Helicobacter pylori pergeseran keseimbangan pemberantasan monosit reseptor Fcγ terhadap

FcγRIIB hambat pada pasien purpura trombositopenik kekebalan

Atsuko Asahi 1, 2, Tetsuya Nishimoto 1, Yuka Okazaki 1, Suzuki Hidekazu 3, Tatsuhiro Masaoka 3,
Yutaka Kawakami 4, Yasuo Ikeda 2 dan Masataka Kuwana 1

Pertama kali diterbitkan 24 Juli 2008

Diterima untuk publikasi November 14, 2007, dan diterima dalam bentuk revisi 14 Mei 2008.

Immune trombositopenia purpura (ITP) adalah gangguan perdarahan yang spesifik autoantibodies
platelet menyebabkan kehilangan platelet. Dalam subset dari pasien dengan ITP dan terinfeksi
dengan Helicobacter pylori, jumlah platelet pulih setelah pemberantasan H. pylori. Untuk menguji
peran H. pylori infeksi pada patogenesis ITP, tanggapan dari 34 pasien ITP untuk pengobatan dengan
standar H. pemberantasan pylori regimen, terlepas dari apakah mereka terinfeksi H. pylori,
dievaluasi. Pemberantasan H. pylori dicapai di semua H. -Positif pasien pylori, dan peningkatan yang
signifikan dalam platelet diamati dalam 61% dari pasien. Sebaliknya, tidak ada H. -Negatif pasien
pylori menunjukkan platelet meningkat. Pada awal, monosit dari H. -Positif pasien pylori
menunjukkan kapasitas fagositik ditingkatkan dan tingkat rendah hambat reseptor Fcγ IIB (FcγRIIB).
Satu minggu setelah memulai H. rejimen pemberantasan pylori, ini fenotipe monosit aktif adalah
ditekan dan perbaikan dalam parameter kinetik platelet dan autoimun diikuti. Modulasi saldo FcγR
monosit juga ditemukan dalam hubungan dengan H. pylori infeksi pada orang yang tidak memiliki
ITP dan pada tikus. Temuan kami sangat menyarankan agar pemulihan dalam jumlah trombosit yang
diamati pada pasien ITP setelah H. pylori pemberantasan ditengahi melalui perubahan dalam
keseimbangan FcγR menuju FcγRIIB hambat.

Lihat Komentar awal terkait pada halaman 2677 .

Pengenalan

Immune trombositopenia purpura (ITP) adalah gangguan otoimun yang disebabkan oleh clearance
platelet-platelet meningkat autoantibodies anti ( 1 ). Pada tahun 1998, Gasbarrini et al. melaporkan
peningkatan jumlah platelet pada pasien ITP terinfeksi Helicobacter pylori sukses pemberantasan
setelah bakteri ini ( 2 ). mengumpulkan bukti terbaru di Italia dan Jepang menunjukkan bahwa
pemberantasan H. pylori efektif dalam meningkatkan jumlah platelet dalam hampir setengah H.
pylori pasien terinfeksi dengan ITP idiopatik ( 3 , 4 ). Selain itu, sebuah laporan baru-baru ini
menunjukkan bahwa respon platelet berlangsung selama bertahun-tahun dan kasus kambuh sedikit
( 5 ). Berdasarkan kemanjurannya, profil keamanan yang baik, dan biaya rendah, H. pylori terapi
untuk dewasa ITP pemberantasan menjadi sangat populer di beberapa negara. Beberapa peneliti
telah menyarankan bahwa keberhasilan H. pemberantasan pylori pada pasien ITP ini dimediasi oleh
H. pylori-independen mekanisme, seperti efek imunomodulator obat yang dipakai untuk rejimen
tersebut ( 3 ), tapi kami baru-baru ini melaporkan tidak lengkap keberhasilan dalam H. pylori tidak
terinfeksi ITP pasien dalam sebuah studi prospektif di mana pasien dirawat dengan standar H.
pemberantasan pylori rejimen terlepas dari mereka H. infeksi pylori status ( 6 ). Penemuan ini jelas
menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada pasien ITP setelah hasil rejimen
pemberantasan dari hilangnya H. pylori sendiri.
Beberapa hipotesis telah diusulkan mengenai mekanisme oleh H. mungkin pylori menginduksi
perkembangan ITP. Satu adalah bahwa Abs H. komponen pylori lintas bereaksi dengan antigen
permukaan platelet. Dalam hal ini, Takahashi et al. melaporkan bahwa platelet eluat dari H. pylori-
positif ITP pasien mengakui terkait gen cytotoxin A (CagA), salah satu H. pylori yang diturunkan dari
protein yang menentukan virulensi bakteri ( 7 ), meskipun kelompok lain menunjukkan bahwa
platelet eluat dari H. pylori-positif ITP pasien yang bereaksi dengan glikoprotein IIb / IIIA (GPIIb / IIIA)
atau GPIB gagal mengenali H. pylori antigen ( 8 ). Mekanisme potensial lain adalah modulasi yang
sistem kekebalan host oleh H. pylori dengan cara yang mendorong munculnya sel B autoreactive
( 9 ). Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan antara H. pylori-positif dan H. -Negatif individu
pylori telah ditemukan untuk organ-spesifik otoantibodi tanggapan-non, seperti anti-nuklir,
microsome, atau anti-halus otot Abs-anti ( 10 ). Meskipun temuan ini, peran H. infeksi pylori dalam
patogenesis ITP tetap jelas. Ini berfokus pada studi sebelumnya Ab produksi platelet anti-sama
dengan H. pylori infeksi, tetapi potensi efek H. pylori infeksi pada proses clearance platelet pada
pasien ITP belum dinilai. Dalam studi ini, untuk menjelaskan mekanisme yang bertanggung jawab
untuk pemulihan trombosit pada pasien ITP setelah sukses pemberantasan H. pylori, kami
melakukan studi prospektif di mana faktor-faktor lainnya yang berhubungan dengan proses
patogenik dari ITP, yaitu, respon autoimun terhadap antigen platelet utama GPIIb / IIIA, parameter
yang terkait dengan omset platelet, dan dan fungsional sifat fenotipik fagosit, adalah seri diukur ITP
pada pasien yang diobati dengan rejimen standar pemberantasan, terlepas dari mereka H. pylori
status infeksi. Temuan kami menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada pasien ITP setelah
H. pemberantasan pylori berhubungan dengan modulasi dari saldo reseptor Fcγ monosit terhadap
reseptor hambat Fcγ IIB (FcγRIIB).

Hasil

karakteristik pasien. Tiga puluh empat pasien berurutan dengan ITP (14 pria dan 20 wanita, usia 24-
73 th) telah terdaftar dalam label-terbuka ini, penelitian prospektif. H. pylori infeksi terdeteksi pada
23 pasien (68%). Perbandingan pretreatment secara klinis karakteristik H. -Positif dan-negatif pasien
pylori (Tabel 1 ) menunjukkan H. -Positif pasien pylori cenderung lebih tua dari H. pylori-negatif
pasien (P = 0,08). Beberapa pasien mengambil prednisolone dosis rendah (≤ 7,5 mg setiap hari), tapi
tidak ada perbedaan dalam frekuensi atau dosis berarti antara H. pylori-positif dan-negatif pasien.
Sejarah splenektomi bermakna kurang sering di H. -Positif dibandingkan dengan pasien pylori H.
pylori-negatif pasien, menunjukkan bahwa kasus-kasus refraktori lebih umum di H. pylori-negatif
pasien.

