Professional Documents
Culture Documents
Aislamiento, identificación
y caracterización de
Listeria monocytogenes
2008
AUTORES
Raquel Callejo
Mónica Prieto
Claudia Martínez
Lorena Aguerre
Florencia Rocca
Gisela Martínez
• SECCIÓN I: INTRODUCCIÓN
SECCIÓN I
1. INTRODUCCIÓN
El género Listeria está compuesto por bacterias gram positivas con bajo contenido G+C, estrechamente
relacionado con los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus.
Son bacilos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, no capsulados, catalasa positiva, móviles entre 10
y 25ºC (Collins et al., 1991).
Listeria ha sido aislada de diferentes sitios ambientales, como; suelo, agua, efluentes, de una gran variedad de
alimentos y de heces humanas y animales. El habitat natural de estos microorganismos es probablemente la
materia orgánica vegetal en descomposición y los rumiantes domésticos contribuyen al mantenimientos de
Listeria spp. en el ambiente rural a través de un ciclo continuo de enriquecimiento oral-fecal (Fenlon, 1999).
La amplia distribución de L. monocytogenes se debe a la capacidad de sobrevivir durante períodos de tiempo
prolongados en diferentes medios.
El género Listeria comprende seis especies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri
y L. grayi. Las dos especies potencialmente patógenas son L. monocytogenes y L. ivanovii.
L. monocytogenes no fue considerado un patógeno animal hasta fines de la década del 70. A principios de los
años 80 emerge como uno de los patógenos humanos de origen alimentario más importante. A partir de ese
momento, la literatura sobre Listeria comenzó a incrementarse y a partir de 1983 una serie de brotes epidémicos
humanos en Norteamérica y Europa establecieron claramente a la listeriosis como una grave infección alimentaria
(Bille, 1990). Los alimentos más frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos y
productos lácteos, patés y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general productos industrializados,
refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de cocción o calentamiento previo (Farber and Peterkin,
1991). Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón de la cadena productiva, así como también en el
almacenamiento en frío.
En la actualidad, se estima que L. monocytogenes es la principal causa de muerte originada por bacterias de
origen alimentario en USA, aproximadamente se registran 2500 casos de listeriosis humana por año, incluyendo
500 muertes (Mead et al., 2006).
En rumiantes, la infección por Listeria es transmitida por consumo de silaje en mal estado, en el cual la bacteria se
multiplica rápidamente, dando lugar a brotes en ganado (Fenlon, 1999).
El genoma de L. monocytogenes fue secuenciado recientemente y posee un cromosoma circular de 2.944.528 pb
con un promedio de G+C de 39%. Se han identificado 2853 genes, sin embargo al 35.3% no se les conoce
función. En el caso de L. innocua posee un único cromosoma circular de 3.011.209 pb con un contenido promedio
de G+C del 37%. Dentro del género Listeria, estas dos especies presentan alto grado de homología en la
secuencia del 16S rRNA, siendo las de mayor cercanía taxonómica (Von Both et al., 1999).
1.1 Serovariedades
Existen hasta el momento 13 serovariedades reconocidas de L. monocytogenes; 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a,
4ab, 4b, 4c, 4d, 4e y 7, clasificados en base a los antígenos somáticos (O) y flagelares (H). Sin embargo, tres de
ellas (1/2a, 1/2b y 4b), han sido aisladas en más del 90% de los casos humanos y animales (Low et al., 1993).
Otras serovariedades, como la 1/2c, ha sido encontrada como contaminante de alimentos (Espaze el al., 1991).
Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y L. seeligeri. L. innocua está representada sólo
por tres serovariedades y es considerada una variante no patógena de L. monocytogenes.
La serotipificación de L. monocytogenes es el primer método de subtificación y permite identificar rápidamente los
aislamientos que necesitan ser analizados posteriormente por electroforesis en campo pulsado (PFGE).
Tabla 1. Serovariedades asociadas de las diferentes especies de Listeria
Especie Serovariedad
Listeria monocytogenes 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7
Listeria ivanovii 5
2
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.2 Epidemiología
Estudios realizados determinaron que L. monocytogenes es un patógeno con estructura clonal y el potencial
patogénico difiere entre los diferentes grupos clonales (Piffaretti et al., 1989; Wiedmann et al., 1997), así como en
la especificidad por el huésped y la adaptación a diferentes nichos ecológicos (Boerlin and Piffaretti, 1991).
Rasmussen et al. (1995) demostraron que L. monocytogenes se divide en tres linajes según la secuencia de los
genes de virulencia hly, iap y el gen fla que codifica para la flagelina.
Wiedmann et al., (1997) confirmaron la existencia de los tres linajes genéticamente distintos, mediante
ribotipificación y PCR-RFLP del gen de virulencia hly. El linaje I contenía las serovariedades 1/2b, 3b, 3c y 4b, el
linaje II comprendía las serovariedades 1/2a, 1/2c y 3a y el linaje III las serovariedades 4a y 4c.
Los aislamientos del linaje I incluían los clones epidémicos de L. monocytogenes que eran responsables de un
gran número de casos humanos de listeriosis (Sauders et al, 2006). Los aislamientos del linaje II provenían de
alimentos y ambiente (Kathariou, 2002), mientras que los aislamientos del linaje III eran fundamentalmente de
animales (Kathariou, 2002).
Estudios de subtipificación identificaron cuatro clones epidémicos (ECI, ECII, ECIII, ECIV) (Chen et al., 2007), Entre
los clones epidémicos, un cluster de la serovariedad 4b emergió como un grupo clonal cosmopolita, asociado a
varios brotes en diferentes países, relacionados con los siguientes alimentos: coles (Nueva Escocia, 1981), queso
blando (Suiza, 1983 a 1987 y California, 1981) y lengua de cerdo (Francia, 1992) (Kathariou, 2002). Ver Tabla 2.
El clon epidémico ECII fue identificado en USA (1998-1999), en un brote en varios estados, asociado a salchichas
y en el 2002 a un brote por carne de pavo feteada (Kathariou, 2002).
El clon ECIV (serovariedad 4b), causó un brote producido por paté (Reino Unido, 1988) y por vegetales (Boston, 1983).
