Purificacin de cidos Nucleicos Introduccin En las ltimas dcadas se han desarrollado numerosas y potentes tcnicas de Biologa Molecular (PCR,

RT-PCR, PCR en Tiempo Real, Southern Blot, RFLP, secuenciacin...) y todas ellas tienen en comn el paso inicial de la extraccin de los cidos nucleicos. Para la mayora de las tcnicas de Biologa Molecular uno de los factores crticos ms importante es la calidad del cido nucleico de partida, por lo que la eleccin del mtodo de extraccin ms adecuado afecta directamente al xito de la tcnica posterior. Los cidos nucleicos son molculas relativamente estables, aunque hay que evitar el uso de material que pueda llevar nucleasas, por lo que se debe utilizar siempre material certificado libre de DNasas y Rnasas.

Una vez extrado el ADN hay que almacenarlo para evitar que se degrade; si el almacenamiento va a ser por cortos periodos de tiempo, es suficiente mantenerlo a 4C, pero para almacenamiento prolongado hay que mantenerlo a 20C. El ADN sufre hidrlisis cida cuando se almacena en agua, por lo que es recomendable almacenarlo en un tampn con un pH ligeramente alcalino como el TRISEDTA. Para realizar la extraccin de los cidos nucleicos (proceso tambin denominado purificacin o aislamiento), se deben romper las clulas usando diferentes medios qumicos o mecnicos, eliminar las protenas mediante incubacin con una proteinasa, y por ltimo separar los cidos nucleicos del resto de los componentes celulares. Mtodos caseros Hay que tener en cuenta una serie de consideraciones generales: Tipo y volumen/cantidad de muestra a utilizar. En el caso de que la muestra sea sangunea, hay que elegir si usar plasma, suero, sangre total o fraccin leucocitaria. En caso de que se use plasma tambin hay que decidir que tipo de coagulantes usar (EDTA, heparina o citrato), ya que el anticoagulante usado puede afectar mucho a la capacidad del ensayo para detectar la secuencia diana. Cantidades mnimas de sangre total inhiben una PCR tpica. Se puede aadir transferrina bovina junto con su cofactor para evitar la inhibicin que provoca el grupo hemo de la sangre sobre la Taq polimerasa, ya que esta protena se une a este grupo hemo, impidiendo que ste inhiba a la polimerasa. Deben ser determinados empricamente. No existe un protocolo universal para todos los tipos de muestras El mtodo ideal representa un equilibrio entre los requerimientos de la muestra y los del cido nucleico diana. Hay que tener en cuenta que los reactivos que tradicionalmente se emplean en alguna etapa del proceso de extraccin pueden interferir en los posteriores pasos de la tcnica que vamos a utilizar: - Tampn Tris-EDTA (TE): es un inhibidor de nucleasas y un buen tampn para la conservacin del ADN. El EDTA inhibe la PCR a concentraciones superiores a 1mM.

- Fenol: desnaturaliza las protenas contaminantes de la muestra. Se usa para eliminar la protenas (proteasas, nucleasas...); disminuye el rendimiento de la PCR a concentraciones del 0,2% y al 0,5% la inhibe completamente. - Cloroformo: permite la separacin de 2 fases; el ADN queda en la fase acuosa y en la fase orgnica quedan las protenas y otros contaminantes. - Etanol e isopropanol: precipitan los cidos nucleicos. Tienen efectos inhibitorios a concentraciones superiores al 1% - Isotiocianato de guanidinio: es un agente caotrpico (favorece la disolucin en agua de compuestos insolubles) que inhibe las RNasas y conserva el ARN El SDS es un detergente inico que desnaturaliza las protenas pero tambin inhibe la PCR a concentraciones mnimas. Otras sustancias que presentan efectos inhibitorios sobre la PCR son el cloruro sdico, la hemoglobina, la heparina o la urea. Todos los protocolos suelen incluir un paso de lisis con 0,2-1% de SDS, seguido de extraccin con fenol, y la precipitacin con etanol en presencia de acetato sdico. Por lo tanto, todos estos contaminantes deben ser eliminados antes de comenzar con la tcnica de Biologa Molecular propiamente dicha. Los pasos generales del proceso de extraccin son: Lisis: rotura de los tejidos y liberacin de los cidos nucleicos. - Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias, pero muy difcil en el caso de otras bacterias, hongos o determinados tejidos (como plantas). - Generalmente se usan tampones que contienen detergentes para romper la membrana celular y proteasas para digerir las protenas celulares. - La proteinasa K, es la proteasa ms usada por ser la de ms amplio espectro (degrada todas las protenas), se conoce bien su funcionamiento y est muy estudiada y se suele usar con tampones que contienen SDS y EDTA. - El proceso de lisis se puede realizar mediante mtodos fsicos o qumicos: ebullicin en agua destilada o tampn de PCR uso de detergentes con o sin calor uso de hidrxido sdico con calor ciclos de congelacin-descongelacin SDS-proteinasa K sonicacin nitrgeno lquido uso de enzimas como la lisozima Proteccin y estabilizacin de los cidos nucleicos frente a la degradacin (el ARN es ms difcil de estabilizar que el ADN) Eliminacin de protenas e inhibidores de la amplificacin - Para algunas muestras (como esputo o sangre) este proceso requiere ms pasos que para otras (como orina o LCR) - Un mtodo rpido, pero no muy limpio es el denominado "salting-out", en el que se precipitan las protenas y otros contaminantes con elevadas concentraciones de sales (como el acetato amnico) quedando el ADN en disolucin. Concentracin de la muestra en un pequeo volumen Colocacin del cido nucleico en un medio acuoso compatible con el mtodo de amplificacin El mtodo de purificacin de ADN genmico ms ampliamente utilizado es el del fenol cloroformo, que consta de los siguientes pasos: 1. Aadir un volumen igual al de la muestra de la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamlico

