Proteinin saflatrlmas

bir hcre ekstraktndan, biyolojik aktivite kayb olmakszn proteinin izolasyonu anlamna gelmektedir

Bir proteinin yapsnn ve

zelliklerinin aratrlabilmesi iin, o proteinin saf bir ekilde elde edilmesi gerekir.

 Proteinler kolaylkla

denatre olabildiklerinden ve biyolojik materyallerde (rnein vcut svlarnda ve doku ekstraktlarnda) kompleks bir karm halinde bulunduklarndan, saflatrlmalar olduka zordur.

 Proteinlerin elde edilebildii kaynaklar genellikle dokular

ve hcrelerdir. Bir proteinin saflatrlmasnda yaplacak ilk ilem hcrelerin paralanarak ierdikleri proteini bir zeltiye almaktr. Bu zeltiye ham ekstrakt denir. Bu ham ekstrakt istenen proteinin yan sra pek ok baka protein ve molekl de iermektedir.

 Daha sonra proteinlerin znrlk farklar,

byklkleri, elektriksel ykleri ve polariteleri gibi eitli zelliklerinden yararlanlarak protein ekstrakt fraksiyonlara ayrlr. Bu zelliklere dayanarak proteinlerin saflatrlmas ile ilgili pek ok yntemler kullanlmaktadr.

BR PROTENN NASIL ZOLE EDLECENE, HANG YNTEMLE VE NE DERECE SAFLATIRILACAINA KARAR VERRKEN GZ NNDE BULUNDURULAN KRTERLER

AMA;

MATERYALN VE ALIILACAK

PROTENN TP VE MKTARI; LEMLERN SRES VE MALYET; ELDEK OLANAKLAR

!!!!!!!!!.....
Protein denatrasyonundan ve inaktivasyondan korunmak iin almann her aamasnda pH ve SICAKLIK kontrol altnda tutulmaldr! Scakln olumsuz etkisi, ilemlerin SOUKTA (genelde 4oCda) gerekletirilmesiyle nlenir. pH ise bu molekllerin fizikokimyasal gereksinimleri dorultusunda hazrlanm tampon zeltilerin kullanm ile istenen deerde tutulur.

ZOLASYON NCES LEMLER

- Hcre fraksiyonunun seimi:

sitoplazma, mitokondri, lizozomal, mikrozomal? - Organ tespiti: mitokondri kalp lizozomal /mikrozomal fraksiyonlar KC

SAFLATIRMA EMASI
BYOLOJK MATERYAL (R: DOKU)

EKSTRAKSYON
HCRE EKSTRAKTI HCRE BTNLNN (MEMBRAN YAPISININ) BOZULMASI

ENZMATK KMYASAL FZKSEL MEKANK

Total hcre ierii hcre lizat

SAFLATIRMA EMASI
HCRE LZATI
ZNMEYEN HCRE DEBRS (UZAKLATIRILIR) SANTRFJ FLTRASYON

SPERNATAN
DER PROTEN, YON,SU VB, ORTAMDAN UZAKLATIRILMASI

HCRESZ LZAT (NKLEK AST, PROTENLER KK MOLEKLLER) ARDIIK SAFLATIRMA LEMLER

SAF PROTEN

 stenilen proteinin yapsn ve biyolojik aktivitesini deitirmemek iin: - 0-4C ortam scakl(tm ilemler iin) - Blenderde paralama(kylm doku rnei) - Uygun tampon (pH, iyonik g) seimi

r: 0.05 M fosfat tamponu, PH 7.4

Kylm doku rnei, 1/10 orannda tamponla

kartrlr

Paralama (homojenizasyon) yntemleri uygulanarak doku veya hcrelerin eper ve zar yaplar yok edilir.
Ele geen ve allacak molekl grubunu ieren karma HOMOJENAT denir.

HCRE BTNLNN BOZULMASI

Kimyasal: Organik solventler, deterjanlar Enzimatik: Lizozim, glukanaz Fiziksel: Osmotik ok, dondurma / zdrme Mekanik: Sonikasyon, homojenizasyon Fransz presi

KMYASAL YNTEMLER
Deterjanlar: Triton X-100, vb

Membran yapsn bozarak

hce ieriinin ortama

gemesini salarlar

- Pahal - Proteinleri denatre edebilir - Ortamdan hemen uzaklatrlmaldr

FZKSEL YNTEMLER
OZMOTK OK

Mekanik yntemler
FRANSIZ PRES

SONKASYON

HOMOJENZASYON

eitli materyallere uygulanabilecek baz paralama yntemleri

TEKNK
Nazik Ozmotik ok Enzim uygulamas Deterjan uygulamas Havan veya pistonlu homojenizatr Dier aletlerle paralama Orta iddette Milli homojenizatrle par. Kum, alumina vb. ile ezme

MATERYAL TP
Eritrositler Bakteriler, mayalar Doku kltr hcreleri Karacier vb yumuak dokular Kas vb. Dokular

Hayvansal ve bitkisel dokular Bakteriler

Sert Fransz basn hcresi Ultrasonikasyon Balistik paralama

Bakteriler Hcre sspansiyonlar Hcre sspansiyonlar

SAFLATIRMADA KULLANILAN PRENSPLER

FZKSEL ZELLKLER PROTENLER
SAFLATIRMA

BYKLK/KTLE EKL ZNRLK POLARTE AFFNTE, VB

SAFLATIRMADA KULLANILAN

BYKLK KTLE

santrifj diyaliz ultrafiltrasyon jel filtrasyonu kromatografisi jel elektroforezi (SDS-PAGE)

ZNRLK
% 20 (NH4)2SO4

FRAKSYONEL PRESPTASYON
% 40 (NH4)2SO4

PROTEN ZELTS

SANTRFJ

hedef protein

presipitat

YK

YON EXCHANGE KROMATOGRAFS ELEKTROFOREZ ZOELEKTRK FOKUSNG

BYOLOJK AKTVTE BALANMA

AFFNTE KROMATOGRAFS

TAMPON AKII

LGANDPROTEN KOMPLEKS

LGAND BALI BONCUK SPESFK PROTEN

SERBEST PROTENLER

DER PROTENLER