Tabel 1

Karakteristik klinis dari 34 pasien ITP menurut ada atau tidak adanya H. pylori infeksi

Kekebalan dan parameter trombosit omset sebelum pengobatan pada pasien ITP dengan dan tanpa
infeksi H. pylori. Sebanyak 11 kekebalan dan omset parameter trombosit, termasuk anti-GPIIb/IIIa
memproduksi sel-Ab B, terkait anti-GPIIb/IIIa Abs-platelet, tanggapan sel T dipicu oleh GPIIb / IIIA
dan toksoid tetanus, proporsi platelet Reticulated, yang thrombopoietin beredar (TPO) tingkat,
tingkat ekspresi relatif dari FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), FcγRIII, dan CD86 pada monosit
sirkulasi, dan fagositosis monosit sirkulasi spesifik dibandingkan antara pasien ITP dengan dan tanpa
H. pylori infeksi (Gambar 1 ). Kami mengevaluasi proporsi monosit mengungkapkan FcγRIII bukan
tingkat ekspresi yang karena hanya sebagian kecil dari monosit darah perifer disajikan FcγR ini.
Gambar 1

Kekebalan dan parameter pergantian platelet sebelum pengobatan pada pasien ITP dengan atau
tanpa H. pylori infeksi. anti-GPIIb/IIIa yang memproduksi sel-Ab B, platelet-asosiasi (PA) Abs anti-
GPIIb/IIIa, GPIIb / IIIA-respon sel T spesifik, tetanus toksoid-spesifik (TT-spesifik) respon sel T,
Reticulated platelet proporsi (% RP), beredar tingkat TPO, ekspresi tingkat FcγRI dan FcγRII (FcγRIIA
ditambah FcγRIIB) pada monosit, proporsi monosit FcγRIII-positif, tingkat ekspresi CD86 pada
monosit, dan fagositosis spesifik dari monosit dibandingkan antara 23 ITP pasien terinfeksi H. ITP
pylori dan 11 pasien yang tidak terinfeksi H. pylori. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan menggunakan
klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Perbedaan antara 2 kelompok
dianalisis dengan menggunakan uji U-Mann Whitney.

Tidak ada perbedaan pada frekuensi anti-GPIIb/IIIa Ab-sel B memproduksi atau platelet-terkait anti-
GPIIb/IIIa Ab tingkat antara 2 kelompok. Sebaliknya, H. Pylori positif pasien menunjukkan respons sel
T lebih menonjol GPIIb / IIIA dibandingkan dengan H. -Negatif pasien pylori, dan tidak ada perbedaan
dalam tingkat respon terhadap toksoid tetanus, yang mengingat antigen asing tidak relevan. Proporsi
Reticulated platelet secara signifikan lebih besar di H. pylori-positif pasien daripada di H. pylori-
negatif pasien. Dalam beredar monosit, ekspresi FcγRII, termasuk mengaktifkan FcγRIIA dan FcγRIIB
hambat, lebih rendah di H. pylori-positif pasien daripada H. pylori-negatif pasien. Selain itu, ekspresi
mengaktifkan FcγRI cenderung upregulated di H. pylori-positif pasien (P = 0,06). Akhirnya, monosit
dari H. -Positif pasien pylori menunjukkan kapasitas fagositik disempurnakan dibandingkan dengan
yang berasal dari H. pylori-negatif pasien, menyarankan suatu fenotipe monosit diaktifkan
mendominasi H. pylori-positif pasien.

respon trombosit terhadap rejimen pemberantasan H. pylori. Semua 34 pasien menyelesaikan hari
standar pemberantasan rejimen-7 yang terdiri dari amoksilin, klaritromisin, dan lansoprazole
terlepas dari apakah mereka positif untuk H. pylori infeksi. Efek samping potensial yang terkait
dengan terapi diamati pada 10 pasien (29%): sakit perut dan / atau diare pada 9 dan ruam kulit
dalam 1. Semua gejala diselesaikan dengan cepat setelah rejimen berakhir. Pemberantasan berhasil
di semua 23 H. pylori-positif pasien, dan 14 (61%) dari mereka diklasifikasikan sebagai responden.
Sebaliknya, tak satu pun dari 11 H. -Pasien pylori negatif menunjukkan jumlah trombosit meningkat.
Frekuensi ini berbeda secara nyata (P = 0,001). platelet menghitung 0, 12, dan 24 minggu setelah
memulai rejimen pemberantasan di H. pylori-positif responden dan nonresponders, dan H. -Negatif
pasien pylori diperlihatkan pada Gambar 2 . Beberapa H. -Positif nonresponders pylori menunjukkan
sedikit peningkatan dalam jumlah platelet, tetapi hampir tidak ada fluktuasi jumlah platelet diamati
di H. pylori-negatif pasien. Selama periode 24 minggu, dosis prednisolone berkurang dalam 2
responden pada 12 minggu (7,5-5 mg dan 5 sampai 2,5 mg), tetapi stabil dosis diberikan pada pasien
yang tersisa.

Gambar 2

Serial jumlah platelet sebelum dan setelah inisiasi dari H. rejimen pylori pemberantasan dalam 14 H.
pylori-positif ITP responden, 9 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 11 H. pylori-negatif ITP
nonresponders dan. Perubahan secara absolut nilai 12 24 minggu dari nilai awal diambil di wk 0
dinilai dengan uji t berpasangan. * P <0,01 dibandingkan dengan minggu 0.
Serial perubahan dalam kekebalan dan omset parameter trombosit setelah eradikasi H. pylori dan.
kekebalan parameter omset platelet diukur sebelum perlakuan diperiksa seri 12 dan 24 minggu
setelah memulai rejimen pemberantasan di H. pylori-positif responden dan nonresponders dan di H.
pylori-negatif pasien (Gambar 3 ). The Ab B memproduksi sel-anti-GPIIb/IIIa dan terkait anti-
GPIIb/IIIa Abs-trombosit sangat berkurang pada 12 dan 24 minggu di H. pylori-positif responden.
Proporsi platelet Reticulated juga sangat berkurang di H. pylori-positif responden. tetapi lemah tren
yang serupa diamati di H. pylori-positif nonresponders tetapi tidak di H. pylori-negatif pasien. T sel
darah perifer tanggapan terhadap GPIIb / IIIA cenderung ditekan dalam H. pylori-positif responden
(P = 0,09), sedangkan tidak ada fluktuasi dalam penanggulangan toksoid tetanus. Dalam monosit dari
H. -Positif responden pylori, dasar mereka upregulated ekspresi FcγRI menurun dan FcγRII
downregulated (FcγRIIA ditambah FcγRIIB) ekspresi meningkat menjadi tingkat monosit dari H.
pylori-negatif pasien setelah H. pemberantasan pylori. Sebaliknya, proporsi monosit FcγRIII-positif
dan tingkat ekspresi CD86 pada monosit yang stabil dalam semua 3 kelompok selama masa studi.
Kapasitas fagositosis monosit yang disempurnakan dalam H. -Positif responden pylori secara
signifikan berkurang setelah H. pylori pemberantasan, mencapai tingkat H. pylori-negatif pasien.
Perubahan-perubahan dalam monosit fenotipe tidak diamati dalam H. pylori-positif nonresponders
atau di H. pylori-negatif pasien. IgG anti-CagA tingkat Ab dikurangi secara bertahap mengikuti
rejimen pemberantasan di H. -Positif pasien pylori terlepas dari respon platelet, tetapi sampel masih
positif untuk anti-CagA Ab bahkan pada 12 dan 24 minggu, waktu jumlah platelet hampir
sepenuhnya pulih.

