不同氮源對阿拉伯芥硝酸鹽轉運蛋白 (AtGNT1) 突變株生長

影響 學生 : 吳柏帆 指導老師 : 蔡宜芳博士、林珊華學姐、蔡勤貝學姊

四、不同氮源的培養皿所種植的植物根長長度比較

At1g33440
At2g0

At

0
Day 0 Day 2 Day 4 Day 7

974
At4g

0
1

26
g
PTR2
PTR5

622
PTR
於攝氏 4

g5
於培養室 於培養室 於培養室

25
NR

2020
80

2168
At

3g
52
放 照

At1
在這裡則是將阿拉伯芥的種子先種在含有 2.5mM 琥珀酸銨 (ammonium succinate ,

00
T1

1
5g
g2
度冷房三 長兩天 長兩天 長三天

At
:5
t3

0
入 轉移植物到 相 照相三次

96
A A 0
t5 73
62
(NH4)2Suc) pH=6.5 的培養皿中，冰凍三天促進其同步發芽之後，再放入培養室培養兩天以促進其發 天

40
g
5g
種子種入
13
At
4
00
1:2
培 指定培養基 二 並秤重
At
5g
PT
R3
NR T
根，等到所有植物的根長大約長到 0.6cm 後，利用鑷子選擇根長大約一致的植物，轉移到指定的氮源 培養皿 養 次
At
4 60
室 並照相一次
At
2g
4 04
60
40 At1g27040
70
種類和濃度的培養皿，於轉移後、轉移後兩天和轉移後三天照相，並且之後沿根劃線，利用電腦程式算
3g At3g216

At2g
53
96
0
NRT1:4
出每株植物的根長並且由植物的兩次根長相減除以培養天數，計算出這兩段期間的平均生長長度，並且
379
00
CHL1 加以分析。以下則圖示出我們的實驗流程。 圖六 : 培養皿種植流程
At1g72140
At1g68570
At1g72130

At1g22540

2570
At2g38100

NAX <1> 在 (NH4)2Suc , pH=6.5 的培養皿發芽後 轉移到 0.1mM 的 NH4NO3 , <3> 在 (NH4)2Suc , pH=6.5 的培養皿發芽後 轉移到 0.2mM 的 KNO3 , pH=
At1g2 T1
Day7 轉移後
的培養皿。
50 At
3g
Day2 轉移後 Day4 轉移後
At
1g
2

1g
25

7 21
25
15 At
At
3g
45

45
66
0 pH=5.7
零天
的培養皿。 兩天
五天
Day2 轉移後
Day7
Day4 轉移後
轉移後
At 72
7 21 0
3g
0 五天
45
1g 45
零天 兩天

A
t 71

t3
4

At
A 5 0

g4
3g

At

3g
t

57
T
A

3g

45

00
N

45 84
A

68
t5
At

0
69 70
G
At

g2
50

At

1
At1g
3g

0
At5g62

g1
NRT1:6

NRT1:7
13

3g
At1g698
At5g115
1

88
1
0

4
61
3g

521

79

80
80
At

60
680
90

60
70

: 硝酸鹽轉運蛋白
: 多肽轉運蛋白
: 運輸硝酸鹽和多肽

圖一 : 阿拉伯芥硝酸鹽轉運蛋白家族演化樹圖。

NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 35S- NC1 gnt1-1 gnt1-4 35S-GNT1 NC1 gnt1-1 gnt1-4 35S-
二、突變株介紹 ( 來自蔡勤貝學姊 ) 35S-GNT1 35S-GNT1 35S-GNT1 GNT1 GNT1

圖七 : 圖九 :
( 上 )0.1mM NH4NO3 培養皿的 ( 上 ) 轉移到 2.5mM NH4NO3 培
情況 養皿
Col-0
18 gnt1-1
( 中 ) 根長 後的情況
16 gnt1-4 ( 下 ) 根的平均生長速率 ( 中 ) 根長
14 35S-GNT1 (t-test ; p <0.05, 和 NC1 做 ( 下 ) 根的平均生長速率
比較 ) (t-test ; p <0.05, 和 NC1 做比
Relative expression

12
10
較)
NC1 gnt1-1 gnt1-4 35S- NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 35S-
8 GNT1 35S-GNT1 35S-GNT1 GNT1
6
圖二 : 本實驗使用的三種突變株基因改 4
Day2
Day7 轉移後 <4> (NH4)2Suc , pH=6.5 的培養皿發芽後
Day2 在 轉移後 Day4 轉移後 轉移到 5 mMDay7
的 轉移後
KNO 3, pH=5
造 2
<2>
零天
轉移後
在 , pH=6.5Day4
(NH4)2Suc 轉移後
的培養皿發芽後
兩天 轉移到 2.5mM
五天 的 NH4NO3, 零天 兩天
五天
藍圖。上下分別為 gnt1-
0
的培養皿。
1 、 gnt1-4 。
-2 Root Shoot pH=5.7 的培養皿。

