Lazar Andrei Septembrie 23, 2011

ADN vechi:metode, aplicatii, degradare si contaminare

Introducere
Prima extragere si analiza cu succes a ADN-ului vechi provine din pielea subspeciei extinse Equus quagga quagga avand o vechime de aproximativ 140 de ani (Higuchi et al. 1984). In 1985 a avut loc prima secventiere a ADN-ului vechi uman, (Pbo, 1985). ADN-ul vechi poate fi extras din dinti, oase, tesuturi mumificate, resturi de plante, solzi de peste etc. Degradarea moleculelor de ADN vechi face ca studiul lor sa fie mult mai complicat deoarece exista un risc mare de contaminare, mutatii care au aparut postmortem, ruperea catenelor de ADN in urma carora se reduce lungimea fragmentelor care pot fi amplificate. Degradarea are loc din cauza actionarii fortelor postmortem. Studiile anterioare aratau ca ADN-ul vechi poate fi recuperat chiar si din ramasite mai vechi de 1 milion de ani (Golenberg et al., 1990; Soltis et al., 1992; Cano et al., 1992; DeSalle et al.,1992; Woodward et al.,1994) , insa studiile actuale arata ca acestea rezultate au aparut din cauza contaminarii cu ADN modern (Pbo si Wilson, 1991; Young et al., 1995; Zischler et al., 1995; Wang et al., 1997; Yousten si Rippere, 1997). Conform lui Stankiewicz et al., 1998 si Loreille et al., 2001, se pare ca ADN-ul nu rezista mai mult de 130 000 de ani chiar si in cele mai bune conditii de pastrare. ADN-ul se gaseste in nucleu unde are 2 copii (paterna si materna) si in unele organite celulare (mitocondrii si cloroplaste) unde se gaseste o cantitate mult mai mica de ADN dar exista sute de de astfel de organite in fiecare existand mai multe copii. Pentru studiul ADN-ului vechi, spre deosebire de ADN-ul modern, se prefera ADN-ul provenit din organite deoarece exista mai multe copii si probabilitatea de a recupera segmente intacte creste (Bacher et al., 1990; Hummel si Hermann,1996; Zierdt et al., 1996; Gerstenberger et al.,1999; Hummel et al., 1999;Schmerer et al., 1999;Schultes et al., 1999; Cunha et al., 2000). hidrolitice si oxidative ce actioneaza

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011 Studiile ADN-ului vechi ne permite sa analizam si sa comparam datele dintre populatiile din trecut si cele actuale determinand relatia dintre ele precum si analiza efectivului populatiei(i.e. Higuchi et al.1984; Hnni et al. 1994; Krings et al. 1997; Cooper et al. 2001;Haddrath & Baker2001; Orlando et al. 2003; Thomas et al. 1990; Cooper et al. 1996; Hadly et al.1998;Leonard et al. 2000, 2002, 2005a, b, 2007; Barnes et al. 2002;Hofreiter et al. 2002, 2004; Paxinos et al. 2002; Shapiro et al.2004; Weinstock et al. 2005; Borge et al. 2007; Leonard &Wayne 2008) Dupa cum se poate vedea extragerea si analiza ADN-ului vechi este mult mai pretentioasa fata de cea a ADN-ului modern, in general fiind parcusi aceasi pasi, extragerea ADN-ului, amplificarea extractului cu ajutorul PCR-ului apoi clonarea si secventierea moleculelor rezultate, dar folosindu-se tehnici speciale din cauza problemelor mai sus mentionate.

Metode
Extragerea ADN-ului vechi din oase, dinti, tesut conservat si chiar din surse mai recente care nu au o vechime foarte mare cum este pielea de Quagga conservata la muzeu (Higuchi et al., 1984;Horsburgh et al., 2002), par (Morin et al., 1992, 1994) si fecale (Morin et al., 1992, 1994). Inainte de toate pentru a putea extrage ADN-ul trebuie decontaminata suprafata probei prin expunerea acesteia la lumina UV (Frederika A. Kaestle & K. Ann Horsburgh, 2002). Pentru extractie se pulverizeaza proba in apa unde se lasa timp de o ora, ADN-ul fiind usor solubil, dupa care se centrifugheaza pentru a separa biomoleculele dizolvate in supernatant iar resturile probei asezandu-se in pelet. Simpla centrifugare nu ne permite accesul la toate moleculele de ADN, studiile recente arata ca o parte din ADN-ul vechi se afla in depozite cristalizate impreuna cu matrita osoasa iar imbibarea cu EDTA duce la cresterea cantitatii de ADN vechi izolat de resturile probei prin inlaturarea ionilor de calciu ceea ce provoaca slabirea matritei osoase. Extractele din diferite tipuri de tesut ce contin ADN modern deobicei mai contine ARN si proteine. Spre deosebire de astfel de tesuturi cele ce contin ADN vechi contin mai degraba produsi ai diagenezei(ex: reactia Maillard ce consta in interactiunea dintre proteine si carbohidrati ce duce la formarea unei varietati mari de substante organice) si compusi absorbiti