Gambar 3

Serial pengukuran parameter kekebalan dan omset platelet sebelum dan setelah H. pemberantasan
H. pylori dalam 14 pylori-positif ITP responden, 9 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 11 H.
pylori-negatif ITP nonresponders Ab. memproduksi B-sel Anti-GPIIb/IIIa, platelet-terkait anti-
GPIIb/IIIa Abs, GPIIb / IIIA-respon sel T spesifik, tetanus toksoid-respon sel T spesifik, proporsi
platelet Reticulated, beredar TPO tingkat, tingkat ekspresi FcγRI dan FcγRII (FcγRIIA ditambah
FcγRIIB) pada monosit, proporsi monosit FcγRIII-positif, tingkat ekspresi CD86 pada monosit, spesifik
fagositosis monosit sirkulasi, dan Ab anti-CagA tingkat diukur sebelum perlakuan dan 12 dan 24
minggu setelah inisiasi dari H. pylori pemberantasan rejimen. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan
menggunakan klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Hasil akan
ditampilkan sebagai SD + berarti. Perubahan nilai pada 12 dan 24 minggu dari nilai awal diukur pada
minggu 0 dinilai dengan uji t berpasangan. garis putus-putus menunjukkan memotong-nilai: 2.0
untuk sel anti-GPIIb/IIIa B Ab-memproduksi; 3,3 U untuk Abs anti-GPIIb/IIIa platelet-asosiasi; 2,0%
untuk% RP; dan 7,5 U untuk anti-CagA Ab. † P <0,1, * P <0,05, dan ** P <0,01 dibandingkan dengan
minggu 0.

Dalam H. pylori-positif responden, setelah pemberantasan H. pylori, parameter untuk T dan

tanggapan sel B untuk antigen platelet dan platelet omset meningkat, dan monosit fenotipe
diaktifkan ditindas, karena jumlah trombosit meningkat. Untuk menguji parameter yang diubah
pertama, kami lebih lanjut dievaluasi parameter tersebut pada 1 minggu, ketika pemberantasan
rejimen baru saja berakhir, dalam 14 H. pylori-positif responden (Tabel 2 ). Hitungan platelet nyata
meningkat pada 1 minggu, konsisten dengan laporan sebelumnya ( 5 ). Pada titik waktu ini, kapasitas
fagositik monosit adalah parameter-satunya yang berubah dari tingkat pretreatment nya.
Tabel 2

Serial pengukuran terkait parameter ITP sebelum dan 1 minggu setelah H. rejimen pylori
pemberantasan dalam 14 H. pylori-positif responden

Dalam 3 H. pylori-positif pasien yang tidak diobati dan yang platelet count adalah> 50 × 10 9 / l pada
awal penelitian, 2 orang responden dan 1 sisanya nonresponder seorang. Saat ini 3 pasien
dikeluarkan dari analisis, hasil sesuai mengenai perubahan fenotipe monosit diperoleh.

Perubahan FcγRIIA / saldo IIB dari monosit setelah pemberantasan H. pylori. Pada manusia, 2 jenis
FcγRII disajikan pada monosit: suatu reseptor mengaktifkan, FcγRIIA, dan reseptor hambat, FcγRIIB
( 11 ). Karena domain ekstraselular dari FcγRIIA dan FcγRIIB sangat homolog, kami mengukur tingkat
ekspresi mRNA dari FcγRIIA dan FcγRIIB pada monosit diurutkan secara independen, dengan PCR
kuantitatif, menggunakan primer spesifik untuk domain intraseluler FcγRs ini. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa FcγRIIA / IIB rasio ekspresi mRNA secara signifikan lebih tinggi dalam H. pylori-
positif daripada H. pylori-negatif pasien sebelum pengobatan (Gambar 4 A). Dalam H. pylori-positif
responden, yang FcγRIIA / IIB rasio secara bermakna menurun pada 1 dan 12 minggu, tetapi
perubahan ini tidak diamati di H. pylori-positif nonresponders atau di H. pylori-negatif pasien
(Gambar 4 B). Ketika ekspresi protein pada monosit FcγRIIB diperiksa oleh flow cytometry
menggunakan MABs spesifik ke domain intraseluler dari molekul ini, ekspresi FcγRIIB meningkat di
12 minggu di perwakilan H. pylori-positif responden tetapi tidak dalam nonresponder (Gambar 4 C).
Akibatnya, ekspresi FcγRIIB nyata upregulated di 12 minggu di H. pylori-positif responden, tetapi
perubahan ini tidak diamati di H. pylori-positif nonresponders atau di H. pylori-negatif pasien
(Gambar 4 D). Temuan ini menunjukkan bahwa perubahan dalam keseimbangan FcγR menuju
FcγRIIB hambat, bersama-sama dengan kapasitas fagositik berkurang dari monosit, adalah peristiwa
pertama yang terjadi sebagai akibat dari H. pylori pemberantasan di responden.

Gambar 4

Perubahan tingkat ekspresi FcγRIIB yang bersirkulasi monosit dari pasien ITP sebelum dan setelah
inisiasi dari H. pemberantasan pylori. (A) FcγRIIA / IIB ekspresi mRNA rasio pada monosit sebelum
pengobatan ditentukan oleh TaqMan PCR kuantitatif pada 11 pasien ITP terinfeksi H. pylori dan 5
pasien terinfeksi ITP. Perbedaan antara 2 kelompok dianalisis dengan menggunakan uji U-Mann
Whitney. (B) FcγRIIA / IIB ekspresi rasio pada monosit adalah serial diukur sebelum perlakuan dan
pada 1 dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. rejimen pylori pemberantasan di 6 H. pylori-positif ITP
responden, 5 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 5 H. pylori-negatif ITP nonresponders. Hasil
akan ditampilkan sebagai SD + berarti. Perubahan nilai pada 1 dan 12 minggu dari nilai awal diambil
di wk 0 dinilai dengan uji t berpasangan. ** P <0,01 dibandingkan dengan pra-perawatan. Perwakilan
RT-PCR hasil untuk ekspresi FcγRIIA, FcγRIIB, dan GAPDH ditampilkan untuk setiap kelompok pasien.
(C) Ekspresi protein FcγRIIB pada monosit sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah inisiasi dari H.
rejimen pylori pemberantasan di perwakilan H. pylori-positif responden dan nonresponder. Buka
histogram menunjukkan sel-sel diwarnai dengan pencocokan isotipe kontrol Ab, dan menutup
histogram menunjukkan sel-FcγRIIB anti MAB-diobati. (D) Ekspresi tingkat FcγRIIB pada monosit
diukur sebelum perlakuan dan 12 minggu setelah inisiasi dari H. rejimen pemberantasan pylori
dalam 5 H. pylori-positif ITP responden, 4 H. pylori-positif ITP nonresponders, dan 3 H. pylori-negatif
ITP nonresponders.

