Trường Đại học Sài Gòn

Khoa Khoa học môi trường

Tiểu luận môn học: PHÂN TÍCH MÔI TRƯỜNG

Đề tài: TÌM HIỂU MÁY HPLC
•

Nhóm: 2 Lớp: DKM1091

Thành viên thực hiện: Mã sinh viên:
Đỗ Hồng Vân 3109340144
Nguyễn Thị Như Mai 3109340073
Huỳnh Trần Chiến Công 3109340015
Trương Thị Tâm Tâm 3109340
GV Hướng dẫn: GS.TS. Phạm Nguyễn Kim Tuyến
 1 TỔNG QUAN

2 CẤU TẠO

HPLC 3 NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

4 ỨNG DỤNG CỦA MÁY HPLC

I. TỔNG QUAN
HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) là
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Trước kia gọi là
phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển.
Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm
nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm
thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các
thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng .
Phương pháp sắc ký (Được phát minh bởi nhà sinh vật học người Nga – Mikhail
Tswest ) :
 Kỹ thuật tách (seperation) các cấu tử trong một hệ đồng thể (khí hoặc lỏng)
 Cân bằng nồng độ của các cấu tử trong hai pha tiếp xúc nhau: pha tĩnh (stationary
phase) và pha động (mobile phase)
 Sự phân tách dựa trên tốc độ kéo theo (elution) khác nhau của các cấu tử trong cột
(column)
 Một đầu dò (detector) ở đầu ra của cột cho phép định lượng liên tục các cấu tử
trong hỗn hợp đầu
 Sắc ký phân tách
(Elution chromatography)
Phân tách sắc ký: Các chất tan bị rửa qua một pha tĩnh nhờ sự chuyển động
của pha động qua nó
Mẫu Pha động

Detector
t0 t1 t2 t3 t4
detector
Tín hiệu

t0 t1 t2 t3 t4 Thời gian
 Sắc ký đồ
(Chromatogrames)

Điều kiện để thu được sắc ký đồ:

- Đầu dò (Detector) được lắp đặt ở điểm cuối của cột
- Đầu dò tương thích với các chất cần phát hiện
Sắc ký đồ: Biểu diễn sự biến thiên của tín
hiệu ra theo thời gian hoặc theo thể tích
tiêu hao của pha động
 Ưu điểm của phương pháp sắc ký
- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
- Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100µ L)
 Khái niệm về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó
pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được
phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá
học với các nhóm chức hữu cơ .

Mobile phase
(Pha động)

Stationary phase
(Pha tĩnh)
- Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất.
- Dựa trên 2 quá trình:
Hấp phụ
Giải hấp phụ
- Xảy ra liên tục giữa 2 pha:
Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng, giữ chất phân tích
Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất), hòa tan và di chuyển
chất phân tích
- Sắc ký lỏng chia thành 2 nhóm
Sắc ký lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)
Sắc ký lỏng áp suất cao (Sắc ký lỏng hiệu năng cao: HPLC)
Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC chia thành:

SK
phân
bố SK pha
thường
SK ghép
cặp ion
HPLC
SK
pha
đảo
Sk trao
đổi ion
Khi nối với đầu do (detector), HPLC cho phép:
- Định tính: dựa vào thời gian lưu
- Định lượng: dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak
 II.CẤU TẠO MÁY HPLC

Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha động
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4- Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5- Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ
điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ
liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .
1 - Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC NGUỒN CUNG CẤP PHA ĐỘNG
thường có 04 đường dung môi (MOBILE PHASE): LÀ BÌNH ĐỰNG
vào đầu bơm cao áp .Cho phép DUNG MÔI HOẶC DUNG MÔI
chúng ta sử dụng 04 bình chứa CHẠY MÁY
dung môi cùng 1 lần để rửa giải
theo tỷ lệ mong muốn và tổng
tỷ lệ dung môi của 4 đường là
100 % .
- Tuy nhiên theo kinh
nghiệm thì chúng ta ít khi sử
dụng 04 đường dung môi cùng
một lúc mà chúng ta chi sử dụng
tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ
pha động luôn được pha trộn
đồng nhất hơn,hệ pha độüng
đơn giản hơn để quá trình rửa
giải ổn định .
- Hiện 04 đường dung
môi phục vụ chủ yếu cho việc
rửa giải Gradial dung môi theo
thời gian và công tác xây dựng
2 Bộ khử khí Degasse :
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các
bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động .
Nếu như trong quá trình phân tích mà dung
môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện
tượng sau đây sẽ sảy ra:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy
không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay
đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí
không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ
không hút được dung môi khi đó áp suất không lên
và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động .
3- Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi):
- Bơm pha động vào cột tách
- Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối
đa 412 Bar (1at = 0.98Bar). Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút .

HỆ THỐNG ĐIỀU KHIỂN ÁP SUẤT

HOẶC TỐC ĐỌ DÒNG PHA ĐỘNG,
CÒN GỌI LÀ HỆ THỐNG CUNG CẤP
DUNG MÔI: LC PUMP
4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection valve):
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng
dòng chảy . Với dung tích của l bóp là 5 - 100µ l .
Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công
(tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample) .

BƠM MẪU BẰNG TAY

BƠM MẪU TỰ ĐỘNG

(AUTO SAMPLE)
5. Cột tách (Colume)
LÒ CỘT (COLUME OVEN): DÙNG CỘT TÁCH: LÀ NƠI XẢY RA CÁC
ĐỂ ĐIỀU KHIỂN NHIỆT ĐỘ CỘT QUÁ TRÌNH TÁCH CHẤT, GỒM
TÁCH CỘT PHÂN TÍCH VÀ CỘT BẢO VỆ

- Cột tách có kích cỡ khác

nhau
- Chiều dài: 10 – 25cm
- Đường kính: 2 – 5mm
5 Cột tách :
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao.
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều dài cột
khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất nhồi cỡ φ = 5-10
µ m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ
hạt....)
- Với chất nhồi cột cỡ φ = 1.8 -5 µ m có thể dùng cột ngắn ( 3-10 cm
) và nhỏ (đường kính trong 1-4.6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao.
- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký
- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)
hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ
( pha đảo ) , ngoài ra người ta còng dùng các loại hạt khác như : Nhôm
Oxit,Polyme xốp,chất trao đổi ion.
* * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao
hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt
(Oven column)
6 .ÑAÀU DOØ (DETECTOR):
COÙ NHIEÀU LOAÏI KHAÙC NHAU TUØY THEO MUÏC
ÑÍCH PHAÂN TÍCH.
DUØNG ÑEÅ PHAÙT HIEÄN CHAÁT VAØ ÑÒNH
LÖÔÏNG : UV-VIS, HUYØNH QUANG, ÑOÄ DAÃN, ÑIEÄN
HOÙA, KHOÁI PHOÅ …
7. HEÄ THOÁNG GHI NHAÄN VAØ XÖÛ LYÙ TÍN
HIEÄU (INTERFACE, SOFTWARE, PC) : DUØNG
ÑEÅ THU THAÄP VAØ TÍNH TOAÙN CAÙC KEÁT
QUAÛ.
III. NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG MÁY HPLC
- Mẫu chất lỏng được đưa vào buồng bơm mẫu sau đó được bơm tự
động vào cột tách.
- Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha:
một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha
tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động. Do các cấu tử chất
phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau.
- Các quá trình tách trong sắc ký lỏng:
 Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký
 Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc
ký
 Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất phân tích từ đầu cột
đến cuối cột
 Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy
qua cột tách với một tốc độ nhất định
 Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa
các chất trong pha tĩnh và pha động
 Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp
chất phức tạp
 Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký

column

Vật liệu nhồi cột 3- 5µ m

 Quá trình tách

mixed sample
Mobile phase
column
Hỗn hợp chất tách khỏi
nhau thế nào ?

Flow

Pha tĩnh
 - Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần lượt đi vào
detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này
được khuyếch đại rồi chuyển sang bộ ghi. Các tín hiệu được xử lý ở
đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.
- Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử
được tách gọi là peak. Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng
(định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích peak là thước đo định
lượng cho chất cần phân tích.
-Thời gian chất phân tích bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu)
quyết định bởi:
 Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất
phân tích.
 Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải
chất phân tích ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh).
 - Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất phân
tích  sắc ký đồ gồm nhiều peak.
- Đặc điểm của peak phân tích :
 Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn
 Chập nhau một phần
 Chập nhau hoàn toàn
- Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay
không tốt.
• Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất  có bấy nhiêu peak
riêng biệt không chập nhau
• Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng,
chất lưu giữ kém sẽ ra trước
• Tuỳ từng chất cần nghiên cứu và các điều kiện phân tích
để chọn các detector khác nhau.
 Ứng dụng của HPLC

- Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khó bay hơi trong nhiều đối
tượng khác nhau:
+ Amino acid
+ Acid hữu cơ
+ Thuốc trừ sâu
+ ….