Practica#9 y #10Espectro del DNA y Determinacin del punto de fusin Objetivos -Obtener un espectro de barrido en la regin UV que demuestre

la longitud de onda mxima en la absorcin -Determinar el punto de fusin del DNA mediante un estudio espectrofotomtrico -realizar un perfil de desnaturalizacin trmica del DNA con el fin de determinar su punto de fusin (Tm)

Introduccin

La grfica que representa la medida de A260 en funcin de la temperatura se llama curva de fusin del DNA (Figura inferior). Esta curva presenta las siguientes caractersticas:

1.- La A260 permanece constante hasta temperaturas bien por encima de las fisiolgicas. En este intervalo, la molcula est en forma de doble hebra. 2.- El aumento de A260 tiene lugar en un estrecho rango de temperaturas (6-8 C). La A260 empieza a aumentar cuando comienzan a romperse las uniones entre las bases en varios segmentos de la molcula. El nmero de PB que se rompen aumenta con la temperatura, y con ella la A260. Al final del tramo ascendente, las dos hebras se mantienen juntas por unos cuantos PB. 3.- La A260 mxima es aproximadamente un 37% mayor que el valor inicial, y corresponde al estado en que las dos hebras estn completamente separadas.

Un parmetro muy til para caracterizar la evolucin de la fusin es la temperatura a la que el aumento de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusin (Tm). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C (Figura de la derecha). Como el par de bases G-C est unido por tres puentes de hidrgeno (a diferencia del par A-T que slo presenta 2) se requiere una temperatura ms alta para desnaturalizarlo.

La forma ms corriente de desnaturalizar el DNA es por calentamiento. Otro agente desnaturalizante es el pH elevado porque cambia la carga de algunos grupos que forman parte de los puentes de hidrgeno. En agua destilada (con una fuerza inica muy reducida) se produce la separacin de las hebras. Este fenomeno se debe a que en agua muy pura, la fuerte repulsin entre las cargas negativas de los grupos fosfato no es contrarrestada por los correspondientes contraiones (Na+, Mg+2).

Desarrollo experimental Una muestra del DNA aislado y disuelto en solucin salina, se diluye de tal manera que se obtenga un D.O. entre 0.8 y 1.0. Calentar la solucin en un tubo en un bao maria, tomando las lecturas del espectrofotomentro a 260nm.Se toma como temperatura inicial la ambiente y despus calentar a las temperaturas indicadas en la tabla siguiente.

Temperatura (C) Ambiente 50 55 60 65 70 75 80 85 90

D.O. (260nm)

Resultados Para la determinacin del punto de fusin del DNA tomamos una muestra de DNA comercial (timo de ternera de la marca Fluka) lo disolvimos en una solucin salina y la diluimos de tal manera que se pudiera obtener una D.O entre 0.8 y 1.0.ya obteniendo este D.O. empezamos a calentar la muestra segn la tabla y asi obtuvimos los siguientes resultados:

Temperatura (C) 50 55 60 65 70 75 80 85 90

D.O. (260nm) 0.1522 0.3866 0.4163 0.448 0.502 0.6222 0.7340 0.8022 0.8598 0.86

1 0.9 0.8 0.7 D.O. 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Temperatura

Temperatura de Fusin : 85C Se pudo demostrar como el punto de fusin del DNA esta entre los 85 a 90C donde las cadenas de DNA se separan completamente, esta temperatura de fusin es bastante alta debido a las uniones guanina citosina que hay en la cadena de DNA comercial de timo de ternera que utilizamos.

Cuestionarios Practica 9 Explicar el fundamento de absorcin a 260nm (espectro de absorcin de cada una de las bases nitrogenadas). El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a niv a esa longitud de onda la doble helice absorve la luz UV

Aplicacin de las propiedades de absorcin de energa en UV

La absorcin de radiacin ultravioleta o visible provoca la excitacin de los electrones de enlace y, en consecuencia, los picos de absorcin pueden relacionarse con los tipos de enlace que existen en las especies en estudio. La espectroscopia UV es, por tanto, valiosa para la identificacin de los grupos funcionales de una molcula.

A qu se le conoce como efecto hipercromico?

Cuando se aumenta la temperatura o se disminuye la concentracin salina, la estructura de doble hlice del ADN se separa, a lo que se le llama desnaturalizacin de la molcula de ADN y por lo tanto hay un incremento en la densidad ptica de las bases purnicas y pirimidnicas, a lo que se le llama efecto hipercrmico por desnaturalizacin de los cidos nucleicos.