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011 din mediul inconjurator (ex: acidul humic ce rezulta din descompunerea plantelor si se gaseste in sol). Pentru decontaminarea acestora, tratamentul folosit la ADN-ul modern cu fenol sau mixul de 1:1 fenol si chloroform nu prezinta prea mare siguranta astfel pentru ADN-ul vechi se foloseste purificarea cu silica binding care consta intr-o coloana ce contine o membrane de dioxid de siliciu care in prezenta guanidinului tiocianat molecule de ADN se leaga de aceasta din extractul apos iar compusi si produsi diagenezei ce contaminau extractia, dupa spalarea cu gunidiniu tiocianat trec de membrana parasind coloana. Pentru a recupera ADN-ul de pe coloana aceasta se spala cu apa care destabilizeaza interactiunile dintre moleculele de ADN si membrana de siliciu (Terry Brown si Keri Brown, 2011).

ADN-ul vechi este depedent de PCR deoarece cantitatea extrasa a acestuia este foarte mica iar cu ajutorul PCR-ului care amplifica ADN-ul, acesta poate fi analizat prin secventiere si alele scurte ce se repeta in tandem. In urma PCR-ului rezulta mai multe copii repetate a unei anumite regiuni din molecula de ADN. Regiunile tinta din ADN-ul mitocondrial sunt deobicei regiunile hipervariabile, aceste portiuni se gasesc in numar mare de copii in celula astfel creste probabilitatea ca cel putin cateva copii sa reziste o perioada mai lunga de timp. Deobicei, dupa amplificarea segmentului ce ne interseaza cu ajutorul PCR-ului, rezultatele sunt analizate cu ajutorul electroforezei dupa care se secventiaza. Extractia si analiza ADN-ului vechi este destul de complicata si metodele prin care acestea se realizeaza continua sa evolueze (Frederika A. Kaestle & K. Ann Horsburgh, 2002).

Aplicatii
Studiul ADN-ului vechi ne permite aflarea sexului cu ajutorul markerilor pentru cromosomul Y si cromosomul X. De asemenea se poate indentifica unicitatea indivizilor, astfel in cazul in care mai multe resturi provenind de la indivizi diferiti sunt amestecate se pot sorta iar partile disociate se pot reasocia.

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011 Cu ajutorul markerilor pentru ADN-ul vechi mitocondrial, cloroplatidian si autozomal putem intelege obiceiurile alimentare si de vanatoare, comesalismul dintre animale si populatiile umane, domesticirea plantelor si animalelor si chiar a afla tipare ale bolilor preistorice. ADN-ul vechi ofera informati si despre continuitatea si deplasarile populatiilor ancestrale si relatiile dintre grupurile acestora si grupurile descedente cu ajutorul markerilor ADN-ului

mitocondriali, cromozomului de sex si ADN-ului autozomal. ADN-ul vechi are aplicatii si in reconstituirea filogenetica urmarindu-se evolutia speciilor si originea omului modern. Acestea sunt doar o mica parte a aplicatiilor pentru ADN-ul vechi.

Degradarea ADN-ului vechi

De-a lungul timpului ADN-ul vechi a fost extras si clonat din diferite organisme care s-au conservat in diferite feluri (piele conservata in muzeu, mumii, mamuti conservati in blocuri de gheata, o frunza de Magnolia veche de 17 milioane de ani si chiar dintr-o insecta conservata in chirlimbar veche de 130 milioane de ani ). Toate aceste probe aveau in comun faptul ca ADN-ul extras din acestea avea o greutate moleculara mica si deobicei o lungime de 100-200 perechi de baze. Din cauza hidrolizei si oxidari ADN-ul vechi sufera unele modificari precum deletii ,oxidarea pirimidineleor si a legaturilor intracelulare si interceluare(Zvi Kelman & Lori Moran et al.1996). O alta cauza a degradarii este reactia Maillard care apare la interactiunea dintre componenta glucidica (pentoza) si aminoacizi care poate cauza legaturi intre polinucleotide si peptide. Chiar daca nu se produce o legatura, atasarea unui peptid de polinucleotid poate sa se comporte ca o leziune de blocare. Produsii reactiei Maillard se formeaza de-a lungul descompunerii materialului biologic deci este foarte probabil ca acestea sa se formeze intr-un anumit stadiu a diagenezei a specimenelor arheologice (Terry Brown si Keri Brown, 2011). In ciuda vechimii diferite a acestor probe, de la cativa zeci de ani pana la milioane de ani, nivelul de degradare a ADN-ului este similar deci nu putem corela varsta cu integritatea moleculei de ADN.