El clon ECIII corresponde a aislamientos de la serovariedad 1/2a y fue la causa de un brote por salchichas (USA,
1989) y carne de pavo (USA, 2000). Estos aislamientos ECIII estaban relacionados epidemiológicamente, dado
que se encontraron en la misma planta procesadora de alimentos y correspondían a idénticos subtipos, de
acuerdo a diferentes estudios de subtipificación por métodos moleculares.
Sauders et al. (2006), demostraron que muchos casos esporádicos eran también producidos por clones
epidémicos. Por lo tanto, la identificación y el control de estos clones epidémicos son importantes para entender la
transmisión a largo plazo de L. monocytogenes y establecer sistemas eficientes de vigilancia para este patógeno.
L. monocytogenes no solamente ha sido un importante modelo para la investigación inmunológica sino que también ha
servido para el análisis de los mecanismos moleculares del parasitismo intracelular (Cossard and Menguad, 1989).
Nº de Nº de
País Año Serotipo Alimento Referencia
casos muertes
Halifax, Canadá 1981 41 18 4b Coles Schlech et al.(1983)
Massachussets, USA 1983 49 14 4b Leche Fleming et al.(1985)
Vaud, Suiza 1983-87 122 34 4b Queso Bula et al.(1995)
California, USA 1985 142 48 4b Queso Linnan et al.(1995)
Reino Unido 1989-90 300 0 4b Paté McLauchlin et al. (1991)
Francia 1992 279 88 4b Lengua de cerdo Jacquet et al.(1995)
Francia 1993 39 0 4b Paté de cerdo Goulet et al.(1995)
Francia 1995 36 0 4b Queso blando Goulet et al.(1995)
Multiestados, USA 1998-99 40 4 4b Carne feteada CDC (1998)
Finlandia 1988-99 25 6 3a Manteca Lyytikainen et al. (2000)
Francia 1999 29 7 NI Lengua de cerdo WHO (2000)
Multiestados, USA 2000 29 4 4b Pavo feteado CDC (2002)
Carolina del Norte, USA 2000-01 12 0 4b Queso CDC (2002a)
Multiestados, USA 2002 46 7 NI Pollo y pavo CDC (2002b)
Québec, Canadá 2002 17 0 NI Queso Gaulin et al.(2003)
NI: serovariedad no informada
3
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Las poblaciones de riesgo son: mujeres en estado de gravidez, ancianos, neonatos, personas
inmunocomprometidas (cáncer, transplantes renales, SIDA, diabetes, terapias inmunosupresoras, alcoholismo).
4
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.5.1 Información y criterios de interpretación para pruebas de sensibilidad por microdilución en caldo
1.5.2 Condiciones del estudio
Medio: Caldo Mueller Hinton y con ajuste de cationes y sangre lisada (2.5 ml al 5% v/v)
Inoculo: Suspensión directa de las colonias con turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland
Incubación: 35 ºC, en atmósfera normal durante 20 a 24 horas
5
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.6 Tratamiento
Los antibióticos de elección son la penicilina o la ampicilina solos o asociadas a gentamicina.
La combinación de trimetoprima y sulfametoxazol se ha utilizado con éxito en pacientes alérgicos a penicilinas,
considerándose en la actualidad una terapia alternativa.
1.7 Patogénesis
El motivo por el que L. monocytogenes produce una grave infección, se debe a la capacidad que tiene de inducir
su propia fagocitosis por células fagocíticas y no fagocíticas del huésped, seguido por la replicación en el interior
de las mismas y su transferencia directa a otra célula. Como L. monocytogenes es un microorganismo intracelular,
se disemina protegido de las defensas del huésped incluyendo anticuerpos y complemento (Cossart et al., 2003).
Antes de alcanzar el intestino, las bacterias ingeridas deben soportar el ambiente adverso del estómago, al menos
13 proteínas de estrés oxidativo y 14 proteínas de “shock” tóxico, son inducidas bajo condiciones de estrés en
L. monocytogenes (Vázquez-Boland et al., 2001b).
Las bacterias ingresadas con el alimento son captados por los enterocitos o la células M próximas a las placas de
Peyer en el intestino delgado, multiplicándose luego en las células fagocíticas. Las bacterias son transportadas
por los macrófagos del intestino al hígado o al bazo, donde son destruidas por los neutrófilos y las células de
Kupffer. Si la respuesta inmune mediada por células T del huésped es inadecuada, las listerias se multiplican en
los hepatocitos y en los macrófagos y son llevadas por la sangre a varios órganos, especialmente al cerebro y/o al
útero, donde atraviesan la barrera hematoencefálica o la placenta. Una intrincada serie de factores de virulencia
son producidos por L. monocytogenes para facilitar cada paso en su proceso de invasión.
1.7.1 Factores de virulencia
Varios factores de L. monocytogenes que median los pasos claves de la infección, han sido identificados.
(a) Adhesión e invasión: Las células de Listeria inicialmente se adhieren a los enterocitos intestinales y
penetran la pared intestinal. El proceso es mediado por la internalina (InlA) y InlB (otro miembro de la
familia de internalinas, caracterizada por la presencia de unidades repetitivas de leucina) y/o otros factores
de internalización. En respuesta, las bacterias quedan dentro del fagosoma en las células del huésped.
La entrada de L. monocytogenes dentro de la célula humana es mediada por la interacción de la proteína
de superficie, internalina, con su receptor humano E-caderina. La interacción internalina-E-caderina es
especie específica y se basa en la presencia de un solo aminoácido de diferencia en el residuo 16 en la
molécula de E-caderina, el cual es prolina en humanos y ácido glutámico en ratón. Evidencias
epidemiológicas apoyan el rol de la internalina en la listeriosis humana, no solo para atravesar la barrera
intestinal, sino también para cruzar la barrera hematoencefálica y la placentaria.
(b) Vacuola primaria de lisis: La listeriolisina O (LLO) y la fosfolipasa C fosfatidil inositol específica (PI –PLC)
lisan el fagosoma para permitir el escape de las bacterias de la vacuola fagocítica.
