ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
Tecnología del estudio de ADN
Permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en
otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes
cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo
proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser
utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se
denominan proteínas recombinantes.

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INDICE
ADN Recombinante.......................................................................1
Aislamiento de segmentos específicos de ADN............................2
Vectores ..........................................................................................4
Enzimas de Restricción..................................................................5
Células Huésped.............................................................................5
Clonación – clones .........................................................................6
Hibridación de ácidos nucleicos....................................................7
- Métodos de laboratorio (hibridación)........................................9
--Uso de Sondas radioactivas.........................................................10
Secuenciación de ADN...................................................................11
-Técnicas de Secuenciación ...........................................................12
Biotecnología ..................................................................................15
Obtención de ADN.........................................................................16
Genética molecular de los eucariotas – Expresión
Génica..............................................................................................17
El cromosoma eucariótico – la regulación ..................................19
Regulación de la expresión génica – metilación...........................20
El genoma eucariótico....................................................................22
Clases de ADN................................................................................23
Intrones...........................................................................................24
Repeticiones y No repeticiones......................................................26
Familias genéticas – transcripción................................................28
Procesamiento de ARN en eucariotas ..........................................30
ADN de los organelos energéticos.................................................32
Bibliografía.....................................................................................33
Anexos

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ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo
para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes
cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en
cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas
por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.

Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos

algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis química, o
bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente natural (tejido o fluido
animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas tienen sus limitaciones. La
síntesis química debido a su complejidad y elevado coste sólo es aplicable cuando
la proteína de interés es muy pequeña. Por su parte, el aislamiento de las proteínas a partir
de la fuente natural a menudo se encuentra con el problema de que el rendimiento de la
extracción es muy bajo. Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera
de obtener factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación
de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres humanos para
sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible para tratar algunos
problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas de ADN recombinante es
posible solventar estos problemas y obtener proteínas que no se podrían conseguir con los
métodos tradicionales.

La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de

interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de
la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos precisa de unas herramientas
la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia naturaleza.

El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar

la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios químicos
la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se
denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es
técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser
secuenciada en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada
para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se
hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también
el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era
complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta
cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como
sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para
sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos

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que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa

inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se
llama ADN complementario o abreviadamente ADNc. Actualmente gracias a la existencia
de genotecas y a la secuencia de muchos genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de
cualquier gen es una tarea mucho más simple.

Los cromosomas, incluso los de las células eucariotas más simples, contienen una enorme
cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar
una aguja en un pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de
hibridación de ácidos nucleicos

En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta
de que los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de
importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados por ellos se
las usa como “fábricas” para suministrar ilimitadamente proteínas. Esto fue el inicio de la
biotecnología.

AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA

Una de las formas de obtener los fragmentos específicos de DNA es cortando moléculas de
DNA con enzimas de restricción, transcribiendo el mRNA a DNA con la enzima
transcriptasa inversa, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las
enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos
bacteriófagos. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento
específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las
células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se
protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las
secuencias de reconocimiento.

Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan

extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos “pegajosos” que
luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos
producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de

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fuentes diferentes. Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos, llamados
fragmentos de restricción, si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. El
gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace
posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico de una variedad
ilimitada de fuentes.

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis

pares de bases de longitud y, cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'), las
dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas; estas secuencias se denominan
secuencias palindrómicas. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando
como resultado extremos "pegajosos". Las enzimas de restricción generalmente se obtienen
de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de
Hemophilus parainfluenzae; EcoRI es de E. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae.

Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que
fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA, los retrovirus. Esta enzima es
capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA.

Cuando estos virus infectan una célula hospedadora, la transcriptasa inversa cataliza la
síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral; el mRNA viral, que codifica proteínas
virales, se transcribe a partir de este DNA, como también el RNA viral que será
empaquetado en nuevas partículas virales. En el laboratorio, la transcriptasa inversa puede
utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA, segmentos que se conocen
como DNA complementario, o cDNA.

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a) La cápside de un retrovirus está rodeada

típicamente por una envoltura externa de
lipoproteína formada por elementos de la
membrana celular de su hospedador anterior y por
proteínas virales. Esta envoltura puede fusionarse
con la membrana celular de un nuevo hospedador,
permitiendo que el virus entre en la célula.

b) Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula,

el RNA viral se libera de la cápside y se
transcribe a una única cadena de DNA
complementaria (cDNA).

c) Comienza de inmediato la síntesis de la segunda

cadena de DNA (complementaria a la primera),
produciéndose una molécula de cDNA de doble
cadena. Estas reacciones, así como la de
degradación de la molécula original del RNA
viral, son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa.

El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora.

Posteriormente se transcriben, a partir del DNA viral integrado, tanto el nuevo RNA
genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales.

Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel
de poliacrilamida. El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño
difiere en un solo nucleótido. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño, se utilizan
matrices con poros mayores, como los geles de agarosa, un polisacárido aislado de ciertas
algas.

Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente, por ejemplo,
mediante el uso de técnicas de tinción.

VECTORES DE TRANSFERENCIA: PLASMIDOS

Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas humanas en
microorganismos fallaron porque, a pesar de que se conseguía introducir el gen en la célula
huésped que debía fabricar la proteína humana, ésta en lugar de llevar a cabo este proceso,
o bien degradaba el gen que se le había introducido, o bien a medida que la célula se
dividía, sólo una de las hijas recibía copia del gen humano por lo que dicho gen iba
diluyéndose. Estos problemas fueron soslayados cuando se descubrió que se podían

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emplear unas herramientas que también están en la naturaleza: los plásmidos y los virus.
Los plásmidos son moléculas de ADN circular que
se encuentran en muchas bacterias y levaduras, y que
se caracterizan porque pueden replicarse, es decir
"reproducirse", independientemente del genoma de
la célula. Muchos de ellos contienen genes de
resistencia a antibióticos, lo que permite distinguir
las células que han incorporado el plásmido, y que
por consiguiente son capaces de crecer en un medio
con el antibiótico, de las demás. Por su parte,
los virus son entidades que están especializadas precisamente en insertar su material
genético en células y utilizar la maquinaria de éstas para multiplicarse.
Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés en la célula huésped, por lo que
se denominan moléculas transportadoras o vectores.