圖三 : 將突變株拿去萃取 RNA ，並且利用 RT-

PCR 擴
增 GNT-mRNA 並定量之，結果如上。
由上我們可以知道， gnt1-1 是 T-DNA insert 在 啟動子的突變株，而從右圖可知這樣的
變動會讓 AtGNT 在根和莖的表現皆很明顯的上升。而 gnt1-4 則是將是 T-DNA insert 在 第二個
外顯子 (exons) ，且由右表可以知道表現量相對於 col-0 (wild type) 皆明顯的有所下降。至於
35S-GNT1 ，則是將原來的啟動子換成來自花椰菜嵌紋病毒（ cauliflower mosaic virus ； NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4
35S-GNT1 35S-GNT1 35S-GNT1 35S-GNT1
CaMV ）的強啟動子 35S ，結果如右表所示， AtGNT 的表現量比 WT 還高，但是表現量不及 gnt1- 35S-GNT1 35S-GNT1

1。
圖八 : 圖十 :
( 上 ) 轉移到 2.5mM NH4NO3 培 ( 上 ) 轉移到 5mM KNO3 培養
養皿 皿後
三、不同濃度氮源對於突變株地上部鮮重影響 後的情況
( 中 ) 根長
的情況
( 中 ) 根長
( 下 ) 根的平均生長速率 ( 下 ) 根的平均生長速率
地 NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4
( t-test ; p < 0.05 , 和 NC1 (t-test ; p <0.05, 和 NC1 做比
上 35S-GNT1 35S-GNT1 做比較 ) NC1 gnt1-1 gnt1-4 NC1 gnt1-1 gnt1-4
較)
部 35S-GNT1 35S-GNT1
鮮
重
五、不同氮源下各突變株培養皿培養全株重量分析 六、結果與討論 未來展望
mg/

整株
整株 整株 由前面的實驗結果，我們可以有以下幾點推論 :
FW(m
FW(m FW(m
株 g)
g) g)
(1) 含硝酸鹽為氮源的時，兩個 AtGNT1 基因的過量表現株，以培養皿為生長基礎時，於硝酸根的濃度大於或等於
0.2 mM 時 ，和野生組 NC1 相比，根會受到生長抑制，進而導致根長明顯的縮短和根平均生長速率的下降。

(2) 不論所含硝酸鹽的濃度為何，在培養皿上，將 AtGNT1 基因剔除後，根部的生長速率和最後的長度，皆和野生組

NC1 沒有差別。
圖四 : 秤重前最後一次照相，左盤 NC1 gnt1-1 gnt1-4
NC1 gnt1-1 gnt1-4
和右盤分別是用 0.2mM 和 35S-GNT1 35S-GNT1 (3) 整株鮮重的部分，在培養皿上， 35S-GNT1 於硝酸鹽濃度大於或等於 0.2 mM 皆表現出比野生株 NC1 還要
整株 整株
1mM FW(m (NH4)2Suc
整株 輕的狀況。
圖五 : 植物地上部鮮重 (T-test, p<0.05, 和同濃度 NC1 FW(m
FW(m
的培養液來澆灌。盤內由左 相比 )
g) g)
g)
排到 (4)) 整株鮮重的部分，在培養皿上， gnt1-1 ，則只在硝酸鹽為唯一氮源時，表現出重量較輕的情況。至於在 NH4NO3
右排依序為 NC1 、 gnt1- 2.5 mM 上 ( 即含有硝酸根 2.5 mM) ，我們的 t-test p=0.06 ，雖沒通過，但是我們懷疑可能是因實驗誤差所導
1 、 gnt1- 致的結果，希望以後能再多次重複此實驗以證實此假設。
這個實驗是，一個培養盤裡每周澆兩次 NH4NO3 所製成培養液 400ml 。目前我們使
4 、 35S-GNT1 。
用 0.2mM 和 1mM 的 NH4NO3 培養液來觀察。當植物長到 21 天時，我們會照相並且取
(5)) 整株鮮重的部分，在培養皿上， gnt1-4 ，不論在什麼濃度的硝酸根或氮源，皆和野生組沒有差異，我們由結果
植物的地上部秤重。秤量的結果如圖五所示。
(2) 和本實驗，和學姊討論後，假設有可能和 AtGNT1 的冗員基因 (redundant gene ) At3g01350 有關係，希
我們從上資料可以明顯的看出 gnt1-4 比起野生株而言地上部肥大許多，而其他株系
NC1 gnt1-1 gnt1-4 望以後可做雙突變株證實之。
地上部沒有意義重大的差距。 35S-GNT1

圖十一 : 前實驗第七天的培養皿全株鮮重 (T-test, p<0.05, 和同濃度 NC1 相比 )

(6) 而地上部重量部分，我們看到 gnt1-4 重量明顯較重，但是本實驗野生株種子來源和培養皿並不相同，並且重複
次數不足，所以期望能再重覆實驗以證實這個現象。