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011 In ceea ce priveste lungimea fragmentelor de ADN, aceasta este explicata prin faptul ca degradarea se produce la nivelul ADN-ului de legatura dintre nucleosomi sub actiunea nucleazelor iar segmentul ce se infasoara in jurul proteinelor histonice fiind protejat de catre acestea. Lungimea fragmentelor de ADN vechi este corelata cu lungimea fragmentului de ADN ce infasoara un sngur nucleusom, de obicei de aproximativ 160 perechi de baze, in functie de specie. La celulele procariote ADN-ul este protejat asemanator celor eucariote doar ca in loc de histone ADN-ul procariot este protejat de alte proteine asemanatoare acestora. Despre degradarea ADN-ului din celulele procariote, mitocondrii si cloroplat, dupa moarte nu se cunosc foarte multe dar s-a evidentiat in urma necrozei calcificarea mitocondriilor si aparitia de material condesat. Dupa mai mult timp atat histonele cat si nucleazele vor fi degradate iar deshidratarea, schimbarea temperaturii, a pH-ului si a sarurilor din mediu inconjurator pot contribuii la protectia moleculei de ADN. Astfel molecula de ADN poate sa reziste pana la cateva sute sau milioane de ani(Zvi Kelman & Lori Moran et al.1996).

Contaminarea
ADN-ul uman si microbial precum si diferite celule sunt omniprezente in toate mediile de laborator deci este normal sa presupunem ca reactivi si ustensilele de laborator pot fi

contaminate cu acestea cand sosesc de la producator. Curatarea extensiva a reactivilor prin ultrafiltrare si curatarea ustensilelor de laborator este esentiala, decontaminarea complecta necesitand expunerea prelungita la iradiere cu UV, incalzire la o temperatura mai mare de 180 C timp de 12 ore, precum expunerea la HCl sau sodiu. Autoclavarea nu impiedica contaminarea cu ADN bacterian deoarece nu previne amplificarea fragmentelor scurte de ADN cu o lungime mai mica sau egala cu 150 perechi de baze (Willerslev et al. 2004b;. MTP Gilbert, date nepublicate). Curenti de aer care se creeaza atunci cand desfacem tubul de PCR sau transferam diferite substante formeaza picaturi de aerosoli ce pot contine peste un milion de copii de secvente pe

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011 0.005l ceea ce face ca produsele de PCR sa fie surse de contaminare ce pot fi distribuite larg in intreaga cladire prin curentii de aer formati prin miscarea personalului si sistemelor de tratare a aerului. Un singur aerosol provenit din tubul de PCR poate contine de mi de ori cantitatea de ADN mitocondrial gasita intr-un gram din proba provenita de la mai multe specimene umane
( Handt et al. 1996; Cooper et al.2001).

Din aceasta cauza este recomandat ca laboaratoarele unde se lucreaza cu ADN vechi sa fie izolate si de preferabil in cladiri unde nu se mai efectueaza alte lucrari de biologie moleculara. Deplasarea zilnica personalului ar trebui sa fie dinspre laboratoarele unde se lucreaza cu probe vechi spre cele unde se lucreaza cu probe moderne. Aceste simple precautii pot fi la fel de eficace precum alte sisteme de inalta tehnologie care sunt folosite anticontaminare (Eske Willerslev & Alan Cooper et al.2005).

Dupa cum se poate vedea studiul ADN-ului vechi ridica multe probleme ceea ce face ca autenticitatea rezultatelor sa fie de multe ori pusa in discutie, cu toate acestea criteriile care confirma sau intaresc autenticitatea ADN-ului vechi precum si materialele si metodele continua sa evolueze.

