INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS DE

PRODUCTOS NATURALES

AUTORES:

Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO M. en C. MARA EUGENIA GARN AGUILAR

Primera Edicin Enero 2010

CONTENIDO

PRCTICA NOMBRE PRESENTACIN REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES I MTODOS BSICOS DE EXTRACCIN 1.1 Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos 1.2 Anlisis de compuestos puros 1.3 Operaciones bsicas de separacin de sustancias qumicas para la obtencin de productos naturales II SEPARACIONES CROMATOGRFICAS 2.1 Cromatografa en capa fina y en Papel 2.2 Cromatografa en columna III ANLISIS PRELIMINAR FITOQUMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS 3.1 Preliminar fitoqumico 3.2 Anlisis espectroscpico infrarrojo y resonancia magntica. IV DETECCIN DE CIDOS FENLICOS DE TEJIDOS VEGETALES V ANLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES DE SEMILLAS DE Phaseolus spp. VI ANLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE Umbeliferaceas ANLISIS DE ALICINA EN Allium spp. VII VIII EXTRACCIN DE CAFENA DE HOJAS DE T NEGRO APNDICE 2. PREPARACIN DE REACTIVOS

Pag 3 4 6 10 15 23 27 31 37 40 43 46 49 52 55

PRESENTACIN El rea de los Productos naturales se ha desarrollado ampliamente a lo largo de la existencia de la humanidad, iniciando con el inters de los pueblos indgenas por el uso emprico que le dieron a las plantas y otros organismos para satisfacer sus necesidades de alimentacin y salud, as como, para el desarrollo de actividades religiosas. Con el paso del tiempo la confluencia de disciplinas cientficas como la Botnica, Etnobotnica, Fitoqumica, Farmacologa, etc. han dado soporte al estudio de los metabolitos de los productos naturales que se obtienen de las plantas y otros organismos. Asimismo, una gran cantidad de frmacos provienen de los productos naturales que generan los organismos vivos. Es por ello que surge la necesidad de que los futuros ingenieros Farmacuticos conozcan los principales mtodos procedimientos y tcnicas de obtencin de los metabolitos secundarios que conforman el basto campo de los productos naturales. En el presente manual se describen los experimentos bsicos que permiten manejar los mtodos y tcnicas de obtencin, caracterizacin y purificacin de metabolitos secundarios presentes en los productos naturales. Es conveniente indicar que este manual de prcticas de productos naturales se utiliz para cubrir la parte prctica de la asignatura optativa de Productos Naturales del plan rediseado de la Carrera de Ingeniera Farmacutica. Las prcticas contenidas en este manual fueron impartidas al grupo 7FV1 durante el primer semestre del ciclo escolar 2009-2010. Los autores agradecen a los estudiantes su entusiasta participacin durante el curso, ya que con ello se realizaron las modificaciones pertinentes a los desarrollos experimentales en el transcurso del semestre. Tambin, estamos concientes que todo manual de prcticas elaborado requiere de su contnua adecuacin e implementacin en el laboratorio, por lo que tomaremos en cuenta todas las observaciones y modificaciones, que tanto alumnos como profesores nos indiquen, con la finalidad de mejorar ste manual. Esperando que el material didctico elaborado cumpla con la funcin de introducir a los estudiantes en la disciplina de los productos naturales nos congratulamos en ponerlo a su disposicin. ATENTAMENTE Los autores. Dr. GUSTAVO VALENCIA DEL TORO

M. en C. MARA EUGENIA GARN AGUILAR

Reglamento del laboratorio de Productos Naturales El objetivo del presente reglamento es contribuir a la instrumentacin de medidas de seguridad bsicas que prevengan y/o eliminen los accidentes en laboratorio. Responsabilidades: Los Profesores responsables de impartir el curso de laboratorio de Productos Naturales sern los responsables conocer y hacer cumplir las normas establecidas en el presente reglamento. As como de su comunicacin a los alumnos de sus grupos respectivos.