(c) Desarrollo intracelular: La propagación bacteriana dentro del citosol es mediada por un transportador de
fosfato hexosa bacteriano (Hpt) y una ligasa protein lipoato (LpLA1) que permiten que L. monocytogenes
capte de la célula huésped fuentes de carbono.
(d) Diseminación de una célula a otra: Una vez que las bacterias se multiplicaron en el citosol de la célula
huésped, se desplazan utilizando la nucleación de filamentos de una proteína, actina (ActA). Esto produce
un movimiento dirigido de las bacterias hacia la membrana celular de la célula huésped y promueve
estructuras semejantes a pseudopodos que se extienden dentro de las células vecinas. Este mecanismo
hace que se infecte la célula y la bacteria quede dentro de una vacuola de doble membrana (Cossart et
al., 2003). (Tilney and Portnoy, 1989).
(e) Lisis de la vacuola de doble membrana: La fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC) de Listeria
junto con la LLO lisan la vacuola de doble membrana y liberan las bacterias que infectan la célula vecina.
6
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
El esquema del ciclo de vida y las fotografías electrónicas corresponden a la publicación de Tilney y Portnoy (1989)
Los genes de virulencia de Listeria spp., se organizan dentro de unidades genéticas conocidas como islas de
patogenicidad (PAIs). Las PAIs son adquiridas por la bacteria por mecanismos de transferencia de información
genética horizontal, algunas veces como parte de un elemento móvil genético, por lo cual son importantes en la
evolución de la virulencia bacteriana.
Seis de los factores de virulencia responsables del parasitismo intracelular de L. monocytogenes ( prfA, plcA, hly,
mpl, actA y plcB ), están organizados en una isla cromosomal de 9kb conocida como grupo de genes de virulencia
PrfA dependiente; isla denominada como isla 1 de patogenicidad de Listeria (LIPI-1) (Figura 2) (Vázquez-Boland et
al., 2001a; Vázquez-Boland et al., 2001b).
El locus de virulencia está formado por tres unidades transcripcionales (Figura 2). La posición central está
ocupada por el monocistrón hly , que codifica para la LLO requerida para la ruptura de la vacuola fagocítica y la
liberación de la bacteria dentro del citoplasma. Corriente abajo del monocistrón hly , y en el mismo sentido de
transcripción se encuentra el operón lecitinasa de 5.7Kb que comprende tres genes: mpl, actA y plcB y tres
pequeños marcos de lectura abiertos (ORFs) adicionales (Figura 1). El gen act A codifica para la proteína ActA, el
gen plcB para la fosfolipasa C fosfatidilcolina específica (PC-PLC), y el gen mpl codifica para la proteasa, la cual
procesa extracelularmente el propéptido inactivo de la PC-PLC.
Figura 2. Organización transcripcional y física del grupo de genes de virulencia (LIPI-1) de Listeria monocytogenes.
7
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
8
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.9 Bibliografía
• Aureli P, G C Fioruci, D Caroli, G Marchiaro, O Novara, L Leone, and S Salmaso. 2000. An outbreak of
febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N Engl J Med.
342:1236–1241.
• Bayles D O, B A Annous, and B J Wilkinson. 1996. Cold stress proteins induced in Listeria monocytogenes
in response to temperature downshock and growth at low temperatures. Appl Environ Microbiol. 62:1116–111.
• Blenden D C, E H Kampelmacher, and M J Torres-Anjel. 1987. Listeriosis. J Am Vet Med Assoc.
191:1546–1551.
• Cossart P, Pizarro-Cerda J, Lecuit M. 2003. Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes:
functional mimicry to subvert cellular functions. Trends Cell Biol. 13: 23–31.
• Chen Y, W Zhang, and S J Knabel. 2007. Multi-virulence-locus sequence typing identifies single nucleotide
polymorphisms which differentiate epidemic clones and outbreak strains of Listeria monocytogenes. J Clin
Microbiol. 45:835–846.
• Cossart P, and J Mengaud. 1989. Listeria monocytogenes, a model system for the molecular study of
intracellular parasitism. Mol Biol Med. 6:463–474.
• Dalton C B, C C Austin, J Sobel, P S Hayes, W F Bibb, L M Graves, B Swaminathan, M E Proctor, and P
M Griffin. 1997. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N Engl J
Med. 336:100–105.
• Duché O, F Trémoulet, P Glaser, and J Labadie. 2002. Salt stress proteins induced in Listeria
monocytogenes. Appl Environ Microbiol 48:1494-1498.
• Farber J M, P I Peterkin, A O Carter, P V Varughese, F E Ashton, and E P Ewan. 1991. Neonatal
listeriosis due to cross-infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting. J Infect Dis. 163:927–
928.
• Farber J M, and P I Peterkin. 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol Rev. 55:476–
511.
• Kathariou, S. 2002. Listeria monocytogenes virulence and pathogenicity, a food safety perspective. J Food
Prot. 65:1811–1829.
• Klatt E C, Z Pavlova, A J Teberg, and M L Yonekura. 1986. Epidemic neonatal listeriosis at autopsy. Hum
Pathol. 17:1278–1281.
• Lorber B. 1996. Listeriosis. Clin Infect Dis. 24:1–11.
• Linnan M J, L Mascola, X D Lou, V Goulet, S May, C Salminen, D W Hird, M L Yonekura, P Hayes, R
Weaver, A Audurier, B D Plikaytis, S L Fannin, A Kleks, and C V Broome. 1988. Epidemic listeriosis
associated with Mexican-style cheese. N Engl J Med. 319:823–828.
• McLauchlin, J. 1990. Human listeriosis in Britain, 1967–1985, a summary of 722 cases. 2. Listeriosis in non-
pregnant individuals, a changing pattern of infection and seasonal incidence. Epidemiol Infect. 104:191–201.
• Mead, P S, E F Dunne, L Graves, M Wiedmann, M Patrick, S Hunter, E Salehi, F Mostashari, A Craig, P
Mshar, T Bannerman, B D. Sauders, P Hayes, W Dewitt, P Sparling, P Griffin, D Morse, L Slutsker, and
B Swaminathan. 2006. Nationwide outbreak of listeriosis due to contaminated meat. Epidemiol Infect
134:744–751.
• Phan-Thanh, L, and T Gormon. 1997. Stress proteins in Listeria monocytogenes. Electrophoresis 18:1464–1471.