Practica 10 Breve introduccin sobre la composicin qumica del DNA

El cido desoxirribonucleico (ADN) es un polmero de alto peso molecular formado por dos cadenas o hebras de monmeros llamados nucletidos. Cada nucletido est conformado por molculas ms pequeas: una base nitrogenada (adenina, guanina, citosina o timina), un hidrato de carbono (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Los cuatro tipos de nucletidos difieren solamente en el tipo de base nitrogenada, las cuales pueden ser pricas (adenina o guanina) o pirimdicas (citosina o timina). Se les llama pricas o pirimdicas porque derivan de molculas llamadas purina o pirimidina.

Explicacion sobre la estructura del DNA en procariotas y eucariotas La regin nuclear de una clula procariota difiere significativamente de la de una clula eucariota. el rea nuclear, denominada nucleoide, de una clula bacteriana tiene una nica molcula larga y circular de DNA doble, el cromosoma bacteriano, que contiene todas las informaciones necesarias para el funcionamiento y estructuracin celular. El cromosoma procaritico est ligado a la membrana plasmtica, no contiene histonas, y no se encontra rodeado por una membrana nuclear. Las bacterias pueden contener adems del cromosoma, molculas de DNA doble pequeas y circulares, denominadas plsmidos. Esas molculas son elementos genticos extracromosmicos, no esencialess para la supervivencia bacteriana, y poseen mecanismos independentes de del replicacin DNA cromosmico. La ventaja de poseer un plsmido es que puede contener resistencia genes a de los

antibiticos, tolerancia a los metales txicos, sntesis de enzimas, etc. Estructura B del DNA (Watson y Crick)

Desnaturalizacin del DNA La doble hlice puede desespiralizarse in vitro mediante calor, pH extremos y otras condiciones (urea, ) en un proceso denominado fusin. Se puede calcular su punto de fusion, que es caracterstico y dependiente de la proporcin A/T versus G/C, debido al hecho que hay slo dos puentes de hidrgeno en la unin A/T, y tres en la G/C, unin ms estable. Con la desnaturalizacin, las propiedades fsicas del ADN cambian; por ejemplo, hay un efecto hipercrmico ya que la absorcin de la luz a 260 nm es mayor en el ADN desnaturalizado que en el ADN bicatenario. La abosrcin de la luz tambin vara con la proporcin A/T vs G/C y es mayor en secuencias ricas en A/T que en secuencias ricas en G/C. La desnaturalizacin del ADN es importante porque: 1- permite medir el contenido A/T vs G/C; 2- es la base de las tcnicas de hibridacin Explicar la utilidad de Tm de diferentes organismos (relacionados con diferentes aspectos evolutivos) Segn la rama de la familia de la especie q se encuentra tienen puntos de fusin muy cercanos debido al porcentaje de similitud que tienen las bases nitrogenadas de la especie. Por ejemplo, el punto de fusin del DNA del humano es de 85C y la del chimpanc tambin, esto es debido a que tienen un 98% de DNA igual.

Temperatura de fusin hipercromicidad es posible determinar el tipo de organismos desde el Punto de vista evolutivo conociendo la temperatura de fusin del DNA? Un parmetro muy til para caracterizar la evolucin de la fusin es la temperatura a la que el aumento de la A260 ha llegado a la mitad de su camino. Esta temperatura se llama temperatura de fusin (Tm). Se ha comprobado que la Tm aumenta con el contenido de G+C Como el par de bases G-C est unido por tres puentes de hidrgeno (a diferencia del par A-T que slo presenta 2) se requiere una temperatura ms alta para desnaturalizarlo.

Aplicaciones prcticas del punto de fusin del DNA Entre las aplicaciones prcticas de desnaturalizacin las tcnicas de hibridacin son muy conocidas y utilizadas. La hibridacin consiste en, partiendo de ADN desnaturalizado, renaturalizar con ADN procedente de otro organismo, con lo que es posible estudiar el grado de semejanza entre los ADN ya que solo se produce emparejamiento en los tramos en los que las secuencias sean complementarias. Este mtodo tiene inters en investigaciones policiales, estudios filogenticos, tambin forma parte de las tcnicas de manipulacin del genoma

Bibliografia www.ucm.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.htm www.adn.es/etiqueta/espectro/

Universidad La Salle.
Facultad de Ciencias Qumicas. Laboratorio de Bioqumica del metabolismo.

Prctica 9, 10

Espectro del DNA y Determinacin del punto de fusin

Equipo No. 6 Integrantes. Higuera Gonzlez Catalina Iras. Lpez Casique Hayde Dafne. Solorio G. Diana Lizbeth.

______________________ Dr. Jos D. Mndez

_________ Calificacin