HPLC Metodología

ETAPAS DEL ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO

* CONOCIMIENTO DE LA MUESTRA

* MUESTREO
Toma de muestra
Almacenamiento

* PREPARACIÓN DE MUESTRA
Fraccionamiento
Recuperación
Limpieza
Preconcentración

* ELECCIÓN DE LA TÉCNICA CROMATOGRÁFICA

Columna adecuada (Fase estacionaria)
Fase móvil

* IDENTIFICACIÓN

* CUANTIFICACIÓN
HPLC Metodología

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

* REDUCIR LA CANTIDAD DE MUESTRA QUE SE

INYECTA A LA COLUMNA

* ELIMINAR LAS INTERFERENCIAS ASOCIADAS A LA

MATRIZ

* CONCENTRAR LOS COMPONENTES DE INTERES;

MEJORAR LA SENSIBILIDAD

* PREPARAR LA MUESTRA EN EL DISOLVENTE MÁS

ADECUADO PARA EL ANÁLISIS FINAL

* ELIMINAR PARTÍCULAS EN SUSPENSIÓN

* PROTEGER LA COLUMNA

* MEJORAR LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE

LOS PICOS

* PROPORCIONAR RECUPERACIONES
CUANTITATIVAS Y REPRODUCIBLES
HPLC Metodología

TIPOS DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS

* FILTRACIÓN

* EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO

* CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

* PRECIPITACIÓN SELECTIVA

* CROMATOGRAFÍA DE PERMEACIÓN SOBRE GELES

* EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA

* CENTRIFUGACIÓN

* PRECOLUMNAS

* UTILIZACIÓN DE MEMBRANAS
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ELECCIÓN DE LA TÉCNICA
Fase reversa
CROMATOGRÁFICA No iónicos enlazada

Soluble Fase reversa

control de
en agua
ionización

Fase reversa
Iónicos pares iónicos

Peso molecular Intercambio

> 2000 iónico

Cromatografía
iónica

Soluble Filtración sobre geles

en THF (pequeñas moléculas)

Soluble en Fase reversa

orgánicos Hexano adsorción

Fase normal
enlazada
Muestra
Metanol
Metanol:agua
Fase reversa
enlazada

Fase reversa
enlazada

Filtración sobre
Soluble geles (acuosa)
en agua
Intercambio
iónico

Interacción
Peso molecular hidrofóbica
< 2000

Soluble en Filtración
orgánicos sobre geles
HPLC Metodología

ELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

* TIPOS DE DISOLVENTES

METANOL
ACETONITRILO
ORGÁNICOS TETRAHIDROFURANO
CLORURO DE
METILENO
HEXANO

ACUOSOS AGUA

CLOROFORMO/ETANOL
METANOL/AGUA
MEZCLAS ACETONITRILO/AGUA

METANOL/AGUA/ACETONITRILO
HEXANO/ALCOHOL
ISOPROPÍLICO

REACTIVOS DE PAR
IÓNICO
ÁCIDO ACÉTICO
ÁCIDO
TRIFLUORACÉTICO
MODIFICADORES TRIETILAMINA
FOSFATOS
HPLC Metodología

ELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

* PROPIEDADES DE LOS DISOLVENTES

PUNTO DE CORTE EN EL
ULTRAVIOLETA

PUREZA

MISCIBILIDAD

INFLAMABILIDAD

VOLATILIDAD

POLARIDAD

ESTABILIDAD (DEGRADACIÓN)

EFECTOS DE MEZCLA

TOXICIDAD

VISCOSIDAD

pH

PROPIEDADES DE LOS
MODIFICADORES
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ELLECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

* POLARIDAD DE LOS DISOLVENTES

POLAR

H 2O

MeOH

AcN

THF

CH2Cl2

HEXANO

NO POLAR
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ELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL

* ELUCIÓN EN ISOCRÁTICO
- La composición de la fase móvil permenace
constante a lo largo de todo el desarrollo del
cromatograma.

* ELUCIÓN EN GRADIENTES

- La composición de la fase móvil se modifica

durante el registro del cromatograma.
- Separación de compuestos con valores del
factor de retención muy diferentes.
- Reduce el tiempo de análisis aumentando la
fuerza de la fase móvil con el tiempo.

TIPOS DE GRADIENTES
final
Lineales
Cóncavos
Convexos
composición

Alta presión
Baja presión

Binarios
Ternarios Inicial
Cuaternarios Inicial tiempo final
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PRECAUCIONES CON GRADIENTES

* TIEMPO DE EQUILIBRADO

* MISCIBILIDAD/COMPATIBILIDAD DE DISOLVENTES

* DESGASIFICACIÓN CONTINUA PARA EVITAR EN LO

POSIBLE LA FORMACIÓN DE BURBUJAS EN EL
SISTEMA CROMATOGRÁFICO

* UTILIZAR DISOLVENTES DE LA MAYOR PUREZA

* EFECTUAR “BLANCOS” DE GRADIENTE

* PROGRAMAR UNA VUELTA A LAS CONDICIONES

INCIALES AL FINAL DEL GRADIENTE

* PROBLEMAS DE REPRODUCIBILIDAD QUE

DIFICULTAN LAS APLICACIONES CUANTITATIVAS
HPLC Metodología

PREPARACIÓN DE MUESTRAS

* REDUCIR LA CANTIDAD DE MUESTRA QUE SE

INYECTA A LA COLUMNA

* ELIMINAR LAS INTERFERENCIAS ASOCIADAS A LA

MATRIZ

* CONCENTRAR LOS COMPONENTES DE INTERES;

MEJORAR LA SENSIBILIDAD

* PREPARAR LA MUESTRA EN EL DISOLVENTE MÁS

ADECUADO PARA EL ANÁLISIS FINAL

* ELIMINAR PARTÍCULAS EN SUSPENSIÓN

* PROTEGER LA COLUMNA

* MEJORAR LA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE

LOS PICOS

* PROPORCIONAR RECUPERACIONES
CUANTITATIVAS Y REPRODUCIBLES