ENZIMAS DE RESTRICCION
En general para introducir el gen de interés en
el genoma de estos vectores se utilizan las enzimas
de restricción. Estas enzimas cortan
los genomas en unas secuencias específicas.
Cortando el genoma huésped y el gen a insertar
con las mismas enzimas los extremos de ambos se
vuelven "cohesivos". Esto es, se podrán unir
debido a la complementariedad de sus bases.
Después, gracias a otra enzima denominada ligasa,
se vuelven a unir las cadenas de los ácidos
nucleicos quedando insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que
nos interese.

CÉLULAS HUÉSPED
Una vez que el vector presente el gen de interés, se transfiere a la célula huésped. Un buen
organismo huésped debe caracterizarse por:

1. Poder crecer rápidamente.

2. Hacerlo de manera barata.
3. Que sea fácilmente manipulable.

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Hay tres tipos de células huésped: bacterias, especialmente cepas de Escherichia

coli, levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas de algún
mamífero. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes.
Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple, suelen crecer muy
rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. Su principal inconveniente
es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones que sí realizan las células
eucariotas en las proteínas, por ejemplo la glicosilación. Las levaduras y las líneas
celulares son más complicadas, especialmente estas últimas, no crecen tan rápido y suelen
ser más difíciles de tratar. No obstante, la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a
cabo modificaciones como las descritas anteriormente.

CLONACIÓN

Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al que se ha
incorporado el gen de interés. Mediante diferentes técnicas se facilita la entrada
del vector en las células. A continuación hay que separar las células que han incorporado
el vector del resto. Una de las células modificadas se hace crecer obteniéndose así
múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden de una única célula inicial. Este
proceso de seleccionar y hacer crecer una única célula se denomina clonación.
Las células hijas fabricarán todas sub-proteínas más la proteína extraña que se le ha
introducido. La síntesis de la proteína deseada por la célula huésped es lo que se conoce
como expresión del gen de dicha proteína. Cuantas más células huésped estén fabricando
la proteína de interés, mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. Para ello
el clon de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona,
se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo- en función del tipo de célula huésped- y
se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones más favorables de
temperatura, humedad, nutrientes, etc.

Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés, ésta se aísla a partir del medio de
cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias células dependiendo del tipo
de células que se utilizan como sistema de expresión y de cómo se haya diseñado el gene

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dicha proteína. El aislamiento de una proteína a partir de la mezcla de células, nutrientes y

otras moléculas presentes en el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser
compleja y que requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como
las cromatografías. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como
medicamento, el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada, que es el
proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica definitiva que será la
que le dará la máxima estabilidad y eficacia.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS – SONDAS

RADIOACTIVAS

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan

dos cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias,
en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las
bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con
la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será
mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta
última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están
totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U;
C≡G; G≡C; T=A o U=A

Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente.
Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación
de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión.

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que

contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura
de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de
hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se
requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se
traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más,
el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da
bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según qué tipo vamos a estudiar y
esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a
mutaciones en el ADN mitocondrial.

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En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de

hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern, para uniones ADN-
ARN.

a. Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos

fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de
restricción. Los plásmidos contienen, además, un gen de resistencia a un antibiótico
que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido.

b. Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de
cultivo sólido que contiene el antibiótico de
selección. Sólo las bacterias que hayan
adquirido el plásmido recombinante
crecerán formando colonias aisladas. Cada
colonia se origina por divisiones sucesivas
de una única bacteria inicial y todas las
células de una colonia contienen el mismo
plásmido recombinante.

c. Algunas bacterias de cada colonia son

transferidas (blotting) a un filtro especial
obteniéndose una réplica. La réplica es
tratada con una solución de alto pH para
romper las células y desnaturalizar el DNA
del plásmido. El DNA se une químicamente
al filtro

d. El filtro con el DNA desnaturalizado es

incubado en una solución que contiene una
sonda radioactiva que consiste en una
molécula de DNA o RNA de cadena simple,
complementaria al segmento de DNA de
interés. Se permite que la sonda se hibride.

e. Se lava del filtro el exceso de solución que

contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas de doble cadena que se hayan
formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de
autorradiografía, técnica en la cual primero, cada filtro es cubierto con una película
fotográfica y dejado en la oscuridad. Durante el período de exposición, el radioisótopo
libera energía que impacta la emulsión fotográfica. Luego del revelado de la película,

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la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura, producida
por un depósito de plata de la emulsión. Las réplicas de las colonias que estén
marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento, identifican las colonias
originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar.

Métodos de Laboratorio
Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los
laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.

Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-
químico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene
una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras
moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

 Southern
El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para la
detección de genes específicos en el ADN celular.

El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por
tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de
doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras
componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es
transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica
de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se
incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo);
durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla
de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una
exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película
sensible a la luz, para el caso de sondas

 Northern
El segundo método, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas
de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo
Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar
ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de

poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado
desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern.

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El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios

de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en
qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

 Hibridación  in situ (uso de sondas radioactivas)

Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su
observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern
ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de
material orgánico. Utilizando técnicas inmuno-histoquímicas se puede conocer la
localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia
complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica
de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a
secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de
similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico.

En la hibridación in situ, las sondas están marcadas con

colorantes fluorescentes. Cada color indica la localización
de una secuencia de DNA diferente: rojo, localización en el
cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil más
común; verde, región del cromosoma 21 donde se encuentra
el gen responsable del Síndrome de Down; blanco, un
oncogén en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica
una proteína de membrana de los glóbulos blancos;
amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5.

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN

o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el
ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la
molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre
las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus único se
marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para
que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de
Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que
favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de  sonda no unido, de
modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al
ADN del locus diana.

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SECUENCIACION DE ADN
Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando
la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad
de transportar información.

Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades
de nucleótidos de una banda ADN - adenina, citosina, guanina, timina, que son bases
covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan
pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a
3' de izq. a derecha.

En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una

secuencia. Esas letras representan ambigüedad. De todas las moléculas muestreadas, hay
más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de
Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:

 A = adenina
 C = citosina
 G = guanina
 T = timina
 R = G A (purina)
 Y = T C (pirimidina)
 K = G T (keto)
 M = A C (amino)
 S = G C (enlaces fuertes)
 W = A T (enlaces débiles)
 B = G T C (todos y A)
 D = G A T (todos y C)
 H = A C T (todos y G)
 V = G C A (todos y T)
 N = A G C T (cualquiera)
La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya
finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en
un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética
heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que
forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la
secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos
fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo
de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los
descubrimientos en biología.