(25:24:1) y agitar con vrtex. 2. Centrifugar a temperatura ambiente y transferir la parte acuosa que contiene el cido nucleico a otro tubo 3. Aadir acetato sdico para facilitar la precipitacin con etanol, y despus aadir etanol al 100% fro. 4. Dejar precipitar a 20C durante 30 minutos 5. Centrifugar y eliminar el sobrenadante 6. Lavar con etanol al 70%, para re-precipitar 7. Centrifugar y eliminar el sobrenadante de nuevo 8. Resuspender en tampn TE

Mtodos comerciales Se basan en que todos los tipos de macromolculas biolgicas tienen una caracterstica en comn que va a permitir el desarrollo de un mtodo de separacin especfico para ellas. Estos mtodos son lo suficientemente potentes para permitir el aislamiento de la molcula deseada (el cido nucleico) de entre una mezcla compleja de multicomponentes que hacen las veces de "contaminantes" de nuestro cido nucleico en cuestin. En este sentido, la cromatografa en columna ha demostrado ser una herramienta muy til ya que se dispone de varios mecanismos de separacin. La modificacin de las diferentes fases estacionarias ya existentes, as como el desarrollo de nuevas es la base principal para la obtencin de las condiciones necesarias para la rpida y eficiente separacin de biomolculas. Tecnologas empleadas: 1. Cromatografa de intercambio inico 2. Cromatografa de adsorcin 3. Ultrafiltracin 4. Bolas magnticas 5. Cromatografa de intercambio inico Los primeros kits basados en cromatografa de intercambio inico los desarrollaron hace 25 aos dos empresas alemanas llamadas DIAGEN (DIAgnostic GENetic) y MACHEREY-NAGEL. Y fueron columnas de HPLC desarrolladas para la purificacin de plsmidos llamadas "NUCLEOGEN" y aunque no tuvieron demasiado xito comercial debido a su elevado precio, abrieron

las puertas a una demanda cada vez mayor de kits parecidos, ms baratos y fciles de utilizar.Actualmente es la tecnologa ms utilizada para la separacin de cidos nucleicos. El mecanismo bsico es el intercambio reversible de los iones en solucin con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn (tampn de elucin) ya que los iones del tampn de elucin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico, respectivamente; primero eluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elucin, eluirn las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

Actualmente se utilizan dos tipos de intercambiadores aninicos en los kits comerciales: el metilaminoetanol (MAE) o el dietilaminoetil (DEAE). La unin del ADN (cargado negativamente) depende principalmente del componente estrico de los grupos funcionales y de la afinidad del intercambiador aninico por el respectivo cido nucleico; puesto que el grupo MAE es menos voluminoso y ms hidroflico que el DEAE, la unin de los cidos nucleicos (especialmente las construcciones muy grandes) a los primeros es ms efectiva que a los segundos.

Una modificacin de este mtodo es la extraccin en fase slida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unin de los cidos nucleicos se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado se va incrementando la concentracin de sales en los tampones correspondientes, por lo que las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unin y se obtienen una rpida y eficiente purificacin de los cidos nucleicos (ADN y/o ARN). Al final los cidos nucleicos se eluyen con un tampn de mxima salinidad; por ltimo, se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas y finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampn de baja salinidad para su posterior utilizacin o almacenamiento.

En los kits comerciales disponibles, una vez que la muestra se ha cargado en la columna de intercambio inico, se va lavando con tampones de concentracin salina creciente; dependiendo de la concentracin de sales del tampn de lavado, eluirn unos componentes u otros de la muestra, tal y como se muestra en la figura:

Los componentes eluidos con concentraciones bajas se desechan y solamente se recoge el eluido correspondiente al tampn de mayor concentracin de sales, que es el que contiene el ADN de inters.

