Professional Documents
Culture Documents
Virología
DOCENTE :
ALUMNO :
CICLO :
2007 - I
I. Introducción:
Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante más de
15 años. El cultivo de virus gripal en huevo embrionado fue empleado por
primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrión de pollo es un
medio muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo además un
medio estéril y poco costoso. Ha sido posible cultivar virus de diversos grupos
en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrión en desarrollo.
También se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus,
pues estos animales tienen un periodo de incubación mas prolongado que el
pollo; pero como regla, sigue usándose huevo de gallina de 6 a 8 días de
incubación aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de
incubación).
Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión;
por consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, P. ej. los mixovirus
crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la
parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infección puede producir una lesion
tisular local conocida como pústula, cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico
del virus.
El método exacto de inoculación y la edad del embrión que se emplea,
dependen del virus problema. P. ej. para aislar en forma primaria el virus de la
influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en
la cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica
fácilmente en la membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después
de varias resiembras (“adaptación”) en el amnios. Los focos mas utilizados
para la inoculación, a parte de las cavidades amniótica y alantoidea, son la
membrana corioalantoidea y el saco vitelino. Algunas veces, puede inyectarse
directamente el virus en el embrión en desarrollo, recurriendo a la inoculación
intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplicó el virus
dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a los
líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P.
ej. el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión
y en las células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego
puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los
de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea,
siguen unidos a las células en las lesiones o “pústulas” que se forman sobre
dicha membrana. Al moler y deshacer en una solución salina isotónica las
membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo
puede provocar la muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir
pústulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela,
vacuna), desarrollar hemaglutininas en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej.
influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej. poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por
la técnica de inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de
pústulas contadas con la dilucion viral inoculada.
2
Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es
la inoculación en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o
huevos negativos a anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los
centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5
huevos de 9-11 días de incubación y se incuba a 35-37ºC durante 4-7 días.
Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que
queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el líquido
alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta
actividad de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de
virus A de influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción
negativa deben inocularse al menos en otro lote de huevos.
Entre los lugares de inoculación tenemos:
Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y
la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el
aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la
enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas
fácilmente visibles.
Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la
cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el
endodermo alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis
infecciosa, encefalitis equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis.
Ventaja: simplicidad de la inoculación y toma de muestra
Cavidad Amniótica: Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad
de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad de los mismos depende
fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.
Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la
cantidad de inóculo es de 0.2 – 1 ml. Vía es sumamente adecuada para el
aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades venéreas, neumonía y
rickettsias. El vitelo es empleado para la preparación de vacunas y como
antígeno para reacciones serológicas de los virus ya mencionados.
Vía Intravenosa: La membrana corialantoidea está irrigada por vasos
sanguíneos, es susceptible de inoculación para casos especiales, virus que
ocasionan cambios hematológicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son
empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.02 -
0.05 ml.
Vía Intracerebral (embrión): Se emplea embriones de 8 – 14 días,
específicamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia,
herpes, etc; 0.01 – 0.02 ml.
II. Objetivo:
• Conocer y aplicar correctamente los métodos adecuados para realizar
inoculaciones de virus en embriones aviares.
III. Materiales:
Material Biológico:
IV. Procedimiento:
A. Inoculación:
4
• Otra forma es marcar la cámara de aire a 0.5 cm. de la cámara de aire
hacer un agujero e inocular 0.3 ml. de inóculo con aguja 26 ó 27 de
tuberculina. Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en
posición contraria al embrión e inocular.
IV. Resultados:
5
Estos son ensayos donde no se cuenta el número de partículas
infecciosas presentes en el inóculo, pero en su lugar se obtiene un valor para el
título de ese virus donde la medida está basada en el principio de todo o nada
(hay efecto citopático o no?, está el animal vivo o muerto?). Además esta se
utiliza en virus que sean capaces de matar el 50% de la población de animales.
El título viral es definido como aquella dilución de virus que infecta (o
mata) el 50% de la población inoculada.
En estos análisis para determinar el título viral, se utiliza el método de
Reed y Muench, el cual es relativamente simple, la fórmula que se utiliza es la
siguiente:
Nº Total Total
Dilución
animales
Muertos Vivos Relación %
muertos vivos
10-1 6 5 1 18 1 18/19 95%
10-2 6 5 1 13 2 13/15 87%
10-3 6 4 2 8 4 8/12 67%
10-4 6 3 3 4 7 4/11 36%
10-5 6 1 5 1 12 1/13 8%
10-6 6 0 6 0 18 0/18 0%
6
2) Ahora hacemos el cálculo de la dosis letal 50 (CDL50),
entonces aplicamos fórmula:
CDL50 = 3 + 0.55
CDL50 = 3.55
V. Conclusiones:
VI. Referencias: