medio para capa basal *
16.2.1 Ingredientes: Agar base sangre Nº 2 ...........................................240 g
Agua destilada...................................................... 1000 ml
16.2.2 Preparación del medio: Disolver la base deshidratada en agua destilada mediante ebullición. Ajustar pH a 7.
Transferir a tubos o frascos. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Enfriar a 45 ºC
16.3 Medio sangre ovina **
16.3.1 Ingredientes: Medio basal ............................................................ 100 ml
Sangre ovina desfibrinada estéril ............................... 7 ml
16.3.2 Preparación del medio: Agregar sangre ovina al medio base estéril y fundido.

37
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

16.3 Medio completo


16.3.1 Preparación del medio: Distribuir 10 ml de medio basal* en placa para forma una capa. Dejar solidificar.
Agregar 3 ml del medio sangre ovina**, para formar capa muy fina.

Advertencia: Si el medio con sangre se agrega a placas de medio basal preparadas anteriormente,
es necesario colocarlas previamente en estufa a 36 ºC durante 20 minutos antes de
agregar la capa fina con sangre.

16.4 Cultivos patrones: Staphylococcus aureus NCTC 1803 Rhodococcus equi NCTC 1621

16.4.1 Mantenimiento: Cultivar en estrías, incubar a 36 ºC. Subcultivar cada treinta días.

16.5 Realización de la prueba: Trazar una línea de Staphylococcus aureus a lo largo de la placa y otra paralela y
alejada de Rhodococcus equi, en forma de inóculo fino. De igual manera sembrar
perpendicularmente a las cepas patrones los cultivos incógnita que se desean probar,
sin tocar la línea del S. aureus ni al R. equi, pero a distancia aproximada de 5 mm.
Pueden probarse simultáneamente varias cepas en la misma placa. Si se emplea el
método de doble capa, incubar a 36 ºC durante 12-18 horas. Si se hiciera la prueba
en monocapa de agar sangre, incubar a igual temperatura durante 24 horas.

16.6 Lectura e interpretación: Reacción positiva con S. aureus: zona de beta-hemólisis estimulada en la
intersección de la cepa incógnita. Se observa como una pequeña zona redondeada
de hemólisis. Si se observa una zona pequeña con R. equi, se considera negativa.
Reacción positiva con R. equi: zona ancha en forma de cabeza de flecha. Ver figura 1

Figura 1: Modelo de inoculación en placa de agar sangre de carnero.


Las líneas horizontales representan las estrías de cinco aislamientos.
Las líneas verticales representan las estrías de S. aureus (S) y R. equi (R)
Las líneas oblicuas indican las regiones de aumento de la hemólisis.

16.7 Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Listeria innocua ATCC 33090

16. PRUEBA DE CATALASA


Fundamentos de la prueba: Se detecta la presencia de la enzima catalasa utilizando como sustrato peróxido de
hidrógeno al 3%. Esta prueba puede ser realizada en portaobjeto o en tubo. No partir
de cultivos en medios con sangre, ya que, la enzima catalasa está presente en los
eritrocitos y cualquier arrastre del medio puede resultar en falsos positivos
Realización de la prueba: Tomar colonia de cultivo de 18-24 horas y depositarla sobre un porta. Añadir con
pipeta una gota de peróxido de hidrógeno al 3%; no homogeneizar el cultivo con el
ansa para evitar los falso positivos.
Lectura e interpretación: Se considera positiva cuando se observan burbujas de gas (02). Las especies de
Listeria son catalasa positiva, evidenciada por formación de burbujas de gas.
Control de calidad: Control positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212

38
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria

17. PRUEBA DE MOVILIDAD


Fundamentos de la prueba: Existen diferentes técnicas que permiten demostrar la movilidad bacteriana.
Listeria se observa en forma de bacilos delgados, cortos, con un movimiento de
rotación débil o por tumbos. Cocobacilos o bacilos largos que presenten movimiento
rápido de translación, no son Listeria spp..
En medios líquidos
Realización de la prueba: A partir de colonias típicas subcultivar en TSB o TSYEB. Incubar a 20 – 25ºC hasta
obtener turbidez (8 a 24 horas). Preparar montaje en fresco entre porta y cubreobjeto,
con una ansada del cultivo líquido y observar con inmersión en contraste de fases
En medios sólidos
Ingredientes: Peptona de caseína................................................. 20 g
Peptona de carne ....................................................6.1 g

Agar ........................................................................3.5 g
Agua destilada......................................................1000 ml
Preparación del medio: Disolver ingredientes en agua, calentar suavemente. Ajustar pH 7.3. Fraccionar 5 ml
por tubo. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Dejar solidificar en forma de columna.
Realización de la prueba: Sembrar con ansa aguja en el centro del medio, introduciendo la aguja hacia el fondo
y extraer siguiendo el mismo recorrido de entrada. Incubar a 25 ºC durante 48 horas.
Lectura e interpretación: Observar desarrollo alrededor de la línea de punción. En cultivos positivos se
produce zona de difusión del desarrollo a los lados de la línea de inoculación
Los cultivos de Listeria spp. son móviles y producen un desarrollo típico en forma de
sombrilla. Si fuera negativo, proseguir incubando otros 5 días y observar nuevamente
Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212

18. TRIPTEÍNA SOJA EXTRACTO DE LEVADURA CALDO (TSYE)


Ingredientes: Caldo tripteína soja.................................................. 30 g
Extracto de levadura ................................................. 6 g
Agua destilada..................................................... 1000 ml
Preparación del medio: Suspender los componentes sólidos en agua destilada y calentar hasta disolución.
Ajustar el pH a ± 7.3. Fraccionar en tubos con 6 ml de medio de cultivo. Esterilizar los
tubos a 121 ºC durante 15 minutos.
Realización de la prueba: Inocular con una colonia aislada
Lectura e interpretación: Incubar a 35 - 37 ºC durante 18-24 horas o hasta desarrollo satisfactorio
Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio. Desarrollo: Listeria monocytogenes ATCC 19111

19. TRIPTEÍNA SOJA EXTRACTO DE LEVADURA AGAR (TSYEA)


Para obtener el medio sólido, agregar a la fórmula anterior 12–18 g de agar en el
momento de la disolución. Para preparar estrías fraccionar en tubos 6 ml de medio.
Para preparar placas distribuir 15 ml de medio.
Realización de la prueba: Inocular con una colonia aislada
Lectura e interpretación: Incubar a 35 - 37 ºC durante 18-24 horas o hasta desarrollo satisfactorio
Control de calidad: Controlar la esterilidad del medio. Desarrollo: Listeria monocytogenes ATCC 19111

39

You might also like