Normas generales del Laboratorio: Las normas incluyen reglas, recomendaciones o prohibiciones relacionadas con el conocimiento, el sentido comn y la seguridad en el trabajo de laboratorio. Estar PROHIBIDO comer, beber, almacenar alimentos, correr, fumar, maquillarse o manipular lentes de contacto en el laboratorio. El rea de trabajo deber estar limpia y ordenada. No debe colocarse libros, abrigos o bolsas sobre las mesadas de trabajo. Se deber verificar que la mesa de trabajo est limpia al comenzar y al terminar el trabajo realizado. En el laboratorio de enseaza se debern almacenar la menor cantidad posible de drogas y reactivos. Los mismos debern estar debidamente etiquetados y almacenados en forma segura y en el lugar adecuado. Se deber usar vestimenta adecuada: bata con MANGA LARGA que cubra la ropa de calle, preferentemente de algodn, zapatos cerrados no huaraches o sandalias, asimismo, se deber tener el pelo recogido. Es obligatorio el uso de ANTEOJOS DE SEGURIDAD, segn sea lo que corresponda, durante la realizacin de los Trabajos Prcticos. Los ojos son rganos muy vascularizados que pueden absorber rpidamente algunos compuestos qumicos. Las gafas debern de uso personal y no pueden ser intercambiadas entre los alumnos. Los alumnos o docentes que realicen tareas experimentales en el laboratorio es de CARCTER OBLIGATORIO usar guantes apropiados acorde a los riesgos y los reactivos que se manipulen. Los guantes previenen el contacto con agentes txicos o biolgicos, quemaduras por superficies calientes, fras o corrosivas y cortes por objetos punzantes. Cuando corresponda utilizar cubrebocas y gorro para el pelo. PROHIBIDO pipetear con la boca. Se podrn utilizar pipetas de vidrio o plstico con propipetas o pipetas automticas. Los alumnos y docentes debern estar familiarizados con los elementos de seguridad disponibles, salidas, extintores, duchas, lavaojos, etc. Toda herida, an los pequeos cortes, que se produzca durante un trabajo prctico deben ser informados obligatoriamente al docente. Cuando el trabajo prctico involucre gases, vapores, humos o partculas, solventes, etc. deber realizarse en la campana de extraccin. No debe recibirse material de vidrio visiblemente defectuoso. Debe informarse al profesor responsable del grupo de las roturas de material o desperfectos detectados durante la operacin de materiales y equipos. En el caso de que alguna sustancia qumica entre en contacto con la piel (manos, cara y sobre todo con los ojos), debe lavarse la zona afectada con abundante agua durante 15 minutos por lo menos. Avise a los profesores responsables.

Considerar el siguiente letrero de una universidad espaola:

Prctica I

MTODOS BSICOS DE EXTRACCIN

1.- Medidas de seguridad en el laboratorio y manejo de residuos OBJETIVO El alumno comprender las medidas de seguridad, el manejo adecuado de los reactivos y disolventes, as como, el tratamiento de los residuos generados durante cada experimento. INTRODUCCIN. 1.1 Medidas de seguridad Al igual que los laboratorios de Qumica, Qumica Orgnica, Fisicoqumica, Bioqumica, etc, el laboratorio de Fitoqumica requiere de las precauciones de seguridad adecuadas. Es por ello que en todo laboratorio experimental se deben de seguir reglas generales de a comportamiento para el trabajo con los materiales, equipos y reactivos qumicos del laboratorio. Entre las reglas bsicas para el laboratorio de Fitoqumica estn las siguientes: 1. Usar bata de algodn durante su estancia en el laboratorio. 2. Ubicar y tener en mente las de salidas de emergencia, extinguidores de fuego y botiqun de primeros auxilios. 4. Distinguir los cdices de colores de tuberas y llaves de suministro de agua, aire, vaco y gas. 5. No poner objetos personales sobre la mesa de trabajo. 6. Trabajar en la campana de extraccin o en un lugar bien ventilado, cuando se utilicen sustancias txica, solventes, o reactivos qumicos que desprendan vapores. 7. No fumar en el laboratorio, ni ingerir alimentos. 8. Traer proteccin en los ojos durante su permanencia en el laboratorio. 9. No usar lentes de contacto en el laboratorio. 10. Informar inmediatamente sobre cualquier accidente que ocurriera, sea un dao fsico como quemaduras, cortaduras o algn dao al equipo del laboratorio. 11. En caso de mancharse la bata con algn reactivo peligroso, quitrsela lo ms pronto posible. 12. Usar guantes adecuados para cada caso, cuando se manejen materiales corrosivos o txicos, objetos punzo-cortantes (vidrio, tubo, etc.) materiales muy calientes o muy fros. 13. Usar una toalla para proteger sus manos cuando corte vidrio o inserte tubo de vidrio o termmetros en tapones. Lubricar las perforaciones de tapones antes de introducir el tubo o el termmetro. 14. Leer con cuidado las etiquetas en los frascos de reactivos que va a utilizar, y tomar en cuenta sus indicaciones. 15. Manipular adecuadamente los lquidos y slidos de los frascos que los contienen, usando pipetas, probetas o esptulas. Para el caso particular de los lquidos, extraer con la perilla de extraccin, pro pipeta o jeringa adaptada con un trozo de manguera, NUNCA CON LA BOCA. 16. Cuando se preparen soluciones cidas, verter siempre el cido al agua y nunca en forma inversa. 1 7. Si un cido, base o cualquier reactivo corrosivo salpica su cuerpo, enjuagarse con abundante agua y llamar al profesor. 18. Antes de encender un mechero asegurarse de que no haya cerca vapores o lquidos flamables. 19. Nunca calentar un aparato que no est abierto a la atmsfera. 20. Antes de verter o evaporar un lquido orgnico asegurarse que no haya una flama cerca. 6