Kami diteliti lebih lanjut peran potensial dalam mengatur keseimbangan Th1/Th2 profil ekspresi FcγR
pada monosit dalam hubungannya dengan H. pylori infeksi ( 11 ), tapi tidak ada perubahan
substansial dalam rasio IFN-γ CD4 + T + sel untuk IL-4 + sel T CD4 + dalam sirkulasi sebelum
perlakuan dan 12 minggu setelah memulai rejimen pemberantasan dalam H . pylori-positif
responden (2,6 ± 1,3 dan 2,7 ± 1,3, masing-masing), H. pylori-positif nonresponders (3,1 ± 0,6 dan
3,7 ± 1.0, masing-masing), atau H. pylori-negatif pasien (3,4 ± 1,1 dan 3,5 ± 1,5, masing-masing).

Parameter yang memprediksi respons platelet untuk pemberantasan H. pylori. Untuk menguji
parameter yang memprediksi respons platelet untuk menghapuskan H. pylori pada pasien ITP,
karakteristik pasien, kekebalan dan parameter omset trombosit tercantum pada Gambar 1 , serta
IgG anti-CagA tingkat Ab dan FcγRIIA / IIB rasio ekspresi mRNA di monosit di pretreatment
dibandingkan antara H. pylori terinfeksi responden dan nonresponders. Ekspresi FcγRII level pada
monosit secara signifikan lebih rendah pada responden daripada di nonresponders (17,2 ± 4,8 23,4 ±
8,2 versus LKM, P = 0,03). Selain itu, kapasitas fagositosis dan / FcγRIIA rasio ekspresi IIB dari
monosit secara signifikan lebih tinggi pada responden daripada di nonresponders (2,8 ± 1,5 vs 1,3 ±
0,3, 0,02 = P; dan 1,7 ± 0,6 vs 1,1 ± 0,4, P = 0,04 ).

Fenotipik dan sifat fungsional monosit sebelum dan sesudah pemberantasan H. pylori dalam mata
pelajaran non-ITP. Untuk mengevaluasi apakah perubahan dan fungsional sifat fenotipik beredar
monosit setelah pemberantasan H. pylori yang khusus untuk pasien ITP, 9-trombositopenik relawan
non terinfeksi H. pylori diobati dengan regimen standar pemberantasan. Pemberantasan berhasil
dalam 7 mata pelajaran, tetapi tidak dalam 2. Seperti yang diharapkan, tidak ada perubahan
substansial dalam jumlah trombosit selama periode observasi dalam berbagai subjek. Dalam
monosit dari individu diperlakukan berhasil, ada kecenderungan terhadap ekspresi FcγRI
downregulated dan kapasitas fagositosis dan menuju upregulated FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB)
ekspresi 12 minggu setelah pemberantasan, seperti diamati dalam H. ITP terinfeksi pylori responden,
tetapi perubahan-perubahan ini secara statistik tidak signifikan (Gambar 5 ). Kurangnya penting
tampaknya karena tanggapan sangat bervariasi di antara individu. Perlu dicatat bahwa subyek
dengan fenotipe monosit diaktifkan, yaitu, tinggi FcγRI ekspresi, ekspresi FcγRII rendah, dan
kapasitas fagositosis ditingkatkan, di pretreatment lebih cenderung untuk merespon dengan
perbaikan kondisi atas pemberantasan H. pylori.

Gambar 5

Serial pengukuran fenotipe beredar monosit dan anti-CagA tingkat Ab sebelum dan setelah inisiasi
dari H. pemberantasan pylori rejimen di 9-ITP individu yang tidak terinfeksi H. pylori menurut hasil
rejimen tersebut. tingkat Ekspresi FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), dan CD86, non-spesifik
fagositosis monosit sirkulasi, dan anti-CagA tingkat Ab diukur sebelum perlakuan dan 12 minggu
setelah inisiasi dari H. pylori pemberantasan rejimen. Ekspresi FcγRII telah diteliti dengan
menggunakan klon MAB FLI8.26, yang bereaksi dengan baik FcγRIIA dan FcγRIIB. Hasil untuk 7 orang
di mana H. pylori berhasil diberantas dan untuk 2 individu dalam pemberantasan yang gagal
disajikan terpisah. Sebuah garis putus-putus menunjukkan cut off untuk anti-CagA Abs (7,5 U).
fenotipe FcγR pada monosit / makrofag dalam pylori yang terinfeksi dan tidak terinfeksi H. tikus.
Kami siap 4 kelompok tikus (n = 5 dalam setiap kelompok): H. pylori terinfeksi tikus, tikus yang tidak
terinfeksi, H. pylori terinfeksi tikus yang telah menerima terapi eradikasi, dan tikus yang tidak
terinfeksi yang menerima pengobatan eradikasi. Pada tikus, hanya ada satu FcγRII, yang sesuai
dengan FcγRIIB manusia. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3 , ekspresi FcγRII diukur dengan
menggunakan klon 2.4G2 MAB pada monosit / makrofag berasal dari darah tepi, sumsum tulang,
dan limpa secara signifikan lebih rendah pada tikus yang terinfeksi dengan H. pylori dari pada tikus
yang tidak terinfeksi, sedangkan ekspresi FcγRI cenderung lebih tinggi pada tikus yang terinfeksi
dengan H. pylori (P <0,1). Baik tikus terinfeksi dan tidak terinfeksi diberi triple H. rejimen pylori
pemberantasan, dan pemberantasan sukses telah dikonfirmasi di semua tikus yang terinfeksi oleh
budaya bakteri perut pukul 6 minggu. Dalam monosit / makrofag berasal dari darah tepi, sumsum
tulang, dan limpa dari H. -Diberantas tikus pylori, ekspresi FcγRII itu upregulated dan ekspresi FcγRI
adalah downregulated setelah penghapusan. Sejak MAB klon 2.4G2 lintas bereaksi dengan FcγRIII,
sampel darah perifer diperiksa lebih lanjut menggunakan MAB yang spesifik untuk FcγRII (Ly17.2
clone) ( 12 ). Tingkat ekspresi FcγRII kembali secara signifikan lebih rendah di H. Pylori tikus yang
terinfeksi dibandingkan dengan-tikus diperlakukan mengejek (3,2 ± 0,4 vs 3,9 ± 0,2 LKM, P = 0,01).
Dalam H. Tikus yang terinfeksi pylori, tingkat ekspresi FcγRII meningkat setelah terapi eradikasi (3,2 ±
0,4 vs 3,9 ± 0,3 LKM, P = 0,02).

Tabel 3

Ekspresi tingkat FcγRI dan FcγRII pada monosit / makrofag pada tikus yang tidak terinfeksi dan tikus
terinfeksi H. pylori setelah rejimen pemberantasan

Diskusi

Dalam analisis komprehensif, kami menunjukkan bahwa pemulihan platelet diamati pada subset H.
ITP terinfeksi pylori pasien setelah H. pemberantasan pylori ini mungkin dimediasi melalui
perubahan saldo FcγR pada monosit / makrofag. Tingkat ekspresi FcγRII pada monosit pertama kali
diidentifikasi sebagai salah satu faktor yang terkait dengan H. infeksi pylori pada pasien ITP oleh
aliran cytometric analisis menggunakan MAB yang bereaksi dengan kedua FcγRIIA dan FcγRIIB, tetapi
hubungan ini kemudian terbukti terutama disebabkan FcγRIIB hambat berdasarkan tes yang berbeda
2: PCR kuantitatif untuk penilaian ekspresi mRNA dan analisis aliran cytometric menggunakan MAB
yang spesifik ke domain intraseluler dari FcγRIIB. Sifat fungsional monosit / makrofag, termasuk
fagositosis dan presentasi antigen, dikendalikan oleh keseimbangan antara FcγRs mengaktifkan dan
reseptor hambat, FcγRIIB ( 13 ). Beredar monosit dari H. pylori ITP pasien yang terinfeksi
menunjukkan suatu fenotipe diaktifkan dengan kapasitas fagositik ditingkatkan, yang berpotensi
menghasilkan dari FcγRIIB downregulated, dan fenotipe ini kembali ke H. pylori tidak terinfeksi ITP
pasien setelah pemberantasan H. pylori, tetapi hanya di responden. Selain itu, perubahan fenotipe
monosit didahului perbaikan dalam parameter kinetik autoimun dan platelet. Oleh karena itu, H.
pylori infeksi memainkan peran penting dalam patogenesis ITP dengan mengubah keseimbangan
FcγR dari monosit / makrofag mendukung mengaktifkan FcγRs, melalui downregulation dari FcγRIIB
hambat reseptor.