Técnicas de Secuenciación

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Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido
de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto
Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de
científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de
muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.

Se usan tres técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la

otra usa métodos químicos y la última es una modificación de la anterior. La secuenciación
depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por
clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica
de PCR. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa
termoestable.

1. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de

Maxam y Gilbert, el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se
marca radiactivamente en el extremo 5'. La solución que contiene al DNA marcado se
divide en cuatro porciones, cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico
diferente para romper las moléculas en una sola de las cuatro bases nitrogenadas. Con
los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante, en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido
de longitud. Combinando la información obtenida con cada reacción, se puede inferir
la secuencia del segmento completo.

2. En la secuenciación por el método enzimático, se procede en varias etapas:

2.1 En una primera etapa, el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se

aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena
complementaria por parte de la DNA polimerasa. La mezcla en la que se producirá
la reacción de síntesis se separa en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene, además,
uno de los nucleótidos terminadores (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP). Estos son
dideoxinucleótidos que carecen del OH- en la posición 3’, por lo que, una vez que
son agregados a la cadena que se está sintetizando, no pueden reaccionar con ningún
otro nucleótido y se transforman, así, en el último nucleótido de la cadena.

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2.2 En una segunda etapa, los productos de reacción son sembrados en la parte superior
de un gel, en “calles” separadas. Luego de la corrida electroforética, se realiza la
autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA
original. En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel, que
esquematiza la cuba electroforética, se señalan las posiciones de los fragmentos de
DNA de una porción aumentada del gel. Las posiciones de los fragmentos de DNA
permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por
ejemplo, si el fragmento de un solo nucleótido, que se ubica en la primera posición
en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucleótido de la
secuencia contiene, como base nitrogenada, una guanina.

3. Método automático

Se trata de una modificación del método automático de Sanger que ha permitido secuenciar
de manera más rápida y reproducible fragmentos de ADN de hasta 500pb.

La modificación consiste en que cada uno

de los dideoxirribonucleótidos (ddNTP)
está unido a un fluorocromo distinto que va
a excitarse con la luz emitiendo luz de un
color determinado. En este caso los
fragmentos generados a partir del cebador
se van a diferenciar porque el ddNTP
terminal va a emitir un color característico
que se capta en el aparato.

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Los equipos funcionan de forma completamente automática, inyectando las muestras que se
preparan exactamente igual que para la secuenciación en geles de acrilamida. Las muestras
se colocan en pocillos para ser inyectadas automáticamente a un capilar previamente
cargado con un polímero que funciona como lo hace el gel desnaturalizante de acrilamida.
A una altura determinada del capilar, el láser detecta la fluorescencia emitida por cada
cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la
secuencia correspondiente.

Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vacía

rellenándose nuevamente con polímero fresco y nueva muestra y así sucesivamente.
Las principales ventajas de estos equipos son la automatización completa de todo el
proceso, y la rapidez en el análisis de cada muestra, leyendo orden de 450 nucleótidos en el
plazo de una hora en lugar de las 2-4 horas que se necesitan en un gel

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de
secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente
en esa posición de la secuencia.

BIOTECNOLOGÍA
La biotecnología no es, en sí misma, una ciencia; es un enfoque
multidisciplinario que involucra varias disciplinas
y ciencias (biología, bioquímica, genética, virología,
agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria entre
otras).

Hay muchas definiciones para describir la biotecnología. En

términos generales biotecnología es el uso de organismos vivos
o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el
hombre.

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ADN RECOMBINANTE

La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la

biotecnología "tradicional", largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas
(e.g., fermentación de alimentos, control biológico), hasta la biotecnología moderna, basada
en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (llamadas de ingeniería
genética), los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y
tejidos.

Las técnicas de DNA recombinante permiten la construcción de vectores, portadores de

genes específicos, que son introducidos en células bacterianas, las cuales sintetizan las
proteínas codificadas por los genes.

La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada
usando el gen para la hormona somatostatina, una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos
que podía ser detectada en cantidades muy pequeñas.

Más recientemente, se ha logrado introducir en

células bacterianas genes para otras proteínas útiles
en medicina, que han funcionado correctamente para
la síntesis de las proteínas codificadas. Los
plásmidos utilizados para la expresión de proteínas
foráneas se conocen con el nombre de vectores de
expresión. Un ejemplo es el gen para la insulina
humana. Otro es el gen para la somatotropina u
hormona de crecimiento, que se utiliza para tratar
cierta forma de enanismo en los niños.

OBTENCIÓN DEL ADN

Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese, mediante la
utilización de las enzimas de restricción; unión de este a un ADN vector; y la
transformación en una célula procariota o eucariota.

El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas

de restricción, capaces de reconocer y cortar el ADN en
puntos determinados, fue la pista que orientó hacia el
momento en que se podían recombinar los genes en el
laboratorio.

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ADN RECOMBINANTE

Si se quieren unir dos ADNs, cada uno de los cuales procede de una especie diferente
podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. Cada ADN se trata con una
endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras
dobles de ADN. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios,
con lo cual, una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que
tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias. Los dos DNAs así cortados se
mezclan, se calientan y sé enfrían suavemente. Sus extremos cohesivos se aparearán dando
lugar a un nuevo ADN recombinado, con uniones no covalentes. Las uniones covalentes se
consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma
A).

Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal, que puede adicionar
muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3´de las hebras del ADN.
De este modo pueden construirse colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3
´ de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C (nucleótico de citosina) en los
extremos del otro ADN. Como estas colas son complementarias, permitirán que los dos
ADNs se unan por complementariedad. Posteriormente, se forman los enlaces covalentes
por el ADN ligasa (forma B).

El ADN vector es el vehículo de clonaje, ya que transporta el inserto de ADN a una

molécula hospedadora, donde pueden ser replicados. Los vectores o transportadores más
utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. Plásmidos Estos son pequeños
ADNs de cadena doble y circular, que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las
bacterias. Cada plásmido contiene varios genes que se replican, transcriben y traducen
independientemente de los genes del cromóforo bacteriano, pero simultáneamente en el
tiempo.

Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad, y después ser
transportados como pasajeros al interior de las células de E. coli.