21. Nunca calentar un lquido orgnico sobre la flama, utilice para ello parrilla o canastilla elctrica. 22. No regresar sobrantes de reactivos a los envases originales y no pipetear en los frascos originales de los reactivos, colocar siempre una pequea cantidad en un recipiente. 23. Usar siempre pipetas limpias para medir las diferentes sustancias. 24. Si no se conoce el manejo de un equipo, leer el instructivo antes de utilizarlo y si an as no queda claro, preguntar al instructor. 25. Antes de verter los residuos al cao, asegurase de que es posible si son diluidos con agua, de lo contrario verterlos en recipientes adecuados para ello. 26. Antes de retirarse del laboratorio dejar limpio el material utilizado durante la prctica y el lugar de la mesa utilizada, asegurarse de que no quede ningn equipo encendido o conectado o una llave de agua o gas abierta. 1.2 Manejo de los residuos generados durante las prcticas. La seguridad en el laboratorio no termina al finalizar el trabajo experimental sino hasta que se coloquen adecuadamente los residuos generados, ya que debe de considerarse el impacto ecolgico que pueden causar si son desechados irresponsablemente. Los residuos qumicos son sustancias que fueron utilizadas en el laboratorio y no es posible regresarlas a su recipiente original, debido a que han sufrido cambios durante la experimentacin y no son ya tiles para realizar nuevos experimentos, por lo que no tiene caso guardarlos en los anaqueles especficos para reactivos qumicos. Asimismo, en ocasiones los compuestos o mezclas formadas pueden ser cancergenos, mutgenos, infecciosos, teratolgicos, o explosivos. Algunas acciones y actitudes que se deben de tener al trabajar los residuos qumicos son: 1. Conocer la naturaleza de los residuos que se van a generar. 2. Utilizar la menor cantidad posible de reactivos, haciendo un escalamiento de los procedimientos, cuando el experimento as lo permita. 3. Identificar las sustancias que se pueden recuperar o regenerar. 4. Predeterminar los compuestos ms peligrosos (cancergenos, mutgenos, infecciosos, teratolgicos, etc.). 5. Familiarizarse con las etiquetas de seguridad que tienen los reactivos. En el laboratorio debe de contar con varios recipientes para que los residuos que se generan durante las prcticas se depositen y posteriormente sean desechados de manera adecuada, dichos recipientes deben ser etiquetados y cumplir las funciones siguientes: A) Residuos acuosos. En este recipiente se colocan residuos acuosos de cidos orgnicos (cido actico) o cidos inorgnicos (cido ntrico, cido sulfrico, etc.). Para tratar estos residuos se diluyen aproximadamente de 1:5 con agua. Se neutralizan lentamente con hidrxido de sodio (en solucin o escamas). Se diluye nuevamente de 1:10 con agua y se elimina por el drenaje, dejando correr el agua en abundancia. B) Residuos orgnicos. En este grupo podemos se encuentran los alcoholes, aldehdos, cetonas, teres, steres. Si son solubles en agua diluir aproximadamente en 1:20 con agua y eliminar por el drenaje. Si no lo son, evaporar en pequeas dosis en la campana de extraccin. Las cetonas insolubles se incineran en 7