Studi baru-baru ini kami di T sel yang autoreactive untuk GPIIb / IIIA pada pasien ITP mengungkapkan
bahwa proses patogenik dari ITP dapat dijelaskan oleh loop terus menerus di mana sel-sel B
memproduksi IgG autoantibodies anti-trombosit, makrofag dalam sistem retikuloendotelial (RES)
phagocytose opsonized platelet melalui FcγRs dan / GPIIb hadir berasal antigen peptida-IIIA, dan
GPIIb / IIIA-reaktif sel T diaktivasi dan mengerahkan aktivitas pembantu mereka ( 14 , 15 ). Telah
terbukti bahwa anti-GPIIb/IIIa Abs pada pasien ITP adalah dominan dari IgG1 subclass ( 16 ), yang
memiliki afinitas tertinggi untuk FcγRII ( 13 ). Jadi, FcγRs disajikan pada makrofag dalam RES
tampaknya memainkan peran sentral dalam 2 aspek dari proses patogenik: penghancuran trombosit
dan tanggapan autoimun berkelanjutan terhadap antigen platelet. Hal ini masih diperdebatkan yang
FcγR mengaktifkan didominasi terlibat dalam patogenesis ITP ( 17 ), tetapi peningkatan ekspresi
relatif FcγRIIB hambat ke FcγRs mengaktifkan akhirnya bisa mengakibatkan redaman dari loop terus
menerus patogen. Oleh karena itu, pemulihan platelet dimediasi melalui ekspresi FcγRIIB
upregulated pada monosit setelah pemberantasan H. pylori pada pasien ITP melibatkan 2 langkah
akibat: peningkatan platelet cepat diamati pada 1 minggu adalah hasil dari blokade clearance
trombosit oleh makrofag dalam RES, sedangkan peningkatan berkelanjutan platelet hasil dari
penindasan presentasi antigen oleh makrofag dan inhibisi berikutnya T dan tanggapan sel B untuk
antigen platelet. Untuk menilai peran H. pylori infeksi pada clearance platelet, sangat menarik untuk
mengevaluasi apakah H. infeksi pylori meningkatkan penghancuran trombosit pada tikus
diperlakukan dengan platelet-depleting MABs. Efek penekan yang sama terhadap ekspresi FcγRIIB
pada makrofag dilaporkan untuk imunoglobulin intravena (IVIG). Samuelsson et al. menunjukkan
bahwa IVIG memerlukan kehadiran FcγRIIB untuk mencegah trombositopenia dalam model murin
dari ITP pasif ( 18 ). Dalam model ini, FcγRIIB ekspresi pada makrofag adalah upregulated atas
perlakuan IVIG.

Patogenesis ITP dalam asosiasi dengan H. pylori infeksi yang paling mungkin multifaktorial.
Mekanisme kami tidak mengesampingkan mekanisme lain yang diusulkan untuk pemulihan
trombosit setelah pemberantasan H. pylori di ITP, seperti mimikri molekuler antara CagA dan
antigen permukaan platelet ( 7 ). Selain itu, telah menunjukkan bahwa beberapa strain H. pylori
menginduksi agregasi platelet yang tergantung pada faktor von Willebrand dan IgG Abs khusus
untuk H. pylori berinteraksi dengan reseptor yang berhubungan GPIB dan FcγRIIA pada platelet
( 19 ). Dalam model ini, Abs khusus untuk H. pylori mampu opsonizing platelet melalui mengikat H.
pylori, von Willebrand faktor, dan GPIB, sebagai anti-platelet autoantibodies. Jadi, penurunan H. Ab
spesifik pylori tingkat setelah terapi eradikasi juga dapat menekan penyajian antigen trombosit oleh
makrofag. Ini-dimediasi mekanisme Ab tampaknya berperan dalam fase pemulihan platelet
kemudian setelah H. pemberantasan pylori, karena perubahan fenotipe monosit didahului perbaikan
dalam tanggapan Ab untuk GPIIb / IIIA dan CagA.

Platelet pemulihan setelah pemberantasan H. pylori diteliti hanya dalam subkelompok H. ITP
terinfeksi pylori pasien ( 3 , 4 ). Hasil penelitian kami di sini menunjukkan bahwa ITP pasien dengan
fenotipe monosit diaktifkan, seperti kapasitas fagositik ditingkatkan dan mengurangi ekspresi
FcγRIIB, cenderung menanggapi H. pylori pemberantasan, menunjukkan bahwa diaktifkan monosit /
makrofag fenotipe berkontribusi mendorong loop patogen yang menjaga kondisi autoimun platelet-
anti di responden tersebut. Temuan ini penting secara klinis, karena suatu fenotipe monosit
diaktifkan dapat memprediksi pemulihan platelet setelah pemberantasan H. pylori pada pasien ITP.
Status aktivasi monosit yang beredar juga heterogen di ITP-individu yang tidak terinfeksi H. pylori,
dan mata pelajaran dengan fenotipe monosit diaktifkan yang responsif terhadap H. pemberantasan
pylori, yang mengubah keseimbangan FcγR. Jadi, apakah H. pylori infeksi mengaktifkan host monosit
pada / makrofag berbeda antara individu terlepas dari ada tidaknya ITP. Ada keragaman besar dalam
kemanjuran H. pemberantasan pylori terapi pada pasien ITP antara kelompok-kelompok etnis.
Kohort dari Jepang dan laporan tingkat respons Italia sebesar 39% -100%, sedangkan yang berasal
dari Spanyol dan Amerika Serikat dokumen sedikit atau tidak ada tanggapan platelet ( 20 ). Alasan
untuk variabilitas tersebut antara negara-negara tidak jelas, tetapi hal ini dapat dijelaskan oleh
perbedaan dalam epidemi H. pylori strain atau latar belakang genetik di antara populasi. Dalam hal
ini, H. genotipe pylori berbeda antara strain Asia Timur dan tekanan Eropa ( 21 ). Selain itu, faktor
genetik yang mengatur ekspresi FcγRs mungkin akan menyebabkan perbedaan ini. Beberapa
polimorfisme ada dalam gen FcγR manusia yang menunjukkan mengubah afinitas untuk IgG,
berpotensi menghasilkan tingkat clearance tertentu tergantung alel-kompleks kekebalan ( 22 ).
Secara khusus, satu SNP dalam gen FcγRIIB reseptornya mengubah sinyal ( 23 , 24 ) dan memprediksi
perkembangan penyakit kronis pada anak-anak dengan ITP akut ( 25 ). Polimorfisme lain di daerah
promotor gen FcγRIIB downregulates kegiatan transkripsional nya ( 26 ).