• Tilney, LG, and DA Portnoy. 1989. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular
bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J Cell Biol. 109:1597–1608.
• Trémoulet F, O Duché, A Namane, B Martinie, and J C Labadie. 2002. Comparison of protein patterns of
Listeria monocytogenes grown in biofilms or in planktonic mode by proteomic analysis. FEMS Microbiol Lett.;
210 (1):25-31
• Sauders, B D, Y Schukken, L Kornstein, V Reddy, T Bannerman, E Salehi, N Dumas, B J Anderson, J P
Massey, and M Wiedmann. 2006. Molecular epidemiology and cluster analysis of human listeriosis cases in
three U.S. states. J Food Prot. 69:1680–1689.
• Vázquez-Boland J, Domínguez-Bernal G, Gónzalez-Zorn B, Kreft J, Goebel W. 2001ª. Pathogenicity
Islands and Virulence Evolution in Listeria. Microb Infect; 3: 571-584.
• Vázquez-Boland J, M Kuhn, P Berche, T Chakraborty, G Domínguez-Bernal, W Goebel, B González-
Zorn, J Wehland, J Kreft. 2001.Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clin Microbiol
Rev. 14(3): 584-640.
9
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN II
INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes EN MUESTRAS CLÍNICAS
1. HEMOCULTIVOS
Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar
mascara protectora.
• Utilizar siempre guantes
• Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
1.1 Definiciones
El diagnóstico bacteriológico de la bacteriemia depende del estudio de los hemocultivos.
Debido a la sensibilidad de los métodos de cultivo, el procedimiento debe ser controlado cuidadosamente desde la
etapa pre-analítica (recolección de la muestra) para evitar la interpretación errada de la recuperación de
microorganismos que corresponden a comensales de piel.
El volumen total de sangre debe ser extraído por punción venosa a partir de dos sitios anatómicos distintos para permitir
la evaluación en el laboratorio ante la aparición de un microorganismo comensal de piel aislado en un solo hemocultivo
NOTA: El intervalo en la toma dependerá de la gravedad del cuadro y la urgencia en el inicio del antibiótico
No es costo / efectivo sacar más de 2 muestras de hemocultivo, excepto en situaciones donde es
necesario descartar microorganismos contaminantes Ej. Pacientes con dispositivos en los cuales se aislan
estafilococos coagulasa negativa, Corynebacterium sp., que pueden NO ser contaminantes.
Listeria monocytogenes
11
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.4 Flujograma
Hemocultivo
Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilo Gram +
catalasa +
Serotipificación
1.5.2 Procedimiento
• Incubar las botellas de hemocultivo a 35 ºC durante 5 días.
• Mantener las condiciones de incubación para permitir la recuperación del microorganismo y en lo posible
incubar con agitación o rotación de las botellas.
• Examinar las botellas diariamente tanto si la detección de desarrollo positivo es automatizada o por
inspección visual.
En caso de sistemas manuales de detección de desarrollo, realizar al menos un subcultivo a ciegas en agar sólido
a partir de las botellas que no presentan signos visibles de desarrollo bacteriano
En caso de aparición de signos de desarrollo bacteriano en la botella, subcultivar inmediatamente en agar sangre
y realizar un extendido en portaobjeto para coloración de gram
12
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
• Ansa
• Cabina de bioseguridad
• Incinerador de ansas
• Microscopio con lente de inmersión 100X de magnificación
• Portaobjeto de vidrio
NOTA: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o la muestra, así como protegerá al operador
• Aceite de inmersión
• Agar tripteína soya con 5 % de sangre ovina para prueba de CAMP
• Bilis esculina agar
• Equipo colorantes para Gram
• Estrías de agar tripticasa soya
• Medio SIM
• Peróxido de hidrógeno al 3% (prueba de catalasa)
1.6.3 Procedimiento
Día 1 Comentarios
• Observación de bacilos pequeños o cocobacilos gram positivos En los primocultivos, muchas veces
L. monocytogenes no evidencia beta hemólisis
• Desarrollo de colonias pequeñas con beta hemólisis positiva
• Siembra de bilis esculina, prueba de CAMP y medio SIM a Las pruebas se detallan en
temperatura ambiente la SECCIÓN III
Día 2
13
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2. LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Cuando se procesan hemocultivos, mantener las botellas dentro de la cabina de bioseguridad o utilizar
mascara protectora.
• Utilizar siempre guantes
• Utilizar descartador de agujas. Nunca intentar colocar la tapa protectora sobre la aguja manualmente
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
2.1.2 Muestra
• El LCR se obtiene por punción lumbar o a partir de derivaciones ventriculares
• El LCR se obtiene por aspiración transcutánea, por lo tanto se trata de un fluido estéril y cualquier
microorganismo recuperado en la siembra del material debe ser considerado un patógeno potencial.
2.1.3 Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito
• No refrigerar
• Rotular la muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar,
derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• Registrar las características fisicoquímicas del LCR (volumen, celularidad, características macroscópicas)
IMPORTANTE: Las características fisicoquímicas del LCR en una infección por Listeria pueden confundirse con
las observadas en las meningitis virales, pudiendo desorientar el diagnóstico. El LCR se
caracteriza por la presencia de más de 1000 células por mm3, pudiendo encontrarse según la
evolución del cuadro, polimorfonucleares o mononucleares; la proteinorraquia varía desde un
valor normal hasta aproximadamente 700 mg/100 ml; la glucorraquia baja en la mitad de los
casos. El aspecto del LCR rara vez es purulento. El microorganismo puede observarse o no al
Gram pero habitualmente desarrolla en los medios de cultivo comunes.
