Professional Documents
Culture Documents
di gel
I. Nguyên lý chung
được dùng để phân tách và một đôi khi để tinh sạch
đại -đặc biệt là các protein và acid- kích
thước/ , và cấu hình .
Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ
dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích
của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương
hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung
phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.
Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một
khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose
hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được
sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến
mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di
cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH
ở một giá trị không đổi tương đối.
I
Agarose (polysaccharide) có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da
(Hình 2.1) là một trong hai thành phần chính của agar1 chiếm khoảng 70%,
phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch
thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-
anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong suốt (transparent) hoặc
trong mờ (transluent) giống như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose
và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm
lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng
rộng rãi để làm giá thể cho các nucleic acid trong kỹ thuật điện di ngang
1
Agar: một galactan phức hợp tách chiết từ một số loài tảo đỏ như Gelidium và Gracilaria
spp., được sử dụng rộng rãi ở dạng gel làm giá thể rắn hoặc bán rắn cho môi trường nuôi
cấy vi sinh vật và thực vật.
AGAROBIOSE MONOMER
O
OH CH2OH CH2
O
O OH
O
OH O
Hình 2.1. Cấu trúc phân tử của agarose. Đơn vị agarobiose (ví dụ: hai phân tử
đường) là một monomer trong agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên một
chuỗi polymer.
(EtBr) và
(ultraviolet-UV).
:
- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản
ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…).
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân
tử hoặc in dấu di truyền…).
- Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích
Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây
biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.
Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm
có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không
ổn định.
0,5%
3 0,7%
0,9%
1,2%
1,4%
2
1 2 3 4 5 6
2.2
(
( :
log log o K r
Trong đó
ng agarose gel
0,3 60-5
0,6 20-1
0,7 10-0,8
0,9 7-0,5
1,2 6-0,4
1,5 4-0,2
2,0 3-0,1
Hình 2.3 minh họa sự dịch chuyển của tập hợp các đoạn DNA trong
hai mẫu ở ba nồng độ khác nhau của agarose, tất cả chúng ở trong một khay
gel và được điện di ở cùng một điện áp (voltage) trong một thời gian xác
định. Kết quả cho thấy, các đoạn lớn được phân tách tốt hơn ở gel 1%, trong
khi các đoạn nhỏ thích hợp với gel 2%.
1 2 1 2 1 2
Hình 2.3. Điện di các mẫu DNA giống nhau ở các nồng độ agarose khác nhau.
A: 1%, B: 1,5% và C: 2%.
- -
-
. Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch
chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.
Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không
gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt. Hình 2.4 minh
họa kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại
mạch thẳng ở bên phải.
- -
t - -
- -
không
cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho
phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
(0,5 agarose gel để phản
ứng nhuộm xảy ra trong suốt quá trình điện di
điện di
chạy điện di hoặc RNA
gây . Vì thế,
.
sulphate
). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel,
dưới đây là một vài phương pháp chính:
2.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)
Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm
được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với tỷ lệ 1:1, bổ sung muối đến
nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ở 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm.
Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý
DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương
thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tố ức chế trong agarose.
2.4.2. Ly tâm
Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào
đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên
một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại
60o
-
.
:
DNA (1 g/1 µL) 1 L
(10 loading dye) 1 L
Nước 9 L
Tổng số 11 L
11 L . Lưu ý
m .
0,5
(Hình 2.5).
0,5 -
Giếng
Băng dính
a. Khuôn đổ gel b. Đổ agarose gel vào khuôn c. Lược được gắn trong
khuôn gel
Nguồn điện di
Micropipette Cable
Đệm điện di
Nắp
Buồng điện di
Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel
Hình 2.6. Hình ảnh điện di DNA chạy trên agarose gel 1%, 3 Volts/cm và
nhuộm bằng EtBr. Các băng DNA có màu sáng. SM: Chuẩn kích thước của DNA
(1 kb ladder). Các đường 1, 2 và 3: mẫu plasmid DNA được cắt bằng 3 enzyme hạn
chế khác nhau.
I
:
CH2 = CH – C – NH2
O
persulphate (N,N,N’,N’-tetramethylethylene-
. Khi
bisacrylamide (N,N’-
-
.
20%).
Mẫu
Đệm điện di
Giếng
cathode
Khung kính
giữ gel
anode
Đệm điện di
Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách
tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của
chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhau của
acrylamide và bậc của liên kết chéo. Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích
thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Liên kết chéo
của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm
soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn
gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein.
Acrylamide (% w/v) ch
(nucleotide)
3,5 1.000-2.000
5,0 80-500
8,0 60-400
12,0 40-200
15,0 25-150
20,0 6-100
1.
20 cm
-
DNA (>1
:
1.1.1. :
silicon lúc
.
1. để
miếng đệm 2.4).
1. 35
30% acrylamide
11,6 16,6 26,6 40,0 66,6
-acrylamide)
1.
.
1.1.6. Sau , rút lược
1.
1. thidium bromide
. Sau đó l
ultraviolet transilluminator (Gel Documentation System
nh.
1.2.3
+K
.
- -
o
-70 .
.
-
.
-
.
(sấy
o
ở 80 C trong điều kiện chân không từ 1-2 giờ)
dấu 35
32
) (Hình 2.8).
1.
- 4o -
.
- -
hai i nhau.
o
- hai 4
4oC.
10 L 2 L -
2. Điện di protein
2.1. Điện di SDS-PAGE
2.1.1. Phương thức
Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium
dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng trong hóa sinh, di truyền và sinh học phân
tử để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng (phụ thuộc
vào chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc khối lượng phân tử, cấu hình
(xoắn) của protein, các biến đổi hậu dịch mã và các nhân tố khác).
Điện SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác
nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide
để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu
disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như
vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước
phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử
protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực
dương (+). Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các
phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.
Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự
sẽ dịch chuyển khác nhau do sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác
nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tử protein thích hợp
tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác. Bổ sung SDS giúp
giải quyết vấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch
thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử
WM 1 2 3 4 5 6 7 8
IEF pH
SDS
Có khoảng 10.000 protein khác nhau trong tế bào, tập trung trong hơn
sáu loại quan trọng. Kỹ thuật 2D-PAGE không đủ nhạy để phát hiện các
protein hiếm và nhiều protein sẽ không được phân giải. Vì thế, cần phải
phân cắt mẫu trong các phần khác nhau để làm giảm sự phức tạp của hỗn
hợp protein trước khi thực hiện 2D-PAGE.
Hai phương pháp điện di theo khối lượng phân tử và điểm đẳng điện
có thể kết hợp với nhau tạo nên kỹ thuật điện di 2 chiều. Điện di protein trên
polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượng phân tử và
phân lập protein. Ngoài ra, khối lượng protein còn được xác định chính xác
bằng phương pháp sắc ký khối phổ.