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011

BIBLIOGRAFIE Bacher R, Suter PJ, Eggenberger P, Ulrich-Bochsler S, Meyer L. 1990. Aegerten. Die spa tromischen Anlagen und der Friedhof der Kirche Bu rglen. Bern: Staatlicher Lehrmittelverlag. Barnes I, Matheus P, Shapiro B, Jensen D, Cooper A (2002) Dynamics of Pleistocene population extinctions in Beringian brown bears. Science, 295, 22672270. Borge T, Bachmann L, Bjrnstad G, Wiig (2007) Genetic variation in Holocene bowhead whales from Svalbard. Molecular Ecology, 16, 22232235. Cano R, Poinar H, Roubik D, Poinar G. 1992. Enzymatic amplification and nucleotide sequencing of portions of the 18s rRNA gene of the bee Proplebeia dominicana isolated from 2540 million year old amber. Med Sci Res 20:619622. Cunha C, Fily M-L, Clisson I, Santos AL, Silva AM, Umbelino C, Cesar P, Corte-Real A, Crubezy E, Ludes B. 2000. Children at the convent: comparing historical data, morphology and DNA extracted from ancient tissues for sex diagnosis at Santa Clara- Velha (Coimbra, Portugal). J Archaeol Sci 27:949952 Cooper A, Rhymer J, James HF et al. (1996) Ancient DNA and island endemics. Nature, 381, 484. Cooper A, Lalueza-Fox C, Anderson S, Rambaut A, Austin J, Ward R (2001) Complete mitochondrial genome sequences of two extinct moas clarify ratite evolution. Nature, 409, 704707. DeSalle R, Gatsey G, Wheeler W, Grimaldi D. 1992. DNA sequences from a fossil termite in OligoMiocene amber and their phylogenetic implications. Science 257:19331936. Eske Willerslev & Alan Cooper, (2005) Ancient DNA, Proceedings. Biological sciences / The Royal Society 2005;272(1558):3-16. Frederika A. Kaestle & K. Ann Horsburgh, (2002) Ancient DNA in Anthropology: Methods, Applications,and Ethics, YEARBOOK OF PHYSICAL ANTHROPOLOGY 45:92130 Golenberg E, Giannasi E, Clegg M, Smiley CJ, Durban M, HendersonD, Zurawski G. 1990. Chloroplast sequence from a Miocene magnolia species. Nature 344:656658. Gerstenberger J, Hummel S, Schultes T, Hack B, Herrmann B.1999. Reconstruction of a historical genealogy by means of STR analysis and Y-haplotyping of ancient DNA. Eur J Hum Genet 7:469477. Haddrath O, Baker AJ (2001) Complete mitochondrial DNA genome sequences of extinct birds: ratite phylogenetics and the vicariance biogeography hypothesis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 268, 939945. Hadly E, Kohn MH, Leonard JA, Wayne RK (1998) A genetic record of population isolation in pocket gophers during Holocene climatic change. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95, 68936896.

Hnni C, Laudet V, Stehelin D, Taberlet P (1994) Tracking the origins of the cave bear (Ursus spelaeus) by mitochondrial DNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,91, 1233612340. Higuchi R, Bowman B, Freiberger M, Ryder AO, Wilson AC. 1984. DNA sequence from the quagga, an extinct member of the horse family. Nature 312:282284.