ADN del fago lambda.

Es otro vector que puede ser utilizado para introducir

genes en bacterias. Cuando el ADN recombinado del
fago lambda, con su gen pasajero, se mezcla con la
cubierta del virus lambda, se producen partículas
fágicas infecciosas, si el tamaño del ADN
recombinado no es muy distinto del ADN natural del
virus lambda.

Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos

fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN.

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ADN RECOMBINANTE

Éstas están formadas por todas las moléculas de plásmidos o fagos recombinantes
originados al unir un ADN a un vector. Las bibliotecas deben cumplir la característica de
poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo.

GENÉTICA MOLECULAR DE LOS EUCARIOTAS – EXPRESIÓN GÉNICA

Con la ayuda creciente de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante,

progresaron los estudios de genética molecular de los eucariotas y la distancia entre los
eucariotas y los procariotas, en vez de disminuir, se fue ampliando. En primer lugar, el
cromosoma eucariótico difiere en muchos aspectos del cromosoma procariótico. Las
investigaciones realizadas sobre estos organismos a nivel molecular develaron también
muchas diferencias importantes entre el genoma de los eucariotas y de los procariotas.

La regulación de la expresión génica en los procariotas está relacionada fundamentalmente

con el ajuste fino de la maquinaria metabólica de la célula, y es llevada a cabo activando o
reprimiendo la expresión de ciertos genes, en respuesta a cambios en los nutrientes en el
ambiente. La regulación génica en los eucariotas, especialmente en los multicelulares, es
muy diferente.

Un organismo multicelular usualmente inicia su vida en forma de huevo fecundado, el

cigoto. El cigoto se divide repetidamente produciendo muchas células que se diferencian y
cada tipo celular comienza a producir proteínas característicamente diferentes que lo
distinguen de otros tipos de células. A su vez, un mismo tipo celular puede producir
variantes de las proteínas que sintetiza en distintas etapas del desarrollo del organismo. Sin
embargo, toda la información genética originalmente presente en el cigoto también está
presente en cada célula diploide del organismo. Resulta claro que la diferenciación de las

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ADN RECOMBINANTE

células de un organismo multicelular depende de la inactivación de ciertos grupos de genes

y de la activación de otros, es decir, de una regulación de la expresión.

La expresión de los genes puede ser regulada en

distintas etapas del camino que conduce desde el DNA
a las proteínas. Las investigaciones en eucariotas han
demostrado que, como en el caso de los procariotas, el
genoma eucariótico contiene un sorprendente arreglo
de elementos genéticos móviles. El análisis del
cromosoma eucariótico ha revelado que éste también
está sujeto a reordenamientos, deleciones y adiciones.

En ocasiones, las células escapan a los factores que

regulan el crecimiento celular normal. En
consecuencia, las células se multiplican sin control,
amontonándose, invadiendo y destruyendo otros
tejidos. En estos casos se produce el cáncer. Hay
varias evidencias que han relacionado el desarrollo del cáncer con cambios en el material
genético. Los virus pueden provocar cambios en la constitución genética de la célula y
algunos pueden causar cáncer. Más aun, todos los virus conocidos causantes de cáncer son
virus que introducen información en los cromosomas de las células hospedadoras. Estos
incluyen tanto virus con genoma de DNA como retrovirus con genoma de RNA. El
descubrimiento del papel de la transcriptasa inversa forjó el eslabón crucial entre los
retrovirus y los cromosomas de las células eucarióticas.

El mayor anhelo relativo a las aplicaciones basadas en la tecnología del DNA recombinante
es que en algún tiempo futuro sea posible corregir defectos genéticos sustituyendo genes
“malos” “por genes” “buenos”. Esta es una tarea enormemente compleja. Requiere primero
la preparación de un gen que será captado por una célula eucariótica, incorporado a un
cromosoma, y luego expresado, pero esto es sólo el comienzo. El nuevo gen debe
establecerse en un gran número de células del tipo apropiado y quedar sujeto a los
complicados, y todavía grandemente desconocidos, controles del gen normal.

Se han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de genes a células eucarióticas.

Las células se hacen crecer en cultivo en tubos de ensayo y se transfieren a óvulos
fecundados de ratón y de otras especies de mamíferos y a embriones de Drosophila.

En cada uno de estos casos, genes extraños han sido incorporados y expresados en el nuevo
hospedador. En los últimos años también se desarrollaron técnicas que permiten obtener
copias idénticas de organismos, los clones.

CROMOSOMA EUCARIÓTICO

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ADN RECOMBINANTE

El DNA eucariótico siempre está asociado con

proteínas, que constituyen más de la mitad del peso
del cromosoma. La mayoría de estas proteínas son
histonas, moléculas relativamente pequeñas con
carga positiva. La molécula de DNA se envuelve
alrededor de núcleos formados por ocho moléculas de
histonas, para formar nucleosomas, las unidades de
empaquetamiento básico del DNA de los eucariotas.
Los nucleosomas se empaquetan unos sobre otros
formando una estructura más condensada –la fibra de
30 nanómetros– que se encuentra tanto en la
cromatina en la etapa de interfase como en los
cromosomas que entran en mitosis. El DNA puede
tomar in vitro la forma de B-DNA (la hélice
dextrógira descrita por Watson y Crick), A-DNA
(una hélice dextrógira menos fuertemente enrollada)
o Z-DNA (una hélice levógira). Las distintas formas
del DNA podrían coexistir in vivo, con distintas
funciones biológicas.

La distancia entre los nucleosomas es entre 10 y 11

nanómetros y el diámetro de cada cuenta es aproximadamente de 7 nanómetros. El centro
de cada nucleosoma está compuesto por alrededor de 140 pares de bases de DNA y un
conjunto de ocho moléculas de histona. La cadena que une los núcleos de los nucleosomas
contiene otros 30 ó 60 pares de bases.

La replicación del DNA en los eucariotas es igual, en principio, a la replicación del DNA
de los procariotas. Los nucleótidos en la forma de trifosfatos se acoplan a lo largo de una
cadena molde de DNA en la forma semiconservativa. Como en los procariotas, en la
síntesis de las cadenas complementarias, las DNA polimerasas operan solamente en una

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ADN RECOMBINANTE

dirección’’; la cadena complementaria a la otra hebra madre ’’se sintetiza como una serie
de fragmentos de Okazaki, que luego se unen por la acción de la enzima DNA ligasa.