la campana a pequeas dosis. Los aldehdos insolubles se oxidan agregando permanganato de potasio en solucin o dicromato de potasio. Se diluyen 1:10 y se eliminan en el drenaje dejando correr agua en abundancia. C) Residuos halogenados. Como ejemplos el diclorometano, el cloroformo, el cido trifluoractico. Se requiere de un procedimiento ms elaborado que no es posible realizar en el laboratorio. Por ello se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento. D) Residuos de fases estacionarias cromatogrficas (slica gel, almina, etc). Se requiere de un procedimiento ms elaborado que no es posible realizar en esta escala en el laboratorio. Por ello se canaliza al organismo apropiado para su tratamiento. Dependiendo del tipo de reactivo deber elegirse las caractersticas de los recipientes que sern utilizados para contenerlos. MATERIALES 1.- Frascos vacos de vidrio o plstico limpios y secos con capacidad de 0.5 a 2 L con motivo de etiquetarlos para desechos, cinta adhesiva y marcadores (alumnos). 2.- Frascos con reactivos y disolventes que se emplearn durante el desarrollo del curso. 3.- Carteles que ilustran claves e instrucciones para trabajar con seguridad en el laboratorio. PROCEDIMIENTO Se har un recorrido por el laboratorio para mostrar la ubicacin de las salidas de emergencia, extinguidores, campanas de extraccin, sitio para realizar el desecho de residuos, lugar para la limpieza del material utilizado durante las prcticas e instrucciones para su limpieza; asimismo se indicar la ubicacin de reactivos y disolventes. Se revisarn las etiquetas de los disolventes y reactivos que se emplearn durante el desarrollo del curso, as como, de carteles existentes en el laboratorio que tienen que ver con el manejo adecuado de los mismos. Se colocarn etiquetas a los frascos de desechos clasificndolos en los cuatro rubros antes mencionados. REFERENCIAS Bernabei, D. 1994. Seguridad. Manual para el laboratorio. Merck. Alemania.233 pp. Luzn, S.G. 1992. Hazards in the chemical laboratory. 5th. Ed. RSC Cambridge. 675 pp.

INFORME SESIN 1 TITULO DE LA PRCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados: 1.- Mencione 3 medidas de seguridad que protejan su integridad fsica cuando trabaje en el laboratorio: 2.- Realice la bsqueda en Internet de los principales smbolos de peligrosidad (pictogramas) que son usados para los reactivos qumicos y reas de laboratorios. Hacer una descripcin de cada unos de ellos y decir cuales son las diferencias entre los smbolos usados en los Estados Unidos y en la Unin Europea. 3.- Adems de los pictogramas antes indicados, las etiquetas de los reactivos cuentan con un cdigo adicional (con letras) sobre riesgos especficos y consejos de prudencia. Indique para al menos 5 reactivos qumicos que se encuentran en su mesa cules son dichas indicaciones. No olvides reportar la bibliografa consultada, recuerda que para pginas Web se debe de escribir de la siguiente forma: El patrn bsico para una referencia electrnica es: Autor, inicial(es) de su nombre (ao). Ttulo. Mes, da, ao, direccin en Internet. Ejemplo: Bancos, I. (n.d.). Los NHS marcan la pauta del cuidado de la salud. Obtenida el 29 de agosto de 2001, de http://www.healthcareguide.nhsdirect.nhs.uk/ Si no consigue identificar la fecha en que el documento fue publicado, utilice la abreviatura n.d. (no date [sin fecha]). Si no consigue identificar al autor, empiece su referencia con el ttulo del documento. Si el documento se ubica dentro de una pgina institucional, como la de alguna universidad o departamento gubernamental, primero cite el nombre de la organizacin o del departamento en cuestin, antes de dar la direccin electrnica, ver ejemplos: 1.- Alexander, J., & Tate, M. A. (2001). Evaluando las Fuentes Electrnicas. Consultado el 21 de agosto de 2001, Widener University, pgina web conmemorativa de la biblioteca Wolfgram: http://www2.widener.edu/Wolfgram-Memorial- ibrary/webevaluation/webeval.htm 2.- Decidiendo su futuro. (2000). Consultado el 5 de septiembre de 2001, Portsmouth University, pgina web de Servicios Profesionales: http://www.port.ac.uk/departments/careers/plancareer/deciding-your-future.htm