Nota: el uso de cabina de bioseguridad evitará la contaminación del cultivo o muestra, así como protegerá al
operador
2.2.2 Reactivos
• Aceite de inmersión
• Equipo de colorantes para Gram
14
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2.2.3 Procedimiento
Día 1 Comentarios
2.3.3 Procedimiento
Día 1 Comentarios
Día 2 Comentarios
• Examinar las placas y caldos a las 24 horas para Colonias sospechosas: pequeñas convexas,
detectar evidencia macroscópica de desarrollo transparentes-grisáceas con beta hemólisis difusa
bacteriano. En caso negativo, reincubar La observación microscópica de bacilos pequeños o
• Realizar coloración de Gram y prueba de catalasa cocobacilos gram positivos, la presencia de colonias
de colonias sospechosas en placa de agar tripteína pequeñas con beta hemólisis difusa y catalasa positiva
soya representa una fuerte sospecha de L. monocytogenes que
debería ser informada al médico tratante en forma
• Subcultivar en estría de agar tripteína soya inmediata
Día 3 Comentarios
15
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
2.4 Flujograma
LCR
Agar sangre
Agar tripteína soya
Caldo nutritivo
Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilo Gram +
catalasa +
Serotipificación
16
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3. MATERIA FECAL
El procedimiento se adaptó con modificaciones menores del descrito por Sauders y col. (2005)
3.1 Recolección y transporte de muestra
3.1.1 Materiales
• Frasco estéril tapa rosca para coprocultivo
3.1.2 Muestra
• El estudio de L. monocytogenes en materia fecal puede ser requerido en caso de cuadros de gastroenteritis
febril asociado al consumo de alimentos contaminados o estudios de portación en investigaciones
epidemiológicos.
• La muestra debe obtenerse en el período agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento con
antimicrobianos. Se recoge una muestra de una evacuación espontánea reciente, en frasco estéril. En caso
de no poderse obtener la muestra, se realiza una hisopado rectal. Para los estudios epidemiológicos de
portación fecal, las muestras de heces son más productivas que los hisopados rectales.
3.1.3 Transporte y recepción
• Remitir al laboratorio refrigerada en forma urgente y alertar que la muestra está en tránsito
• Rotular muestra con información demográfica, fecha, hora y sitio de recolección (punción lumbar, derivación ventricular)
• Procesar la muestra en forma inmediata
• La muestra debe ser procesada inmediatamente se puede mantener a 4 ºC por 48 horas.
• Para muestras que requieran mayor tiempo de almacenamiento, congelar a –20 ºC y enviar al laboratorio
acondicionada con hielo seco
17
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3.2.4 Procedimiento
Día 1 Comentarios
• Incubar 24 horas a 30 ºC
Día 2 Comentarios
Día 3 Comentarios
Día 4 Comentarios
18
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
3.3 Flujograma
MOX Fraser
Sembrar en MOX
Incubar 24 horas a 30 ºC
Colonias sospechosas
Agar sangre
Agar tripteína soya
Caldo nutritivo
Colonia sospechosa
β-hemólisis +
cocobacilos Gram +
catalasa +
Serotipificación
Referencias
Sauders B, D Pettit, B Currie, P Suits, A Evans, K Stellrecht, D Dryja, D Slate and M Wiedmann. 2005.Low
Prevalence of Listeria monocytogenes in human stool. J Food Prot. 68: 178-81.
4. OTROS MATERIALES
• Materiales de sitios normalmente estériles: Además de sangre y líquido cefalorraquídeo; líquido articular,
liquido amniótico, líquido pericárdico, líquido pleural, placenta y tejido fetal.
La siembra se realiza en los medios indicados en el procedimiento descripto para líquido cefalorraquídeo
• Materiales de sitios no estériles : Se deberá incluir un paso de enriquecimiento en caldo nutritivo incubado en
frío (4 ºC) y/o siembra en caldos y medios selectivos según el procedimiento descripto para materia fecal.
19
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Catalasa + - - -
Vancomicina S R R S/R
Movilidad + - - -/+
Producción SH2 - - + -
Bilis Esculina + - - +
NaCl 6.5% + - - +
Beta hemólisis V - - V
L. monocytogenes
L. welshimeri
londoniensis
L. seeligeri
Características
L. innocua
L. ivanovii
L. grayi
Hemólisis beta - - ++ ++ + + -
Prueba de CAMP
S. aureus - - - - + + -
R. equi - - + + -/+ - -
Fermentación de:
Manitol + - - - - - -
L-ramnosa V V - - + - V
D-Xilosa - - + + - + +
Hidrólisis de hipurato - + + + + No determinado No determinado
Reducción de nitratos - - - - - No determinado No determinado
1/2a,1/2b,1/2c,
4ab 1/2a, 1/2b
3a, 3b, 3c, 4a, 1/2b, 4c
Serotipo Específico 6a 5 5 1/2c, 4b
4ab, 4b, 4c, 4d, 6a, 6b
6b 4d, 6b
4e, 7
Patogenicidad murina - - + ? + - -
Suelo, Suelo,
alimento, alimento, heces.
Ecología No No
Heces. Patógeno No patógeno No patógeno
patógeno patógeno
Patógeno humano y
animal animal
20
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN IV
Consideraciones de bioseguridad
• Consideraciones generales para patógenos clase II.
• Utilizar cabina de bioseguridad para prácticas microbiológicas con potencial formación de aerosoles.