Otro elemento a tener en cuenta es el tamao de poro del material al que se une el intercambiador inico, ya que dicho tamao de poro influye directamente en la capacidad de unin. En membranas cuyo tamao de poro es pequeo (menor de 600; figura A) no hay espacio suficiente para unir el intercambiador dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor y, por lo tanto tambin la cantidad de ADN que pueden unir. Sin embargo, en membranas con tamao de poro mayor (mayor de 600; figura B) se puede unir intercambiador dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie y tambin la cantidad de ADN que puede unir la columna:

Figura A. Tamao de poro menor de 600

Figura B. Tamao de poro mayor de 600

Debido a la elevada pureza del ADN obtenido con esta tecnologa, la principal aplicacin de esta cromatografa es la purificacin de ADN plasmdico para transfeccin. Esta tcnica incluye un pretratamiento de la muestra que consiste en una lisis bacteriana en condiciones alcalinas que ocasiona una desnaturalizacin del ADN cromosmico y plasmdico. Antes de la introduccin de la muestra en la columna se trata con acetato potsico, lo que ocasiona que el ADN cromosmico precipite junto con el resto de componentes de la muestra, mientras que el ADN plasmdico se renaturaliza y permanece en disolucin. Cromatografa de adsorcin (membranas de slica gel) Esta tcnica de purificacin se descubri hace unos 30 aos por un investigador llamado Bert Vogelstein, que demostr por primera vez en 1979 la unin del ADN al polvo de vidrio en presencia de yoduro sdico al publicar dos nuevas tcnicas para separar y purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa

Si observamos la estructura molecular del vidrio, vemos que tiene una estructura de tetraedro debida a la composicin de SiO4, que establece puentes de hidrgeno con el agua, por lo que toda la superficie esta recubierta de una capa hidratante, tal y como se muestra en la figura:

Como sabemos, el ADN esta cargado negativamente debido a los grupos fosfato, por lo que tambin esta recubierto por una capa hidratante al establecer de nuevo interacciones con sta por puentes de hidrgeno:

Por lo tanto, estas dos estructuras deberan impedir la interaccin entre ambas molculas (el ADN y el

vidrio o la membrana de slice):

Como es posible entonces que el experimento de Vogelstein funcionara? Gracias a la presencia en el experimento de un componente esencial sin el cual nunca se habra podido producir la reaccin: el yoduro potsico. Este compuesto es una sal caotrpica y este tipo de sales desestabilizan la estructura de las molculas de agua, es decir, la capa hidratante que recubre a las biomolculas, y debido a ello, desnaturaliza las protenas, incrementa la solubilidad de sustancias apolares y destruye las interacciones hidrofbicas. A continuacin se muestra la llamada "serie de Hofmeister" que proporciona una estimacin de la extensin de este efecto en funcin de la sal:

Por lo tanto, las sales caotrpicas atraen las molculas de agua y eliminan la capa hidratante que recubre las diferentes biomolculas, lo cual permite que dichas molculas (membrana de slice y ADN) interacten por medio de diferentes mecanismos, tal y como se muestra en la siguiente figura:

Por lo tanto, el mecanismo de purificacin de estos kits se basa en la adsorcin y desorcin de los cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta estructura ordenada de molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas, mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos nucleicos, liberndolos as de la membrana:

Con esta tecnologa, no se produce ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR, secuenciacin, blotting, clonaje, etc.

La calidad de los cidos nucleicos obtenidos con esta tecnologa es ligeramente inferior a la obtenida mediante cromatografa de intercambio inico. Ultrafiltracin Es una cromatografa por exclusin por tamao en una membrana de un determinado tamao de poro y se suele utilizar para la purificacin de cidos nucleicos despus de la PCR (eliminacin de primers, dNTPs, etc.).

En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos (de tamao superior normalmente a 150pb) permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado opcional para eliminar ms impurezas de la muestra, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn adecuado.

Es una tecnologa que permite fcilmente su automatizacin mediante sistemas robticos:

Bolas magnticas

Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los cidos nucleicos purificados (unidos a las bolas paramagnticas) se eluyen de la solucin que contiene las bolas paramagnticas, bajo condiciones de baja salinidad y quedan listos para ser usados en posteriores aplicaciones.

Un factor importante a tener en cuenta en todos los mtodos de extraccin (ya sean caseros o comerciales) es el volumen de elucin final de la muestra; segn se puede observar en la siguiente grfica, el rendimiento de cido nucleico que se obtiene (cantidad) aumenta cuanto mayor sea el volumen de elucin final de la muestra. Sin embargo, la concentracin del mismo disminuye al aumentar dicho volumen de elucin. Como casi todo en Biologa, normalmente el volumen ptimo suele ser una situacin de compromiso entre ambos factores, de tal forma que se busca obtener el mximo rendimiento con una concentracin adecuada para la aplicacin posterior que se desee hacer; dependiendo de dicha aplicacin posterior, primar ms un factor u otro a la hora de decidir dicho volumen de elucin.

En la actualidad existen numerosos kits comerciales que utilizan cualquiera de las tecnologas comentadas anteriormente para la purificacin de los cidos nucleicos a partir de todo tipo de matrices y especficos para cada uno de ellos (ADN, ARN o ambos conjuntamente).