Potensi bias seleksi pasien merupakan salah satu keterbatasan penelitian ini. Karena rumah sakit
kami adalah pusat rujukan, banyak pasien penyakit telah durasi relatif lama dan telah diobati dengan
prednisolone dan / atau splenektomi. Selain itu, pasien kami adalah subset yang relatif ringan,
karena kita tidak termasuk pasien dengan perdarahan aktif untuk mengurangi putus sekolah selama
masa studi. Kita harus mempertimbangkan potensi bias interpretasi atas hasil, tapi tidak ada
perbedaan jelas dalam karakteristik pasien antara H. pylori terinfeksi responden dan nonresponders.
Selain itu, frekuensi tinggi pasien splenectomized di H. -Kelompok pylori negatif dapat
mempengaruhi dan fungsional sifat fenotipik beredar monosit, meskipun tidak ada perbedaan yang
jelas di tingkat ekspresi FcγR dan kapasitas fagositosis dari monosit antara-negatif H. pylori ITP
pasien tanpa sejarah mereka splenektomi (data tidak ditampilkan). Keterbatasan lain adalah
penggunaan darah perifer monosit bukan makrofag dalam RES dalam analisis. Namun, pada tikus, H.
infeksi pylori mengubah keseimbangan FcγR sama dalam monosit / makrofag berasal dari darah tepi,
sumsum tulang, dan limpa, menyatakan bahwa monosit beredar berpotensi mewakili seluruh
monosit / sistem makrofag.

Modulasi dari saldo FcγR monosit yang terkait dengan H. pylori infeksi terdeteksi di ITP dan non-ITP
individu serta pada tikus, menunjukkan bahwa respons ini mungkin menjadi tuan rumah normal
respon imun terhadap mikroorganisme yang membentuk infeksi kronis yang berlangsung beberapa
dekade. Diketahui bahwa H. pylori colonizes lapisan mukosa lambung dan tidak menginvasi epitel
lambung, tapi H. pylori menyebabkan infeksi sistemik dan respons lokal melalui stimulasi sistem
kekebalan tubuh adaptif dan bawaan ( 27 ). Peristiwa molekul yang menginduksi perubahan sifat-
sifat monosit / makrofag masih tetap tidak jelas. Kami gagal untuk menunjukkan peran yang terkait
dengan respon Th1 H. pylori infeksi pada perubahan fenotipe monosit. Di sisi lain, dilaporkan bahwa
komponen H. pylori dilepaskan dan bertanggung jawab untuk aktivasi sel dendritik dan makrofag
melalui reseptor tol seperti signaling ( 28 , 29 ). Dalam hal ini, frekuensi tinggi dari beberapa H.
spesifik genotipe pylori dilaporkan pada pasien ITP dibandingkan dengan subyek non-ITP ( 5 ),
menunjukkan potensi peran bakteri's struktur dan profil virulensi pada patogenesis ITP.

Penelitian sebelumnya menunjukkan hubungan sebab akibat antara infeksi dan penyakit autoimun,
seperti infeksi usus oleh Campylobacter dan Guillian-Barré syndrome jejuni. Dalam hal ini, Abs lintas
bereaksi dengan lipooligosaccharides hadir dalam C. jejuni dan di ganglioside GM1 bertanggung
jawab untuk pengembangan ini penyakit ( 30 ). Di sisi lain, pada pasien ITP, H. ditingkatkan
imunogenisitas pylori infeksi khusus autoantigens platelet sekunder untuk FcγR keseimbangan
berubah-dimediasi infeksi makrofag. Mekanisme serupa ditunjukkan pada model binatang untuk
Coxsackie virus B4-induced diabetes tipe I ( 31 ), di mana virus ini diperkirakan untuk bertindak
dengan meningkatkan imunogenisitas dari autoantigens sekunder untuk peradangan lokal. Selain
itu, infeksi juga dapat melindungi dari penyakit autoimun. Onset diabetes tipe I dihambat oleh
infeksi parasit cacing pada model hewan ( 32 ). Sebuah terbaru acak, double-blind, terkontrol
plasebo menunjukkan peningkatan kolitis ulserativa aktif oleh infeksi Trichuris suis ( 33 ). Pengaruh
agen infeksi pada patogenesis autoimmunity tampak variabel antara penyakit, dan mekanisme yang
mendasari adalah beberapa dan kompleks, mungkin berbeda sesuai dengan patogen.

Singkatnya, H. pylori infeksi memainkan peran penting dalam patogenesis ITP dengan mengubah
keseimbangan FcγR dari monosit / makrofag mendukung mengaktifkan FcγRs, melalui
downregulation dari FcγRIIB. Keberhasilan dan profil keamanan H. pylori pemberantasan membuat
rejimen pilihan yang menarik, namun diindikasikan hanya untuk H. pylori terinfeksi pasien dalam
kelompok-kelompok etnis tertentu. Mekanisme yang mendorong pemulihan setelah H. platelet
pemberantasan pylori dilaporkan di sini menunjukkan bahwa saldo FcγR pada monosit / makrofag
dapat menjadi sasaran terapi yang wajar untuk ITP. Dalam hal ini, molekul kecil yang menghambat
sinyal hilir mengaktifkan FcγR dapat memiliki efek menguntungkan pada pasien ITP ( 34 ). penelitian
lebih lanjut untuk mengevaluasi seberapa H. pylori infeksi memodulasi monosit / makrofag fungsi
mungkin berguna untuk memahami patogenesis ITP dan untuk mengembangkan strategi terapeutik
baru untuk ITP.

Metode

Pasien dan kontrol itu. Ini pusat-tunggal, open-label, studi prospektif yang melibatkan 34 pasien
berturut-turut dengan ITP. Diagnosis ITP didasarkan pada trombositopenia bertahan lebih lama dari
6 mo, normal atau meningkat sumsum tulang megakaryocytes tanpa bukti morfologi dari displasia,
dan tidak ada penyakit kekebalan atau non-imun sekunder yang dapat menjelaskan keadaan
trombositopenik ( 35 ). Semua pasien yang dirujuk ke Rumah Sakit Universitas Keio, Tokyo, Jepang,
dan telah diobati selama sedikitnya 6 mo. jumlah trombosit yang <100 × 10 9 / l selama mo 3
sebelumnya. Kriteria eksklusi meliputi usia (<18 th), perdarahan aktif, kehamilan atau menyusui,
sejarah efek samping potensial terkait dengan penisilin, pengobatan saat ini atau sebelumnya
dengan penghambat pompa proton, atau penyakit yang melemahkan lainnya (misalnya, kanker).
Sembilan relawan sehat terinfeksi H. pylori menjabat sebagai subjek kontrol. Protokol studi sesuai
dengan prinsip-prinsip etis dari Asosiasi Kedokteran Dunia Deklarasi Helsinki sebagaimana tercermin
dalam persetujuan priori dari Universitas Keio Review Kelembagaan Dewan, dan informed consent
tertulis diperoleh dari masing-masing peserta.