• Utilizar siempre guantes
• La presencia de mujeres embarazadas e individuos potencialmente inmunodeprimidos debe estar
absolutamente prohibida en áreas donde se manipule Listeria monocytogenes
1.2.1 Materiales
• Bolsas rojas para descarte de material patológico
• Bloque térmico 100 ºC
• Gradilla para tubo eppendorf
• Guantes, guardapolvo
• Microcentrífuga
• Pipeta y tips para preparación de templado
• Tips con filtro: 100 μl, 200 μl
• Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
1.2.2 Reactivos
• Agua tridestilada estéril
• Buffer lisis para PCR
1.2.3 Procedimiento
• Sembrar la cepa en agar nutritivo o agar sangre en reaislamiento para obtener colonias aisladas
• Suspender con ansa 3 ó 4 colonias en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril con 50 μl de buffer lisis para PCR
• Calentar a 99 ºC en bloque térmico durante 15 minutos
• Dejar enfriar a temperatura ambiente y agregar 100 μl de agua tridestilada estéril
• Centrifugar a máxima velocidad durante 1 minuto
• Utilizar el sobrenadante como templado
• Guardar en freezer de -20 ºC
21
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.3 PCR
1.3.1 Materiales
• Bolsas rojas para descarte de material patológico
• Cuba de electroforesis y fuente de poder
• Gradillas para tubo eppendorf
• Gradilla refrigerada para tubos de PCR
• Guantes, guardapolvo
• Hielo
• Kit de pipetas para PCR. Rangos: 200-1000 μl, 20-200 μl, 5-40 μl, 0.5-10 μl
• Pipeta y tips para siembra de geles
• Pipeta y tips para siembra de templado
• Termociclador
• Tips con filtro: 10μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl
• Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
• Tubos para PCR 0.2 ml estériles
• Sistema de documentación de geles: Software Gel Doc
1.3.2 Reactivos
• Agarosa para biología molecular
• Agua tridestilada estéril
• Buffer de corrida 6X
• Buffer TAE 1X
• Marcadores de peso molecular
• Oligonucleótidos
lmo0737 For: 5´AGGGCTTCAAGGACTTACCC3´
Rev: 5´ACGATTTCTGCTTGCCATTC3´
22
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.3.4 Procedimiento
Realizar la PCR según el siguiente protocolo
Reactivos 1 reacción
Buffer 10X 5 μl
dNTPs (2,5mM) 1 μl
Oligonucleótidos 5 μl
ADN templado 2 μl
VOLUMEN TOTAL 50 μl
1.5 Ciclado
Cargar en el termociclador el siguiente programa de amplificación
Desnaturalización 94 ºC 40 segundos
1.6 Electroforesis
• Preparar un gel de agarosa al 2% en buffer TAE 1X
• Agregar 10 μl de buffer de corrida 6X a cada muestra y sembrar 10 μl por calle
• Sembrar 6 μl de marcador de peso molecular 100 pares de bases (5 μl de marcador + 1 μl buffer de corrida 6X)
• Realizar electroforesis a 100 voltios durante 40 minutos
• Teñir el gel en solución de bromuro de etidio durante 30 minutos
• Documentar resultado
1.7 Precauciones generales
• Utilizar guantes en todos los pasos, inclusive para retirar los tubos del termociclador una vez finalizado el ciclado
• Descartar el material de plástico (tips, eppendorf), en bolsa roja
• Manipular con cuidado el gel para ser teñido, evitando salpicaduras de la solución de bromuro de etidio.
Utilizar siempre guardapolvo y guantes
• Una vez documentado, descartar el gel en bolsa roja
1.8 Interpretación de los resultados
• Se pueden obtener 5 perfiles de bandas diferentes: P-1/2a, P-1/2b, P-1/2c, P-4b y P-list (ver figura 1)
• Para las cepas que no se obtengan fragmentos de amplificación, repetir una vez mas desde el paso 1
1.9 Reactivos y soluciones
1. Agua tridestilada estéril
Autoclavar agua tridestilada en frascos o botellas con tapa a rosa de 100ml y 50 ml
2. Bromuro de etidio. Solución stock (10mg/ml)
Agregar 1 g de bromuro de etidio a 100 ml de agua destilada. Agitar con agitador magnético durante varias
horas para asegurarse que el colorante se haya disuelto. Envolver el recipiente en papel metálico o transferir
la solución a un frasco color caramelo y mantener a temperatura ambiente
Los materiales contaminados con bromuro de etidio deben ser descartados en recipientes debidamente
identificados.
3. Decontaminación de soluciones acuosas de bromuro de etidio (Lunn y Sansone 1987)
• Agregar 1 gramo de carbón activado por cada 1000 ml de solución de bromuro de etidio a descartar
• Mantener 1 hora a temperatura ambiente agitando intermitentemente
• Filtrar la solución a través de papel de filtro Whatman Nº1
• Descartar el filtrado
• Sellar el filtro con carbón activado, colocar en bolsa plástica y descartar en bolsa de residuos patológicos
Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd edition. Sambrook, Fritsch and Maniatis
25
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Figura 1
26
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN V
1. SEROTIPIFICACIÓN CON ANTISUEROS
1.3 Procedimiento
1.3.1 Método de aglutinación en portaobjeto para la determinación del antígeno de superficie polivalente (O)
• Sembrar una placa de agar infusión cerebro corazón, incubar 18-24 horas
• Preparar suspensión celular en cloruro de sodio 0.2% a partir de la placa con una concentración final de 10 mg/ml
• Calentar la suspensión a 121º C durante 30 minutos
• Centrifugar a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos
• Volcar el sobrenadante y resuspender el precipitado con pequeñas cantidades de cloruro de sodio 0.2%
1.3.2 Prueba de aglutinación
• En un portaobjeto limpio marcar los bordes con marcador para vidrio para evitar el corrimiento del líquido.
Pueden utilizarse vidrios de mayor superficie para más de una aglutinación procediendo de la misma forma
que con el portaobjetos.
• Colocar una gota de antisuero OI/II, una del OV/VI y una gota de solución fisiológica
• Colocar una ansada de la suspensión celular cerca de cada gota de antisuero y solución fisiológica
• Homogeneizar bien la suspensión
• Colocar el portaobjeto o vidrio sobre un fondo oscuro y observar los patrones de aglutinación a ojo desnudo
• Considerar una aglutinación positiva fuerte cuando aparezca dentro del minuto de realizada la mezcla. Se
debe determinar si ocurre o no autoaglutinación entre la solución fisiológica y la suspensión celular.
1.3.3 Prueba de aglutinación en porta objetos utilizando antisueros individuales
• Cuando los aislamientos de L. monocytogenes producen aglutinación positiva con los antisueros polivalentes
se debe continuar con los antisueros individuales
1.3.4 Aglutinación positiva para antisuero OI/II
• Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OI y OIV y proceder de igual forma que con los
antisueros polivalentes
1.3.5 Aglutinación positiva para antisuero OV/VI
• Para continuar con la serotipificación utilizar antisueros OVI, OVII, OVIII y OIX y proceder de igual forma que
con los antisueros polivalentes.