En el cromosoma procariótico circular, comparativamente pequeño, la replicación

comienza en un único origen y procede bidireccionalmente a lo largo de dos horquillas de
replicación.

Las histonas ensambladas en los nucleosomas raramente se separan del DNA, por lo tanto,
a medida que la horquilla de replicación avanza debe, de alguna manera, pasar a través de
los nucleosomas parentales. Se cree que cada nucleosoma se desenrolla transitoriamente,
permitiendo que la DNA polimerasa copie el DNA nucleosomal desenrollado. El DNA
recién sintetizado hereda parte de las viejas histonas pero requiere también de nuevas
histonas para empaquetarse y formar la cromatina. En cuanto se sintetiza, el DNA
eucariótico forma los nucleosomas y se asocia también con otras proteínas compactándose
en los niveles superiores de condensación.

LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LOS EUCARIOTAS -

METILACIÓN

Los biólogos están comenzando a comprender algunos aspectos de la regulación de la

expresión génica en eucariotas. Durante el desarrollo embrionario, diferentes grupos de
genes se activan o inactivan en diferentes tipos de células. Una variedad de proteínas
reguladoras específicas desempeñan papeles centrales en la regulación de la expresión
génica. Para poder iniciar la transcripción, la RNA polimerasa requiere que un grupo de
proteínas, llamadas factores generales de transcripción, se ensamblen en la región
promotora del gen que se va a transcribir. Esto permite la unión de la RNA polimerasa y la
posterior transcripción.

Si bien en los procariotas también se da una regulación a este nivel, se hace cada vez más
claro que este nivel de control de la transcripción es mucho más complejo en los eucariotas,
en particular, en los multicelulares. En un organismo multicelular, un gen parece responder
a la suma de muchas proteínas regulatorias diferentes, algunas de las cuales tienden a
activar el gen y otras a desactivarlo. Los sitios en los cuales se unen esas proteínas
regulatorias pueden estar a centenares o miles de pares de bases de distancia de la secuencia
promotora en la que se une la RNA polimerasa. Entre estas secuencias regulatorias, se
cuentan las secuencias denominadas enhancers, a las que se unen las proteínas que activan
la transcripción.

Muchas evidencias indican que el grado de condensación del DNA del cromosoma, que se
observa mediante la tinción de la cromatina, desempeña un papel principal en la
regulación de la expresión génica en las células eucarióticas. La tinción revela dos tipos de

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ADN RECOMBINANTE

cromatina: la eucromatina y la heterocromatina. Durante la interfase, la heterocromatina

permanece condensada, pero la eucromatina se vuelve más laxa. La transcripción del DNA
a RNA ocurre solamente durante la interfase, cuando la eucromatina está laxa.

Algunas regiones heterocromáticas son constantes de célula a célula y nunca se expresan.

Este tipo de heterocromatina se denomina heterocromatina constitutiva. Un ejemplo es la
cromatina altamente condensada, localizada en la región del centrómero del cromosoma.
Esta región, que no codifica para proteínas, desempeña un papel estructural en el
movimiento de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis.

Otras regiones de cromatina condensada, por el contrario, varían de un tipo de célula a otro
dentro del mismo organismo, reflejando la biosíntesis de diferentes proteínas por diferentes
tipos de células. Además, cuando las células se diferencian durante el desarrollo
embrionario, la proporción de heterocromatina aumenta respecto de la de eucromatina a
medida que la célula se vuelve más especializada.

Otro factor que está involucrado en la regulación génica es la

metilación de las bases nitrogenadas citosinas, que ocurre
después de la replicación. La metilación diferencial de ciertos
genes en ambos sexos, que ocurre durante la gametogénesis,
la impronta genómica, desempeña un papel en el desarrollo
temprano del embrión.

METILACION
GENOMA EUCARIÓTICO

El examen del DNA de las células eucarióticas reveló cuatro sorpresas principales. En
primer lugar, con algunas pocas excepciones, en una misma especie, los individuos tienen
la misma cantidad de DNA en cada una de sus células diploides (lo cual no es
sorprendente), pero las variaciones entre las diferentes especies son enormes.

En segundo lugar, en cada célula eucariótica parece haber un gran exceso de DNA, o por lo
menos de DNA cuyas funciones son desconocidas. Se estima que en las células eucarióticas
menos del 10% de todo el DNA codifica para proteínas; en los seres humanos, esta cifra
puede disminuir hasta el 1%. Por contraste en los procariotas y más aún en los virus,
excepto por las secuencias reguladoras o secuencias señal, virtualmente todo el DNA se
expresa.

En tercer lugar, casi la mitad del DNA de la célula eucariótica consiste en secuencias de
nucleótidos que se repiten centenas, o hasta millones de veces. Esto fue un descubrimiento
particularmente sorprendente. En E. coli, que ha sido por largo tiempo el modelo para los
genetistas moleculares, cada molécula de DNA cromosómico contiene típicamente sólo una

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ADN RECOMBINANTE

copia de cualquier gen dado; las principales excepciones son los genes que codifican los
RNA ribosómicos. Además, este hallazgo fue sorprendente porque, de acuerdo con la
genética mendeliana, un gen está presente solamente dos veces por cada célula eucariótica
diploide, no en una multitud de copias. Los estudios de hibridación y secuenciación han
mostrado tres clases de DNA eucariótico. Las repeticiones múltiples de secuencias de
nucleótidos cortas, dispuestas característicamente en tándem, se conocen como DNA de
secuencia simple. El DNA de secuencia simple está asociado con la heterocromatina
fuertemente condensada en la región del centrómero. Las repeticiones más largas,
habitualmente dispersas en el cromosoma, se conocen como DNA de repetición intermedia.
El DNA de repetición intermedia incluye múltiples copias de los genes que codifican para
los RNA ribosómico, RNA de transferencia e histonas. La tercera clase, el DNA de
copia única, constituye hasta el 70% del DNA cromosómico en los seres humanos y dentro
de esta fracción se encuentra el DNA que codifica para la mayor parte de las proteínas. Los
datos actuales indican que sólo un 1% del genoma humano puede traducirse a proteína.

La cuarta sorpresa, y tal vez la más inesperada de todas, fue que las secuencias de genes
eucarióticos que codifican para proteínas habitualmente no son continuas, sino que están
interrumpidas por secuencias no codificadoras.