Penilaian infeksi H. pylori. Untuk mengevaluasi H. infeksi pylori, kami melakukan uji urea 13 C napas
menggunakan tablet Ubit (Otsuka Assay), IgG serum dianalisis H. -Spesifik Abs pylori menggunakan
tersedia kit komersial (Kyowa Medex Perusahaan), dan dianalisis H. pylori antigen dalam sampel
feses menggunakan ImmunoCard STAT! HpSA (Meridian Bioscience Inc), pada semua pasien ( 36 ).
Pasien positif untuk tes napas urea ditambah setidaknya satu tes tambahan dianggap sebagai H.
pylori positif, sedangkan yang negatif untuk semua 3 tes dianggap H. pylori negatif. Untuk
meminimalkan hasil negatif palsu, pasien tidak menerima antasida atau antibiotik selama minimal 2
minggu sebelum tes. Keberhasilan pemberantasan didefinisikan sebagai hasil negatif untuk tes napas
urea 12 minggu setelah regimen eradikasi.

H. pylori dan rejimen pemberantasan tindak lanjut. Semua pasien dan kontrol diberikan amoksisilin
(750 mg dua kali sehari), klaritromisin (400 mg dua kali sehari), dan lansoprazole (30 mg dua kali
sehari) selama 7 d terlepas dari mereka H. pylori status infeksi dan kemudian diikuti untuk 24 minggu
berikutnya. Para pasien itu diizinkan untuk melanjutkan terapi lain mereka selama masa studi,
memberikan dosis obat yang dipertahankan pada tingkat yang konstan sampai studi selesai, kecuali
untuk prednisolone, yang dapat diturunkan atau dihentikan. Sebuah respon terapi didefinisikan
sebagai jumlah platelet lebih tinggi dari 50 × 10 / l 9 dan dua kali lipat dari baseline pada 24 minggu
setelah memulai regimen eradikasi.

Cell persiapan sampel. Darah perifer Heparinized diperoleh dari semua mata pelajaran pada 0 (-
perawatan pra), 12, dan 24 minggu, dan dari beberapa pasien pada 1 minggu, setelah memulai
regimen eradikasi. Setelah plasma platelet-kaya terisolasi, komponen sel residu tersebut dikenakan
Lymphoprep (Nycomed Pharma AS) kepadatan gradien sentrifugasi untuk mengisolasi PBMCs.
PBMCs baru diisolasi di resuspended di RPMI 1640 mengandung dilemahkan FBS% panas-10, 2 mmol
/ l-glutamin, 50 U / ml penisilin, dan 50 ug / ml streptomisin dan segera digunakan dalam percobaan
berikut. plasma trombosit-miskin diisolasi dari plasma platelet-kaya dengan sentrifugasi.

Evaluasi respon Ab anti-GPIIb/IIIa. Sel B memproduksi IgG Abs anti-GPIIb/IIIa terdeteksi

menggunakan linked immunospot uji-enzim, sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya ( 37 ). Setiap
percobaan dilakukan dalam 5 sumur independen, dan hasilnya merupakan mean dari 5 nilai.
Frekuensi beredar anti-GPIIb/IIIa Ab-sel B memproduksi dihitung sebagai nomor per 10 5 PBMCs,
dan nilai-off memotong 2,0 didefinisikan sebagai sel. Abs anti-GPIIb/IIIa IgG di eluat platelet (dari 5 ×
10 7 platelet) diukur dengan ELISA menggunakan dimurnikan GPIIb manusia / IIIA sebagai antigen
( 38 ). Ab unit dihitung dari densitas optik di 450 nm (OD 450) hasil, berdasarkan kurva standar yang
diperoleh dari konsentrasi plasma serial titer IgG dikumpulkan dengan anti-GPIIb/IIIa-Abs tinggi.
Semua sampel diperiksa dalam rangkap dua, dan hasilnya dihitung sebagai mean dari 2 nilai. The cut
off untuk Abs anti-GPIIb/IIIa platelet-terkait adalah 3,3 U.

Evaluasi respon sel T GPIIb / IIIA (. Antigenik Spesifisitas T sel ditentukan oleh sel T antigen-induced
proliferasi sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya 39 ). Secara singkat, PBMCs dikultur dalam
kehadiran atau tidak adanya antigen selama 7 d. Setelah inkubasi 16-jam akhir dengan 0,5 μCi / baik
timidin H-3, sel dipanen, dan penggabungan timidin H-3 ditentukan dalam microplate sintilasi
TopCount counter (Packard). Antigen yang digunakan adalah tripsin-dicerna GPIIb / IIIA, PBS mock-
diperlakukan, dan toksoid tetanus (Daftar Laboratorium Biologi) yang digunakan pada konsentrasi 5
ug / ml. Semua budaya disusun rangkap tiga, dan semua nilai rata-rata merupakan penentuan
rangkap tiga. T antigen-spesifik respons sel dinyatakan sebagai indeks stimulasi, yang dihitung
sebagai cpm dimasukkan ke dalam budaya dengan dicerna tripsin-GPIIb / IIIA atau tetanus toksoid
dibagi dengan cpm dimasukkan ke dalam budaya dengan perawatan pura-pura dengan PBS.

Evaluasi omset platelet. Reticulated platelet terdeteksi oleh pewarnaan terisolasi platelet segar
dengan jeruk tiazol (Retic-COUNT; Becton Dickinson) diikuti oleh analisis aliran cytometric, seperti
yang dijelaskan sebelumnya ( 40 ). The cut off untuk persentase platelet Reticulated adalah 2,0%.
Tingkat TPO plasma diukur dengan menggunakan kit ELISA tersedia secara komersial (Quantikine; R
& D Systems) menurut protokol produsen.
Evaluasi dan fungsional sifat fenotipik beredar monosit. Tidak tetap PBMCs diwarnai dengan-
terkonjugasi anti-FcγRI/CD64 FITC (clone 10.1), anti-FcγRII/CD32 (clone FLI8.26), anti-FcγRIII/CD16
(clone 3G8) ( BD Biosciences), atau anti-CD86 MABs (BU63 clone; Ancell), dalam kombinasi dengan
PC5-konjugasi anti-CD14 MAB (RMO52 klon; Beckman Coulter). Untuk FcγRIIB menodai, sel-sel yang
tetap dan permeabilized menggunakan buffer yang mengandung paraformaldehyde dan saponin (BD
Biosciences) dan kemudian diwarnai dengan MABs ke bagian C-terminal FcγRIIB (EP888Y clone;
Epitomics), diikuti oleh inkubasi dengan FITC-label anti- kelinci IgG F (ab ') 2 (Beckman Coulter) dan
PC5-konjugasi anti-CD14 MAB. Sel kontrol negatif diinkubasi dengan neon-label isotipe pencocokan
MABs mouse melawan antigen tidak relevan. Sel dianalisis pada aliran cytometer FACSCalibur (BD
Biosciences) dengan menggunakan perangkat lunak CellQuest. sel yang layak dipilih oleh
pengecualian sel apoptosis diwarnai dengan iodida propidium (Sigma-Aldrich). tingkat ekspresi
relatif FcγRI, FcγRII (FcγRIIA ditambah FcγRIIB), FcγRIIB, FcγRIII, dan CD86 pada gated + CD14 monosit
yang dinyatakan sebagai LKM, yang dihitung berdasarkan intensitas sel diinkubasi dengan
pencocokan kontrol MAB isotipe sesuai sebagai referensi . Proporsi sel positif bagi FcγRIII di + CD14
monosit juga ditentukan. Setiap uji termasuk sampel kontrol kualitas PBMC berasal dari donor sehat
tunggal, yang telah disimpan dalam aliquots pada -80 ° C. Kapasitas fagositik spesifik dari monosit
diperiksa seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 41 ). Dalam singkat, PBMCs dikultur dengan netral-
dekstran FITC dengan berat molekul 2.000 kDa (Sigma-Aldrich) selama 30 menit pada 0 ° C atau 37 °
C dan dianalisis pada cytometer aliran. Penyerapan FITC-label dekstran dievaluasi oleh LKM pada
gated + CD14 monosit. Kapasitas fagositik dinyatakan sebagai rasio LKM, yang dihitung sebagai LKM
yang diperoleh pada suhu 37 ° C dibagi dengan LKM pada 0 ° C. pengaturan yang konsisten untuk
sensitivitas detektor, kompensasi, dan gating menyebarkan digunakan dalam analisis dari semua
sampel.