1.3.6 Método en tubo para la determinación del antígeno somático (H)
• Como L. monocytogenes posee solamente de 1 a 4 flagelos, se recomienda aumentar la movilidad,
realizando tres pasajes del cultivo en medio infusión cerebro corazón semisólido con tubos de Craigie´s,
partiendo de un cultivo fresco en medio líquido infusión cerebro corazón
• La suspensión celular utilizada para la determinación se prepara en medio infusión cerebro corazón incubado
a 30º C durante toda la noche, agregando cantidades iguales de suspensión celular y solución fisiológica
con formalina al 1% v/v
• Colocar dos gotas de cada antisuero somático en diferentes tubos y agregar 0.5 ml de la suspensión celular
en cada uno
• Agitar los tubos e incubar en baño termostatizado (50 - 52º C), durante una hora.
• Observa si ocurre o no aglutinación. Evitar agitar los tubos durante la observación, ya que la aglutinación
puede romperse fácilmente
• Considerar una aglutinación visible a ojo desnudo como positiva
27
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
1.5 Precauciones
• Todos los cultivos e instrumentos tales como vidrios o tubos utilizados en estas pruebas deben ser
esterilizados con una solución de hipoclorito de sodio al 0,1% por más de una hora o autoclavados a 121º C
durante 20 minutos.
• Estas pruebas de serotipificación deben ser utilizadas solamente para cepas de L. monocytogenes aisladas
de alimentos.
• No colocar los antisueros en el freezer, esto puede producir precipitaciones.
• Estos reactivos contienen 0.08% de azida de sodio como conservante.
28
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
SECCIÓN VI
MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
29
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
5.3 Preparación del medio: En ambos casos ajustar pH a 7.0. Distribuir aproximadamente 4 ml en tubos 16/150
con campanitas de Durham invertidas. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Controlar que no queden burbujas dentro de las campanitas.
5.5 Lectura e interpretación: Observar las campanitas para detectar presencia de gas. Sobre el caldo determinar
la presencia de nitrito agregando 0.25 ml de reactivo A y 0.25 ml de reactivo B
5.8 Control de calidad: Reducción de nitrato positiva con producción de gas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Reducción de nitrato positiva sin producción de gas: Escherichia coli ATCC 25922
Reducción de nitrato a nitrito negativa: Enterococcus faecalis ATCC 29212
6. COLORACIÓN DE GRAM
6.1 Realización de la prueba: A partir de una colonia típica efectuar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y
fijar suavemente por calor. Teñir por el método de Gram
6.2 Lectura e interpretación: Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Listeria spp. son cocobacilos o
bacilos pequeños Gram positivos
31
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
7. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
7.1 Fundamentos: Este medio evalúa la capacidad de un microorganismo de hidrolizar almidón por
acción enzimática. Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidón al
0,1%. Utiliza lugol como revelador (solución de yodo utilizada en coloración de Gram)
7.2 Ingredientes: Agar-agar................................................................. 20 g
Extracto de carne .......................................................3 g
Cloruro de sodio .........................................................5 g
Almidón soluble ....................................................... 10 g
Agua destilada......................................................1000 ml
Como medio basal pueden utilizar medios comerciales (Agar infusión corazón, agar
tripteína soya, agar Base Sangre, otros).
7.3 Preparación del medio: Solución A: en 500 ml de agua destilada disolver el agar por calentamiento
Solución B: disolver el almidón en 250 ml de agua destilada, calentando suavemente.
No calentar en exceso debido a que el sobrecalentamiento puede hidrolizar el
almidón. Enfriar la solución A a 60 ºC. Mezclar la solución A y la solución B y
completar con el agua destilada restante. Ajustar pH a 7.2 – 7.5. Fraccionar
volúmenes adecuados para plaquear. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Plaquear.
7.4 Reactivo revelador: Solución de Lugol
Cristales de yodo....................................................... 5 g
Ioduro de potasio..................................................... 10 g
Agua destilada........................................................100 ml
7.4.1 Preparación: Solución madre: Disolver el ioduro de potasio en agua destilada. Agregar los cristales
lentamente y agitar hasta disolución. Filtrar y almacenar en frasco color caramelo.
Solución de trabajo: Diluir la solución madre 1:5 con agua destilada. Fraccionar en
frascos color caramelo. Preparar solución fresca cada 3 semanas.
7.5 Realización de la prueba: Inocular la superficie del medio en spot o en línea con la cepa a estudiar. Pueden
probarse varias cepas en una misma placa. Incubar a 35 ºC durante 48 horas.
7.6 Lectura e interpretación: Inundar la placa con lugol. La placa vira al color azul por la reacción del lugol con el
almidón. Una zona clara alrededor de la siembra indica que el microorganismo ha
hidrolizado el almidón.
Reacción positiva: zona clara alrededor del cultivo
7.7 Control de calidad: Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778
Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
8. HIDRÓLISIS DE HIPURATO
8.1 Fundamentos: Determina la capacidad de algunos microorganismos de hidrolizar hipurato sódico
produciendo ácido benzoico, manifestándose al añadir solución de cloruro férrico
8.2 Ingredientes: Caldo infusión corazón............................................ 25 g
Hipurato de sodio .................................................... 10 g
Agua destilada......................................................1000 ml
8.3 Preparación del medio: Disolver el caldo en agua destilada. Agregar el hipurato de sodio y disolver por
calentamiento. Ajustar pH a 7.4. Fraccionar 3 ml por tubo. Esterilizar a 121º C durante
15 minutos. Antes del uso o de la conservación, marcar el nivel del medio en cada tubo
con marcador para controlar la posible evaporación.
8.4 Reactivo revelador: Cloruro férrico 12%
8.4.1 Ingredientes: Cloruro férrico x 6 H2O ............................................ 12 g
Acido clorhídrico concentrado .................................2.5 ml
Agua destilada........................................................ 100 ml
8.4.2 Preparación: A 75 ml del agua destilada agregar 2.5 ml de ácido clorhídrico por las paredes del
recipiente. Luego adicionar 12 g de cloruro férrico. Disolver agitando suavemente. Llevar
a 100 ml con agua destilada estéril. La solución debe ser de color anaranjado.
8.5 Realización de la prueba: Inocular el medio con 1 ó 2 colonias de cultivo de 24 – 48 horas o de caldo denso.
Sembrar control negativo con Streptococcus grupo A ó un tubo sin inocular y control
positivo con cepa conocida de Streptococcus agalactiae.