Las secuencias no codificadoras que producen interrupciones dentro de un gen se conocen

como secuencias interpuestas o intrones, y las secuencias codificadoras, aquellas que se
expresan, son llamadas exones.

Aunque los intrones se transcriben a RNA en el núcleo, no están presentes en el mRNA en

el citoplasma y, así, no se traducen a proteínas. Los exones son los segmentos que están
presentes en el mRNA citoplásmico y que se traducen a proteína.

Algunos genes estructurales, como los que codifican para las cadenas polipeptídicas de las
moléculas de hemoglobina, forman familias génicas. Los genes individuales de la familia
difieren ligeramente en sus secuencias de nucleótidos; en consecuencia, las proteínas que
ellos codifican difieren ligeramente en estructura y en propiedades biológicas. Algunos
miembros de las familias génicas no se expresan, supuestamente a raíz de mutaciones
deletéreas; estas secuencias de DNA se conocen como pseudogenes. Se cree que las
familias génicas tienen sus orígenes en duplicaciones génicas que ocurrieron como
resultado de “errores” de recombinación, seguidos por diferentes mutaciones en diferentes
copias del gen.

CLASES ADN

El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en

las células eucarióticas, pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y

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ADN RECOMBINANTE

cloroplastos. En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no

va asociado a proteínas, es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen
el virión o elemento infestante.

A-ADN: es ADN de tipo Dextrogiro (la hélice está enrollada hacia la derecha). Tiene una
estructura molecular más distendida y por lo tanto relativamente "débil" porque la distancia
entre las bases y el eje de la hélice es mayor. Por cada vuelta de la hélice hay 11pb. Al
parecer se presenta cuando intracelularmente no hay agua o en muestras de ADN
deshidratadas (por ejemplo en las usadas para cristalografía). 

B-ADN: es Dextrogiro también y es la forma más abundante del ADN. Las bases
nitrogenadas se colocan casi exactamente perpendiculares al eje de la doble cadena (eje
azúcar – fosfato). Es la estructura más estable de las 3. Por cada vuelta de la hélice hay
10pb.

Z-ADN: Es de tipo Levógiro, Está formado no por 1 par de bases como unidad sino por 2
pares de bases, todo eso provoca que la molécula adquiera una forma de zig – zag. Este
ADN tiene la particularidad de presentar zonas metiladas por lo cual no puede ser transcrito
a ARN mensajero, y se cree se forma durante la transcripsion.

Acorde a las evidencias, sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10
%). Existen diferentes tipos que los podemos dividir en:

 ADN de copia única (el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente

1000 pares de nucleótidos del longitud, una pequeña parte de este ADN contiene los
genes. 
 ADN repetitivo (20 %) son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos*
que se repiten en el genoma unas 105 veces (unidades de repetición). Se intercalan con
el ADN de copia única.
 ADN satélite (altamente repetitivo: 28 %) son unidades cortas de pares de nucleótidos
que se repiten en el genomio. Son característicos en cada especie y pueden ser
separados por centrifugación. Constituyen la heterocromatina y no se le
conoce función.

Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón, y las proporciones serían las mismas
en otras especies.

INTRONES

Una región del ADN  que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN es un intrón
por el hecho que son segmentos no codificados, a diferencia de los exones que son regiones

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ADN RECOMBINANTE

que codifican para una determinada proteína. Los Intrones son comunes en todos los tipos
de ARN eucariota, especialmente en los ARN mensajeros (ARNm), además pueden
encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas.

El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies, así como entre
los genes de una misma especie. Por ejemplo, el pez globo, Takifugu rubripees, tiene pocos
intrones en su genoma; mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores)
suelen presentar numerosos intrones.

Existen 3 preguntas que los científicos estan tratando de resolver acerca de los intrones:

 ¿Cómo se remueven los intrones del ADN?

 ¿Qué hacen los intrones?
 ¿Cuál es el origen de los intrones?

De estas 3 preguntas, la primera es la que tiene la respuesta más satisfactoria. Se sabe que
los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN,
el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir, es un proceso de
remoción de intrones), que ocurre dentro del núcleo de una célula. Existen diferentes
métodos de empalme del ARN, y la mayoría requiere de la ayuda de proteínas que
reconocen secuencias específicas en el pre-ARN.

La segunda pregunta sigue siendo tema de estudio. La denominada "teoría exótica de los
genes" sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes
se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. Esta teoría nos lleva
hacia la "hipótesis de barajeo de exones", la cual afirma que los intrones incrementan el
porcentaje de recombinación de los exones, haciendo más fácil moverlos y crear nuevos
genes. De acuerdo a esta teoría, la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos, motiva
la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los
genes existentes, en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos
genes a razón de un nucleótido a la vez.

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ADN RECOMBINANTE

Ante esta teoría, la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la
recombinación, entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los
procariotas?

Respecto a la tercera pregunta, existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los
"intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". Según la primera, los ancestros de los
eucariotas y los procariotas poseían intrones, pero éstos últimos los perdieron durante su
proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teoría, estos ancestros no poseían intrones y
los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo.

Actualmente se reconocen cuatro clases de intrones:

 Intrones del grupo I

 Intrones del grupo II
 Intrones del grupo III
 Intrones nucleares, spliceosomales o intrones del grupo IV

Los intrones del grupo I, II y III son intrones que sufren de autosplicing mediante
reacciones de transesterificación. La frecuencia con la que encontramos estos intrones en
el genoma es relativamente rara si la comparamos con la frecuencia de los
intrones spliceosomales.

Los intrones del grupo II y III son muy similares y presentan una estructura secundaria
altamente conservada. De hecho a veces los intrones del grupo III son identificados como
intrones del grupo II debido a su similitud funcional y estructural.

Los intrones del grupo I están presentes en los genes de ARNr de

algunos eucariotas inferiores y en los genes mitocondriales de hongos. Se caracterizan por
eliminarse mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una guanosina o
un nucleótido de guanosina libre; así como por carecer de secuencias consenso en los
puntos de empalme, aunque pueden tenerlas en su interior.

Los del grupo II y III se eliminan mediante un proceso auto-catalítico que requiere de
una adenina o de un spliceosoma, respectivamente. En ambos grupos, durante el proceso de
empalme de los exones, se forma una estructura en lazo característica denominada lariat.