2.- Anlisis de compuestos puros OBJETIVO El alumno determinar los puntos de fusin y ebullicin de mezclas y sustancias puras y relacionar las propiedades fisicoqumicas con la pureza de los compuestos qumicos. INTRODUCCIN: Un problema que con frecuencia se encuentra en las investigaciones con productos naturales es la identificacin de sustancias y la determinacin de su pureza. Una primera aproximacin para determinar la pureza de los compuestos qumicos es la determinacin de constantes fsicas como punto de fusin, punto de ebullicin, densidad, ndice de refraccin, etc. Los puntos de fusin y ebullicin son especialmente tiles para la identificacin de compuestos orgnicos. Actualmente para caracterizar substancias se emplean tcnicas modernas de anlisis, tales como espectroscopia en sus diversas modalidades Ultravioleta-Visible (UV-Vis), Infrarrojo (IR), Resonancia Nuclear Magntica (RNM)), Espectrometra de masas (EM), cromatografa de gases (CG) y cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls). a).-PUNTO DE FUSIN. El punto de fusin de un compuesto se puede definir, como la temperatura a la cual un slido pasa al estado lquido y por lo tanto en el punto de fusin el estado slido y lquido estn en equilibrio. Se usa en la identificacin de compuestos desconocidos y tambin como un criterio de pureza. Los compuestos puros tienen un punto de fusin definido con un intervalo de 0.5 a 1 C. La presencia de impurezas abate el punto de fusin y amplia dicho rango en ocasiones en ms de 4 C. Para el caso de los compuestos orgnicos slidos, la determinacin del punto de fusin del compuesto (Tf) es una tcnica muy utilizada. Varias razones prcticas la justifican: es rpida y requiere temperaturas moderadas (100-200 oC), los cambios de Tf con la presin son muy pequeos, Tf es muy fcil de detectar experimentalmente, y se utiliza muy poca cantidad de muestra. b).-PUNTO DE EBULLICIN. El punto de ebullicin se define como la temperatura a la cual la fase vapor y la fase lquida coexisten. En cualquier combinacin de presin y temperatura, una cierta fraccin de molculas del lquido escapan o se evaporan de su superficie como vapor. Este proceso se llama vaporizacin o evaporacin y el proceso opuesto se denomina condensacin. La presin ejercida por este vapor que escapa se denomina presin de vapor de un lquido y su valor aumenta con el aumento de temperatura. La temperatura a la cual la presin de vapor es igual a la temperatura externa se llama punto de ebullicin del lquido. El ms familiar es el del agua, que ocurre a 100 C y una atmsfera de presin y se conoce como punto de ebullicin normal del agua. Las molculas de agua estn unidas en la fase lquida por fuerzas de atraccin moderadamente fuertes llamadas puentes de hidrgeno. El calentamiento es necesario para romper estas fuerzas y permitir que el lquido pase a la fase gaseosa. Al igual que el punto de fusin, la temperatura de ebullicin de una sustancia impura no es un punto fijo y preciso como el punto de ebullicin de un lquido puro, pero el anlisis de pureza por medio del punto de ebullicin es menos exacto, pues los intervalos de temperatura que se obtienen dependen del aparato utilizado. El punto de ebullicin de un compuesto se define como la temperatura a la que la presin de vapor del lquido iguala la presin atmosfrica. Los lquidos puros tienen puntos de ebullicin constantes. Mezclas de lquidos muestran un intervalo de ebullicin, excepto casos especiales que incluyen una mezcla con un punto de ebullicin constante llamada aztropo. c).- PUNTO DE SUBLIMACIN. Una tcnica muy usada para purificar slidos es la sublimacin. El punto de sublimacin de una sustancia es aquella temperatura a la cual dicho compuesto pasa de la fase slida a la fase gas 10

directamente, sin pasar por la fase lquida, mediante el mecanismo de sublimacin. Algunos slidos, como el iodo o la quinina, experimentan dicha transicin de fase. Termodinmicamente suele ser una transicin favorable debido al gran incremento de entropa que conlleva. La sublimacin de un slido se lleva a cabo cuando se igualan la presin de vapor del slido con la presin externa. Consiste en que un slido se calienta y se convierte en vapor sin pasar por el estado lquido, y el vapor se vuelve a solidificar en contacto con una superficie fra. Si este proceso slo lo sufre el slido que se quiere purificar y no sus impurezas, el resultado puede ser altamente satisfactorio. REACTIVOS Y DISOLVENTES: cido benzico, glucosa, sal comn, alcanfor, acetona, frmaco ibuprofeno, Hexano, metanol, etanol, glicerol MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO: 4 Tubos capilares para determinar punto de ebullicin 1 Termmetro 1 Aparato para la determinacin del punto de fusin 1 Mechero Bunsen 1 Embudo 1 Mortero con pistilo 1 Liga 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Cpsula de porcelana Vaso de precipitado de 300 mL Parrilla elctrica Tubo de ensayo cristalizador cpsula esptula vidrio de reloj Balanza analtica

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PROCEDIMIENTO: DETERMINACIN DEL PUNTO DE FUSIN a) En este experimento se determinarn los puntos de fusin del cido benzico y de la glucosa puros (p.f. 121 123 y 146 C, respectivamente), as como de una mezcla 50:50 de ambos compuestos. Para ello colocar una pequea cantidad del compuesto en el portaobjetos circular de la platina de calentamiento del aparato Fisher, iniciar el calentamiento, en el momento en el cual se funda la sustancia registrar la temperatura, hacer lo mismo para las dems sustancias. Para ilustrar el abatimiento en el punto de fusin, determina el punto de fusin de la mezcla de benzico-glucosa. b) En esta parte del experimento se determinar el punto de fusin del principio activo de un frmaco y de su excipiente. Preparacin de la muestra: 1. Pesar 1 tableta de ibuprofeno (400 mg) y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de ibuprofeno (se recomienda hacerlo un da antes de la prctica). 2. Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusin, disolver el equivalente a los 0.5 g de ibuprofeno en 10-20 mL de acetona agitar y filtrar, evaporar el filtrado hasta sequedad sin calentarlo. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los cristales, dejar secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de fusin a la pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema 2) y a los cristales obtenidos (sustancia problema 1). DETERMINACIN DEL PUNTO DE EBULLICIN Con ayuda del mechero Bunsen fabricar algunas campanitas de ebullicin cerrando un extremo de los capilares. Colocar sobre la placa de calentamiento o parrilla el vaso de precipitados, un agitador magntico y el aceite mineral o glicerol que servir como bao caliente. Aadir 2 mL del lquido problema a un tubo de ensayo pequeo y deja caer una campanita de ebullicin con el extremo cerrado hacia arriba, de modo que quede sumergida en el lquido. Fijar el tubo de ensayo al termmetro con la banda de hule e iniciar el calentamiento. Cuando una corriente de burbujas rpida, ascendente y continua salga del capilar, anotar la temperatura y desconectar la placa, Cuando las burbujas dejen de salir del capilar y el lquido empiece a entrar en l, vuelve a registrar la temperatura. Promediar ambas temperaturas para obtener la temperatura de ebullicin del lquido. Seguir el mismo procedimiento para los otros lquidos. Determine el punto de ebullicin de los siguientes compuestos: Hexano. Metanol, Etanol y mezcla de metanol-etanol 50:50. SEPARACIN DE SLIDOS POR SUBLIMACIN En este experimento se trata de purificar alcanfor que est contaminado con sal comn. Se realiza con la finalidad de practicar la tcnica de la sublimacin y comprobar su utilidad. El alcanfor es un slido bastante voltil, que si se calienta puede convertirse en vapor todava muy por debajo del punto de fusin. En contraste, el cloruro de sodio no es voltil, dado que es una sustancia inica Colocar en el cristalizador una muestra de la mezcla de alcanfor y sal comn. La masa de la muestra debe ser aproximadamente 1 g, pero ha de ser pesada con exactitud. (Anotar el valor de esta pesada). Pese tambin el vidrio de reloj. Ponga el vaso con la muestra sobre la parrilla de calentamiento. Enfriar una cpsula colocando en ella trozos de hielo machacado y colocarla sobre la boca del cristalizador. Graduar la calefaccin de la parrilla de manera que el vaso se caliente suavemente. Observar conforme se calienta el vaso se deposita el alcanfor slido en la base de la cpsula. Cuando ya no se aprecie que aumenta la cantidad de alcanfor sublimado, desconectar la parrilla y dejar 12

enfriar. Retirar con cuidado la cpsula de porcelana, retirar con cuidado el agua y el hielo de la cpsula y secarla con papel absorbente. Colocar sobre la mesa una hoja de papel y sobre ella el vidrio de reloj que ha pesado. Con ayuda de una esptula, raspe con cuidado el fondo de la cpsula para separar el alcanfor, dejndolo caer sobre el vidrio de reloj. Pese el vidrio con el alcanfor recuperado. Calcule el porcentaje de alcanfor en la mezcla inicial. RESIDUOS Y SU MANEJO: Tubos capilares cerrados por un extremo. Se lavan y guardan para posteriores experimentos. Solventes hexano, metanol y etanol, y mezcla metanol-etanol Se colocan en el recipiente por separados para su destilacin y re-uso, excepto la mezcla. Glicerol. Se enfra y se guarda para su uso posterior. Alcanfor Entregue el alcanfor obtenido al profesor para su re-uso Residuo de salino Disolver en agua y verter en el drenaje REFERENCIAS: Pavia D.L., Lampman, G.L., Kriz G.S. Jr. 1976. Introduction to organic laboratory Techniques: A contemporary Approach. Saunders Co. Filadelfia. 699 p. Brieger, G. 1970. Qumica Orgnica Moderna. Curso Prctico de Laboratorio Harper Rovc Pubs. Inc. New York, 243 p.