keseimbangan Th1/Th2. Proporsi-sel IFN γ + dan + IL-4 sel dalam darah perifer CD4 + sel T dievaluasi
menggunakan aliran cytometry berbasis intraselular sitokin Staining Kit Manusia (BD Biosciences)
menurut produsen protokol. Hasilnya dinyatakan sebagai rasio IFN-γ CD4 + T + sel untuk IL-4 + sel T
CD4 +.

Anti-CagA Abs Abs. Anti-CagA dari isotipe IgG diukur dalam rangkap pada sampel plasma
menggunakan ELISA kit yang tersedia secara komersial (ravo Diagnostika). Cut-off sebesar 7,5 U
berdasarkan informasi dari produsen.

Ekspresi gen FcγRIIA dan FcγRIIB pada CD14 monosit. Beredar + monosit diisolasi dari PBMCs
menggunakan anti-CD14 MAB digabungkan dengan manik-manik magnetik (Miltenyi Biotech) diikuti
oleh MACS pemisahan kolom. cytometric analisis Arus mengungkapkan bahwa fraksi diurutkan
mengandung> 95% CD14 + sel. Total RNA diekstraksi dari monosit menggunakan kit RNeasy
(Qiagen), dan cDNA-untai pertama disintesis dari total RNA menjadi sasaran PCR menggunakan
primer spesifik panel (FcγRIIA: akal primer, 5'-CTGACTGTGCTTTCCGAATG-3 ', dan antisense primer,
5'-TGGATGAGAACAGCGTGTAG-3 '; FcγRIIB: primer akal, 5'-ACAAGCCTCTGGTCAAGGTC-3', dan
antisense primer, 5'-TTCCCTGCACTCAGGGTATC-3 '; dan GAPDH: primer akal, 5'-
TGAACGGGAAGCTCACTGG -3', dan primer antisense, 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '). Produk PCR
diselesaikan dengan elektroforesis pada gel agarosa 2% dan divisualisasikan dengan pewarnaan
etidium bromida. Selain itu, tingkat ekspresi mRNA yang dinilai secara kuantitatif dengan
menggunakan sistem real-time PCR TaqMan (Terapan Biosystems). Sebuah kombinasi dari primer
dan probe khusus untuk FcγRIIA manusia dan FcγRIIB dibeli dari Terapan Biosystems. Tingkat
ekspresi relatif dihitung dari kurva standar yang dihasilkan dengan memetakan jumlah produk PCR
terhadap jumlah input serial PBMC cDNA, dan FcγRIIA / IIB rasio dihitung dari tingkat ekspresi relatif
pada sampel yang sama.

Infeksi dan pemberantasan H. pylori dalam tikus,. Enam-minggu-tua khusus bebas laki-laki tikus-
patogen (C57BL / 6; Sankyo Layanan Lab) diberi makanan iradiasi dan diautoklaf iklan libitum air
suling. Sydney strain H. pylori SS1, yang ditumbuhkan pada suhu 37 ° C dalam kondisi microaerobic,
digunakan untuk inokulasi lisan, seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 42 , 43 ). Suspensi H. pylori (2 ×
10 7 CFU / ml, 15 ml / kg) yang diberikan pada mencit setelah semalam kelaparan, dua kali dengan
interval-wk 2, sedangkan mencit kontrol diberi suspensi larutan buffer sendiri (infeksi pura-pura).
Dua belas minggu kemudian, setengah dari tikus di H. Diinokulasi-kelompok pylori dan kelompok
kontrol dikorbankan untuk diperiksa. Sisanya H. pylori-diinokulasi dan tikus kontrol diperlakukan
dengan H. pengobatan pylori pemberantasan terdiri dari lansoprazole (10 mg / kg), amoksisilin (3 mg
/ kg), dan klaritromisin (30 mg / kg) dibekukan dalam 0,5 karboksimetil% larutan garam natrium
selulosa, sekali sehari selama 2 hari ( 44 ). Enam minggu kemudian, semua mencit dikorbankan
untuk diperiksa. H. infeksi pylori di lambung dipotong dievaluasi dengan kultur bakteri microaerobic,
sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya ( 45 ). mononuklear sel diisolasi dari darah perifer, limpa,
dan sumsum tulang dan disimpan pada -80 ° C, dan semua sampel dikenakan analisis aliran
cytometric pada hari yang sama. Sel diinkubasi dengan MAB CD11b Cy5-label anti-mouse (M1/70
klon; Beckman-Coulter) dalam kombinasi dengan anti-mouse FcγRI biotin-label poliklonal Ab (R & D
Systems) atau tikus MAB reaktif dengan kedua mouse FcγRII ( klon 2.4G2; BD Biosciences -
Pharmingen) dan biotin-label anti-tikus IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc), diikuti
dengan pengobatan dengan FITC-streptavidin (Beckman Coulter). Dalam beberapa kasus, kita
menggunakan mouse untuk spesifik MAB FcγRII (Ly17.2 clone) (Sloan-Kettering Cancer Institute)
dalam kombinasi dengan FITC-label anti-mouse IgG F (ab ') 2. Semua prosedur mouse telah disetujui
oleh Universitas Keio Hewan Komite Penelitian.

Statistik. Semua nilai kontinu ditampilkan sebagai SD ± berarti. Perbandingan untuk menentukan
signifikansi statistik antara 2 kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Fisher's Exact atau Mann-
Whitney U, yang sesuai. Perubahan nilai absolut pada titik-titik waktu yang berbeda dari nilai awal
diambil di minggu ke 0 dibandingkan dengan uji t berpasangan.

Ucapan Terima Kasih

Kami berterima kasih Ulrich Hammerling (Sloan-Kettering Institute) untuk mengkoordinasikan

akuisisi Ly17.2 klon MAB dan Masahiro Kizaki dan Mitsuru Murata untuk merekrut pasien untuk
studi ini. Karya ini didukung oleh dana dari Departemen Pendidikan Jepang, Budaya, Olahraga, Sains
dan Teknologi, hibah penelitian tentang penyakit keras dari Departemen Kesehatan Jepang,
Perburuhan dan Kesejahteraan, dan Nagao Memorial Fund.

Catatan kaki
singkatan tidak standar yang digunakan: CagA, cytotoxin-terkait gen A; FcγRIIB, Fcγ reseptor IIB;
GPIIb / IIIA, glikoprotein IIb / IIIA; ITP, purpura trombositopenia imun; RES, sistem retikuloendotelial;
TPO, thromb