Los del grupo IV están presentes en los ARNt de los eucariotas y se caracterizan por ser los
únicos que se eliminan mediante un corte endonucleótido seguido de un ligamiento en lugar
de la reacción de transesterificación

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ADN RECOMBINANTE

REPETICIONES Y NO REPETICIONES

ADN repetido.

 Islas CG: Se encuentran aproximadamente 1 Kpb a 5' de muchos genes, antes del
promotor. Las repeticiones suelen ser de decenas, con un patrón de distribución del
dinucleótido característico. Tanto la rareza como esta especial distribución y
concentración, que no se da en otras partes del genoma, hacen suponer una misión
reguladora a estas secuencias. De hecho, se han encontrado elementos conocidos de
regulación solapando con ellas (cajas), por lo que probablemente modulen la unión
a ese elemento.

 Agrupaciones de AT y de CA, sobre todo, que abundan en el ADN espaciador entre

genes.

 Repeticiones de CA en el ADN centromérico.

 ADN telomérico: Consta de secuencias altamente repetidas (cientos de veces) de 4 a

8 nt. Favorecen la replicación del ADN en el extremo lineal del cromosoma. Parece
que, además, ayuda a estabilizar los cromosomas y evitar su degradación por esos
extremos, pero también parece limitar el número de potenciales divisiones celulares.
La enzima que añade este polinucleótido (diferente para cada especie) es la
telomerasa, que sintetiza ADN independientemente de molde.

 Expansión de trinucleótidos: En ciertos genes hay repeticiones de un trinucleótido

entre 10 y 100 veces, tanto en la secuencia codificante como en los intrones y las 3'
y 5' UTR (untranslated terminal region: región no traducida terminal; hay dos
presentes en todos los ARNm y que se encuentran antes y después de los codones

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ADN RECOMBINANTE

de inicio y terminación, respectivamente, con las secuencias de adhesión y

disociación del ribosoma y con implicaciones en la expresión génica). Este
fenómeno se conoce muy bien en la enfermedad de la corea de Huntington, en la
que el gen que codifica para la proteína responsable, la huntingtina, posee entre 10 y
30 repeticiones del trinucleótido CAG cuando es funcional, y la enfermedad se
desarrolla cuando se sobrepasa cualquiera de los dos límites, porque la proteína
pierde su función, y la gravedad es proporcional al número de repeticiones de más.

Estructura de ADN en cuádruplex formada por repeticiones

Repeticiones de secuencias largas.

 SINE (secuencias cortas dispersas entre genes): Son secuencias de unos cientos de
pb, presentes en un muy elevado número de copias. Las que mejor se conocen son
las de la familia Alu, cada una con 300 pb y distribuidas en 500000 copias, pero en
cualquier caso no se sabe qué son ni porqué permanecen en el genoma, cuando no
parecen tener ninguna función. Se sabe que estos elementos son capaces de incluirse
en otro sitio del genoma porque se han detectado casos de mutaciones en las que un
exón quedaba interrumpido por una de estas secuencias que antes no estaba ahí. Se
dice entonces que la mutación es knockin (mutación por inclusión de material
genético). No se conoce el mecanismo de replicación de estas secuencias, pero se
supone que deben, en algún momento, traducirse (no se sabe si con un promotor
propio o con otro cercano) para después retro-transcribirse (como los retrovirus;
posibles implicaciones evolutivas) en ADNds y posteriormente incluirse al azar en
el genoma. Lo que es evidente es que juegan un papel importante en la construcción
de genomas y que, probablemente, lo han hecho a lo largo de la evolución
generando una gran variabilidad.

 LINE (secuencias largas dispersas entre genes): Son secuencias de unos 7000 pb
que se encuentran flanqueando genes. Por su tamaño forman parte del ADN

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ADN RECOMBINANTE

moderadamente repetido. Se cree que favorecen la recombinación y el

sobrecruzamiento, por lo que su principal misión sería favorecer la diversificación
genética. También tiene importantes implicaciones evolutivas, ya que alguna vez la
recombinación puede no ser homóloga y provocar, por ejemplo, la unión o
separación de cromosomas.

FAMILIAS GENÉTICAS -TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE ARN EN

EUCARIOTES

Una familia génica es un conjunto de genes con un alto grado

de homología que, sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo
gen) porque codifican para productos distintos, poseen un
parentesco evolutivo que es consistente con un proceso de
copia, diversificación y evolución independiente. Es importante
no confundirlo con ADN repetido. Generalmente las familias
génicas se encuentran agrupadas, y los genes que las
constituyen distan unos pocos Kpb unos de otros, pero son
independientes, cada uno con sus propios elementos de
regulación que, a veces, actúan de manera totalmente independiente. Sin embargo, se
conoce desde hace mucho tiempo que familias génicas como, por ejemplo, la de las
hemoglobinas, aun constando de proteínas independientes, posee una regulación conjunta
de todos los genes durante el desarrollo, de modo que se puede considerar la existencia de
un elemento de regulación de la familia entera. Se han descubierto elementos de ese tipo a
5' del locus de la hemoglobina, denominados LCR (locus controlling regions: regiones
controladoras del locus), pero no se sabe cómo actúan, sobre todo porque controlan la
expresión de genes que están a Mpb de distancia.

Muchas veces, durante la evolución de una copia de un gen determinado, el producto no es

funcional, o impide el buen funcionamiento en uno u otro sentido, por lo que se selecciona
negativamente y se inactiva permanentemente. Este gen nunca transcrito se llama
pseudogén, porque tiene todos los elementos necesarios para poder llegar a sintetizarse,
excepto alguno esencial (el promotor, el codón de iniciación, etc.). A pesar de que es un
gen inútil, sobre él pueden desarrollarse fenómenos de mutación al azar que deriven en un
gen funcional y reviertan la inactivación o, a corto plazo, es parte activa en procesos de
recombinación genética porque su secuencia es altamente homóloga con la de los genes
funcionales de su alrededor. Este hecho permite la aparición de mutantes híbridos, como es
el caso de la mayoría de las talasemias que conciernen al locus de la hemoglobina.

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ADN RECOMBINANTE

Los ARNr son un ejemplo de familia génica; no por las posibles analogías entre cada uno
de ellos, sino en que en una célula eucariota suele haber cientos de repeticiones en tándem
del conjunto de genes que los codifican. En el humano son unas 200 copias repartidas en
cinco cromosomas. Cada una de estas copias tiene su propio promotor, pero en todas es el
mismo, claro.