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INFORME sesin 2. TITULO DE LA PRCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos de Punto de fusin: Sustancia Punto de fusin *Tf (terico) Tf (experimental) Observaciones

Ac. Benzico Glucosa Mezcla Glucosa-Benzico Problema 1 Problema 2 Mezcla problema 1-2 *Buscar en bibliografa 2- Escribe en el siguiente cuadro tus datos obtenidos de Punto de ebullicin: Sustancia Punto de ebullicin Observaciones *Tb (terico) Tb (experimental)

Hexano Metanol Etanol Mezcla Metanol-etanol *Buscar en bibliografa 3.- Discute los resultados obtenidos en tu experimento con los datos reportados en la bibliografa, explica las diferencias o semejanzas. 4.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de fusin, explica a que se deben los valores obtenidos. 5.- Para el caso de las muestras problema, en el punto de ebullicin, explica a que se deben los valores obtenidos.

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3.- Operaciones bsicas de separacin de sustancias qumicas para la obtencin de productos naturales OBJETIVO El alumno utilizar las tcnicas de filtracin, decantacin y cristalizacin para la separacin de un principio activo de un frmaco comercial. Y aplicar las tcnicas de separacin; destilacin por arrastre con vapor y extraccin continua con disolventes orgnicos (en Soxhlet y a reflujo) para aislar el aceite esencial de un producto natural. INTRODUCCIN: a) Procedimientos fsicos. La decantacin, la filtracin y la centrifugacin son procedimientos fsicos de separacin de sustancias qumicas que permiten la separacin de algn producto slido que se encuentra mezclado con algn lquido. Decantacin: Cuando en una solucin, una sustancia slida se precipita o es depositado en el fondo del recipiente, el lquido puede retirarse cuidadosamente inclinando ligeramente el recipiente y llevando la fase lquida a otro recipiente, de tal forma que se logre la separacin de las dos fases, a este proceso se le llama decantacin. Cuando se tienen dos lquidos inmiscibles que forman 2 fases se utiliza un embudo de separacin para realizar la separacin de fases. Filtracin: El proceso de filtracin consiste en separar una sustancia slida que no precipita y por tanto se encuentra suspendida en el seno del lquido, para ello se utiliza un filtro que generalmente es de papel y con ayuda de un embudo normal se vierte el lquido sobre el papel filtro previamente colocado sobre el embudo y el lquido es obtenido en un recipiente limpio. Tambin puede utilizarse vaco para realizar la filtracin, y generalmente se requiere un embudo Bchner, el cual se coloca sobre un matraz Kitazato. Se coloca un crculo de papel filtro (de poro adecuado a lo que se va a filtrar) en la base del embudo, el cual debe de quedar perfectamente ajustado, de tal forma que cubra todos los orificios del embudo. Se humedece el papel con un poco del lquido de la mezcla que va a ser filtrada. Se enciende el sistema de succin (de agua o bomba para vaco). Se agrega la mezcla a ser filtrada. Despus que ha pasado todo el lquido a travs del embudo al matraz, se apaga el sistema de vaco y se desconecta. Centrifugacin: Una centrfuga es un equipo que es capaz de aplicar una fuerza centrfuga sostenida, esto es, la fuerza generada a travs de la rotacin. La presencia de una fuerza que tiende hacia una direccin exterior siempre que una masa cambia su direccin, fue demostrada por Sir Isaac Newton en el siglo XVII, quien mostr en sus leyes del movimiento, que cuando un cuerpo movindose libremente en una lnea recta, cambia y es dirigido en una curva, a travs de una cuerda por ejemplo, entonces el cuerpo ejercer una fuerza exterior en contra de la cuerda. La intensidad de esta fuerza puede ser incrementada, aumentando: a) la velocidad de rotacin, b) la masa del cuerpo, c) el radio o la distancia del cuerpo al centro de la curva. Por lo tanto, incrementando la masa o el radio, se intensifica la fuerza centrfuga proporcionalmente, pero aumentando la velocidad de rotacin se incrementa en proporcin al cuadrado de la velocidad. La fuerza centrfuga se expresa por la 2 relacin bsica de: F = m v que equivale a F = 4 2 m n 2 R , donde F = fuerza centrfuga m = R masa, R = radio, v = la velocidad y n = el nmero de revoluciones por segundo. La fuerza centrfuga 15