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011

Hofreiter M, Capelli C, Krings M et al. (2002) Ancient DNA analyses reveal high mitochondrial DNA sequence diversity and parallel morphological evolution of late Pleistocene cave bears. Molecular Biology and Evolution, 19, 12441250. Hofreiter M, Serre D, Rohland N et al. (2004) Lack of phylogeography in European mammals before the last glaciation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 101, 1296312968. Horsburgh KA, Matisoo-Smith E, Glenn ME, Bensen KJ. 2002. A genetic study of a translocated guenon: Cercopithecus mona on Grenada. In: Glenn ME, Cords M, editors. The guenons: diversity and adaptation in African monkeys. Kluwer Academic Publishers. Plenum Publishers. p 97107. Hummel S, Herrmann B. 1996, aDNA typing for reconstruction of kinship. Homo 47:215222. Hummel S, Schultes T, Bramanti B, Herrmann B. 1999. Ancient DNA profiling by megaplex amplifications. Electrophoresis 20:17171721. Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, PboS (1997) Neandertal DNA sequences and the origin of modernhumans. Cell, 90, 1930. Leonard JA, Wayne RK, Cooper A (2000) Population genetics of Ice Age brown bears. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 97, 16511654. Leonard JA, Wayne RK, Wheeler J, Valadez R, Guilln S, Vil C (2002) Ancient DNA evidence for Old World origin of New World dogs. Science, 298, 16131616. Leonard JA, Vil C, Wayne RK (2005a) Legacy lost: genetic variability and population size of extirpated US gray wolves (Canis lupus). Molecular Ecology, 14, 917. Leonard JA, Rohland N, Glaberman Leonard JA, Rohland N, Glaberman S, Fleischer RC, Caccone A, Hofreiter M (2005b) A rapid loss of stripes: the evolutionary history of the extinct quagga. Biological Letters, 1, 291295. Leonard JA, Vil C, Fox-Dobbs K, Koch PL, Wayne RK, Van Valkenburgh B (2007) Megafaunal extinctions and the disappearance of a specialized wolf morph. Current Biology, 17,11461150. Leonard JA, Wayne RK (2008) Native Great Lakes wolves were not restored. Biological Letters, 4, 9598. Loreille O, Orlando L, Patou-Mathis M, Philippe M, Taberlet P, Hanni C. 2001. Ancient DNA analysis reveals divergence of the cave bear, Ursus spelaeus, and brown bear, Ursus arctos, lineages. Curr Biol 11:200203. Orlando L, Leonard JA, Laudet V, Guerin C, Hnni C (2003) Ancient DNA analysis reveals wooly rhino evolutionary relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution, 28, 7690. Paabo S. 1985a. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. Nature 314:644645. Paabo S. 1985b. Preservation of DNA in ancient Egyptian mummies. J Archaeol Sci 12:411417. Pbo S: Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:19391943. Paabo S, Wilson AC. 1991. Miocene DNA sequences: a dream come true? Curr Biol 1:4564. Paxinos EE, James HF, Olson SL, Ballou JD, Leonard JA, Fleischer RC (2002) Prehistoric decline of genetic diversity in the nene. Science, 296, 1827.

Lazar Andrei Septembrie 23, 2011

Shapiro B et al. (2004) Rise and fall of the Beringian steppe bison.Science, 306, 15611565. Soltis P, Soltis D, Smiley C. 1992. An rbcL sequence from a Miocene Taxodium (bald cypress). Proc Natl Acad Sci USA 89:499501.

Stankiewicz BA, Poinar HN, Briggs DEG, Evershed RP, Poinar G. 1998. Chemical preservation of plants and insects in natural resins. Proc R Soc Lond [Biol] 265:641647. Schmerer WM, Hummel S, Herrmann B. 1999. Optimized DNA extraction to improve reproducibility of short tandem repeat genotyping with highly degraded DNA as target. Electrophoresis 20:17121716. Schultes T, Hummel S, Herrmann B. 1999. Amplification of Ychromosomal STRs from ancient skeletal material. Hum Genet 104:164166. Terry Brown si Keri Brown, (2011).Biomolecular Archeology An Introduction Thomas WK, Pbo S, Villablanca FX, Wilson AC (1990) Spatial and temporal continuity of kangaroo rat populations shown by sequencing mitochondrial DNA from museum specimens. Journal of Molecular Evolution, 31, 101112. . Wang H-L, Yan Z-Y, Jin D-Y. 1997. Reanalysis of published DNA sequence amplified from Cretaceous dinosaur egg fossil. Mol Biol Evol 14:589591. Weinstock J et al. (2005) Evolution, systematics, and phylogeography of Pleistocene horses in the New World: a molecular perspective. PLoS Biology, 3, e241. Willerslev E., Hansen A.J., Brand T.B., Rnn R., Barnes I., Wiuf C., Gilichinsky D.A., Mitchell D., Cooper A. (2004a) .Long-term persistence of bacterial DNA. Curr. Biol. ;14:R9R10.

Woodward SR, Weyand NJ, Bunnell M. 1994. DNA sequence from Cretaceous period bone fragments. Science 266:12291232

Young DL, Huyen Y, Allard MW. 1995. Testing the validity of the cytochrome b sequence from Cretaceous period bone fragments as dinosaur DNA. Cladistics 11:199209. Yousten AA, Rippere KE. 1997. DNA similarity analysis of a putative ancient bacterial isolate obtained from amber. FEMS Microbiol Lett 152:345347. Zischler H, Geisert H, von Haeseler A, Paabo S. 1995. A nuclear fossil of the mitochondrial D-loop and the origin of modern humans. Nature 378:489492 Zierdt H, Hummel S, Herrmann B. 1996. Amplification of human short tandem repeats from medieval teeth and bone samples. Hum Biol 68:185199. Zvi Kelman & Lori Moran 1996. Degradation of ancient DNA. Current Biology Vol. 6 Issue 3, Pages 219346.