Transcripción
El proceso de transcripción en los
eucariotas es similar a los de los
procariota, existen sin embargo
algunas diferencias. Los genes
eucariotas no se agrupan en
operones como los de los
procariotas. Cada gen eucariota se
transcribe separadamente, con un
control transcripcional
independiente para cada gen. Si bien
los procariotas tienen un solo tipo de ARN
polimerasa para todos los tipos de ARN, los
eucariotas tienen una para cada tipo. Una para
el mARN, una para los rARN largos y una
tercera para los rARN cortos y los tARN.

En procariotas la traducción comienza inclusive

antes que la transcripción haya terminado,
mientras que en eucariotas tenemos dos
procesos separados en tiempo y localización
(recordar la existencia de una envoltura nuclear). Luego que en el núcleo de la célula
eucariota se transcribe un ARN, el ARN transcripto es extensamente modificado antes de
ser exportado al citoplasma. Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5'
del mARN; y esto resulta esencial para el pegado del mARN al ribosoma. Una ristra de
adeninas (tanto como 200 nucleótidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del
mARN luego de la transcripción. La función de esta "cola" de poli A no se conoce, pero
puede usarse para capturar mARN para estudios. Los intrones se cortan y los exones se
colocan juntos antes que el mARN deje el núcleo.

Existen muchos ejemplos de mensajes idénticos

procesados por diferentes métodos (ver El ACTH y su
familia de péptidos), a veces los intrones se tornan
exones y viceversa.

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Moléculas de proteínas se pegan al mARN y luego se exportan del núcleo formando

partículas llamadas ribonucleoproteínas (mRNPs) que parecen ayudar en el transporte por
los poros nucleares y también en el pegado a los ribosomas.

El ARN mensajero (ARNm, o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que

contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de
proteínas, es decir, determina el orden en que se unirán los aminoácidos. El ARN
mensajero es un ácido nucleico monocatenario, al contrario que el ADN que es bicatenario.

Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos, es decir, contienen información para

una sola cadena polipeptídica, mientras que en los procariotas los ARNm son con
frecuencia policistrónicos, es decir, codifican más de una proteína.

Procesamiento de ARN
El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito
primario o ARN precursor (pre-ARN), que en la mayoría de los casos no se libera del
complejo de transcripción en forma totalmente activa, sino que ha de sufrir modificaciones
antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN). Entre esas
modificaciones se encuentran la eliminación de fragmentos (splicing), la adición de otros
no codificados en el ADN y la modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas.
Concretamente, el procesamiento del ARN en eucariotas comprende diferentes fases:

1. Adición al extremo 5' de la estructura denominada caperuza o casquete (o CAP,

su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina, la 7-
metilguanosina, que se añade al extremo 5' de la cadena del ARNm transcrito
primario (ubicado aún en el núcleo celular) mediante un enlace 5'-fosfato → 5'-
fosfato en lugar del habitual enlace 3',5'-fosfodiéster.1 Esta caperuza es necesaria
para el proceso normal de traducción del ARN y para mantener su estabilidad; esto
es crítico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma.

2. Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A, una secuencia larga

de poliadenilato, es decir, un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina. Su
adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA),
situada unos 20-30 nucleótidos antes del extremo 3' original. Esta cola protege al
ARNm frente a la degradación, aumentando su vida media en el citosol, de modo
que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína.

3. En la mayoría de los casos, el ARN mensajero sufre la eliminación de secuencias

internas, no codificantes, llamadas intrones. Esto no ocurre en células procariontes,
ya que estas no poseen intrones en su ADN. El proceso de retirada de los intrones y
conexión o empalme de los exones se llama ayuste, o corte y empalme (en

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inglés, splicing). A veces un mismo transcrito primario o pre-ARNm se puede

ayustar de diversas maneras, permitiendo que con un solo gen se obtengan varias
proteínas diferentes; a este fenómeno se le llama ayuste alternativo. Ciertas
enzimas parecen estar involucrados en editar el RNA antes de su exportación fuera
del núcleo, intercambiando o eliminando nucleótidos erróneos.

4. El ARN mensajero maduro es trasladado al citosol de la célula, en el caso de los

seres eucariontes, a través de poros de la membrana nuclear.

5. Una vez en el citoplasma, el ARNm se acoplan los ribosomas, que son la

maquinaria encargada de la síntesis proteica. En procariontes, la unión de los
ribosomas ocurre mientras la cadena de ARNm está siendo sintetizada.

6. Después de cierta cantidad de tiempo el ARNm se degrada en sus nucleótidos

componentes, generalmente con la ayuda de ribonucleasas.

El proceso de transcripción y el de traducción se realizan de manera similar que en las

células eucariotas. La diferencia fundamental está en que, en las procariotas, el ARN
mensajero no pasa por un proceso de maduración y, por lo tanto, no se le añade caperuza ni
cola, ni se le quitan intrones. Además no tiene que salir del núcleo como en las eucariotas,
porque en las células procariotas no hay un núcleo definido.

ADN DE LOS ORGANELOS ENERGÉTICOS

Existen dentro de la célula dos organelos que aportan energía la mitocondria y el

cloroplasto, estos dos organelos tienen su propia información genética y se replican de
manera independiente del DNA nuclear.

Aquí ocurren diversas reacciones de fosforilación oxidativa, por lo cual su DNA presenta
muchas mutaciones.

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El por qué estos dos organelos tienen DNA está basado en una teoría llamada
"endosimbiótica" en donde menciona que la mitocondria y el cloroplastos, eran organismos
procariotes capaces de realizar dichas funciones antes mencionadas y que aportan a la
célula energía. 

Las células eucariotes primitivas no eran capaces de fotosintetizar (cloroplastos) o de

realizar fosforilizaciones (mitocondria), así que estos tres organismos comenzaron a
convivir, haciendo que unos dependieran de otro.

Al crearse ese vínculo fuerte, ya no pudieron dejar de ser diferentes organismos y al

evolucionar, se convirtieron en una sola célula.

BIBLIOGRAFÍA

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Biología Celular de los Microorganismos - Brock 10ma Edición

Biología de Curtis H., N. Sue Barnes 5ta, y 6ta edición versión online
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and processing of

http://www.revista.unam.mx/vol.2/num3/art1/index.html

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CUADROS DE
RESUMEN

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