32
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
8.6 Lectura e interpretación: Incubar a 35 ºC durante 7 días (10-14 días para cepas de lento desarrollo). Incubar
controles a igual temperatura. Antes de agregar el reactivo, llevar a volumen el caldo
hasta la marca con agua destilada estéril. Si el cultivo es densamente turbio,
centrifugar y usar el sobrenadante. Estérilmente, transferir 0.8 ml del sobrenadante a
tubos pequeños. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico. Agitar suavemente. Esperar 10-15
minutos, agitando ocasionalmente. La aparición de un precipitado que permanece
luego de 10 minutos de leída la reacción, indica resultado positivo. Si el precipitado se
redisuelve y no se mantiene luego de 10 minutos, la reacción debe ser considerada
negativa. Una alternativa metodológica más rápida es realizar una suspensión densa
del cultivo en 0,4 ml de solución acuosa al 1% de hipurato de sodio e incubar a 35 ºC
durante 2 horas. El producto final de la hidrólisis del hipurato es glicina y se detecta
agregando 5 gotas de ninhidrina (ninhidrina 3.5 g, acetona 50 ml, 1-butanol 50 ml),
incubar nuevamente 10 minutos.
Reacción positiva: desarrollo de color púrpura intenso
8.7 Control de calidad: Control positivo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615
Control negativo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813
11.1 Fundamentos: Las vitaminas y minerales, peptonas y extracto de carne proporcionan nitrógeno, el
cloruro de sodio mantiene el equilibrio del medio. La glicina se utiliza para mejorar la
recuperación de Listeria spp.. El cloruro de litio y feniletanol se incorporan para la
inhibición de contaminantes. El suplemento selectivo Listeria se añade
luego de la esterilización para inhibir estafilococos, bacilos y especies de Proteus.
11.4 Preparación del medio: Suspender 50.5 g del medio deshidratado en agua destilada y calentar hasta
disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar
estérilmente el suplemento. Distribuir en placas de Petri y solidificar.
11.5 Características del medio: Medio deshidratado homogéneo y claro. En solución medio color ámbar ligeramente
opalescente. Suplemento liofilizado blanco o amarillento, seco. En solución limpio,
amarillo pálido.
11.6 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas
11.7 Lectura e interpretación: Observar las colonias bajo luz de transmisión oblicua. Colonias características de
Listeria muestran un color gris a azul con una base de apariencia cristalina
34
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
12.1 Fundamentos: Es un medio de cultivo selectivo y diferencial, contiene nutrientes necesarios para el
desarrollo de Listeria spp. Es diferencial para Listeria spp. debido a que el producto de
la hidrólisis de esculina en presencia de iones férricos forma un compuesto fenólico de
color negro. La selectividad para Listeria spp., se obtiene por el agregado del suplemento
selectivo para Agar base Oxford modificado, debido a que contiene antibióticos que
inhiben total o parcialmente el desarrollo de la flora acompañante presente en la muestra.
12.4 Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar a
121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar estérilmente los suplementos.
Ajustar pH ±7.0. Distribuir en placas de Petri (15 ml aproximadamente) y solidificar
12.5 Realización de la prueba: Inocular e incubar las placas a 35 - 37 ºC durante 18 – 48 horas
12.6 Lectura e interpretación: Las colonias características de Listeria spp. se muestran como pequeñas, grisáceas,
rodeadas de halo negro. A las 48 horas se puede observar colonias con reflejos
verdosos y centro deprimido
35
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
13.6 Lectura e interpretación: Las colonias típicas de Listeria spp. se observan como verde grisáceas, rodeadas de
halo negro y pueden mostrar centro oscuro. A las 48 horas puede observarse
colonias con centro deprimido
36
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
37
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Advertencia: Si el medio con sangre se agrega a placas de medio basal preparadas anteriormente,
es necesario colocarlas previamente en estufa a 36 ºC durante 20 minutos antes de
agregar la capa fina con sangre.
16.4 Cultivos patrones: Staphylococcus aureus NCTC 1803 Rhodococcus equi NCTC 1621
16.4.1 Mantenimiento: Cultivar en estrías, incubar a 36 ºC. Subcultivar cada treinta días.
16.5 Realización de la prueba: Trazar una línea de Staphylococcus aureus a lo largo de la placa y otra paralela y
alejada de Rhodococcus equi, en forma de inóculo fino. De igual manera sembrar
perpendicularmente a las cepas patrones los cultivos incógnita que se desean probar,
sin tocar la línea del S. aureus ni al R. equi, pero a distancia aproximada de 5 mm.
Pueden probarse simultáneamente varias cepas en la misma placa. Si se emplea el
método de doble capa, incubar a 36 ºC durante 12-18 horas. Si se hiciera la prueba
en monocapa de agar sangre, incubar a igual temperatura durante 24 horas.
16.6 Lectura e interpretación: Reacción positiva con S. aureus: zona de beta-hemólisis estimulada en la
intersección de la cepa incógnita. Se observa como una pequeña zona redondeada
de hemólisis. Si se observa una zona pequeña con R. equi, se considera negativa.
Reacción positiva con R. equi: zona ancha en forma de cabeza de flecha. Ver figura 1
16.7 Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Listeria innocua ATCC 33090
38
Aislamiento, identificación y caracterización de Listeria
Agar ........................................................................3.5 g
Agua destilada......................................................1000 ml
Preparación del medio: Disolver ingredientes en agua, calentar suavemente. Ajustar pH 7.3. Fraccionar 5 ml
por tubo. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ºC. Dejar solidificar en forma de columna.
Realización de la prueba: Sembrar con ansa aguja en el centro del medio, introduciendo la aguja hacia el fondo
y extraer siguiendo el mismo recorrido de entrada. Incubar a 25 ºC durante 48 horas.
Lectura e interpretación: Observar desarrollo alrededor de la línea de punción. En cultivos positivos se
produce zona de difusión del desarrollo a los lados de la línea de inoculación
Los cultivos de Listeria spp. son móviles y producen un desarrollo típico en forma de
sombrilla. Si fuera negativo, proseguir incubando otros 5 días y observar nuevamente
Control de calidad: Control positivo: Listeria monocytogenes ATCC 19111; ATCC 13932
Control negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212
39