es expresada como un mltiplo de g (aceleracin debida a la gravedad). Con las centrfugas de laboratorio se pueden generar campos centrfugos de 1x 109 g. En los procesos de separacin de productos secundarios se utiliza para la concentracin y purificacin de materiales en suspensin, disueltos en fluidos. Cristalizacin. Es la tcnica ms simple y eficaz para purificar compuestos orgnicos slidos. Consiste en la disolucin de un slido impuro en la menor cantidad posible del disolvente adecuado en caliente. En estas condiciones se genera una disolucin saturada que al enfriar se sobresatura producindose la cristalizacin. El proceso de cristalizacin es un proceso dinmico, de manera que las molculas que estn en la disolucin estn en equilibrio con las que forman parte de la red cristalina. El elevado grado de ordenacin de una red cristalina excluye la participacin de impurezas en la misma. Para ello, es conveniente que el proceso de enfriamiento se produzca lentamente de modo que los cristales se formen poco a poco y el lento crecimiento de la red cristalina excluya las impurezas. Si el enfriamiento de la disolucin es muy rpido las impurezas pueden quedar atrapadas en la red cristalina. Para la cristalizacin de debe de considerar lo siguiente: 1) Deber disolver al compuesto en caliente y no en fro; 2) Las impurezas deben ser completamente solubles o insolubles en el disolvente; 3) No deber reaccionar con el material por purificar. Destilacin: a) Destilacin simple La destilacin es un mtodo comnmente usado en la separacin y purificacin de lquidos. Esencialmente consiste en la vaporizacin de la sustancia seguida por la condensacin de vapores y recolecta de ellos en otro recipiente. Diferentes tipos de destilacin se usan dependiendo de los compuestos a separar. Un aparato de destilacin simple se usa para destilar una sola sustancia o para separar lquidos con un intervalo amplio en el punto de ebullicin. La mezcla por separar se coloca en el matraz de destilacin al que previamente se le han colocado perlas de ebullicin o pequeos trozos de tezontle lavados y secados en la estufa a 100 C, se ensambla el aparato (como indica la figura) y se procede a calentar el matraz; el componente ms voltil hierve primero y ms rpidamente; consecuentemente los vapores de la mezcla son ms ricos en este componente, que al pasar por el refrigerante, se condensan y recolectan. Cuando disminuye la proporcin de este componente en la mezcla, el vapor se enriquece con el componente menos voltil; la temperatura del termmetro se incrementa y se utiliza otro matraz para recolectar este componente.

Figura 1. Equipo de destilacin simple b) Destilacin fraccionada 16

En cuando los componentes de la mezcla lquida tienen puntos de ebullicin cercanos, se utiliza una la destilacin fraccionada, un columna de fraccionamiento se empaca con un material inerte (perlas de vidrio, fibra de vidrio o acero etc.) y se coloca en forma vertical al refrigerante, (ver figura 2). El calentamiento de la mezcla en e matraz causa que los vapores ricos en el componente ms voltil pasen a travs de la columna de fraccionamiento, el vapor al tocar el material de relleno fro, se condensa y regresa hasta que toca una parte de la columna que ha elevado su temperatura, entonces vuelve a re-evaporizarse. El nuevo vapor es ms rico en el componente menos voltil. Este proceso de condensacin-revaporizacin se efectuar varias veces a lo largo de la columna y se condensa en el refrigerante. Se observa que una destilacin fraccionada es equivalente a varias destilaciones simples.

Figura 2. Aparato de destilacin fraccionada c) Destilacin a presin reducida Muchos de los productos naturales no pueden ser destilados a presin atmosfrica debido a que se descomponen al acercarse a su punto de ebullicin. Este problema puede ser resuelto a travs de una destilacin a baja presin ya que con ello se evita la descomposicin de la muestra. La presin de vapor de cualquier sustancia es una funcin directa de la temperatura, as, al disminuir la presin dentro del aparato de destilacin se abatir el punto de ebullicin. La destilacin a presin reducida puede realizarse con el rotaevaporador o bien con un equipo para destilacin adaptado a una bomba de vaco. d) Destilacin por arrastre de vapor La destilacin por arrastre con vapor es una tcnica que se emplea para separar sustancias que son insolubles en agua y voltiles, de otras sustancias no voltiles. Es una tcnica aplicada en la separacin de sustancias poco solubles en agua. La destilacin por arrastre de vapor se emplea para separar una sustancia de una mezcla que posee un punto de ebullicin muy alto y que se descomponen al destilar. Tambin se emplea para purificar sustancias contaminadas por grandes cantidades de impurezas resinosas y para separar disolventes de alto punto de ebullicin de slidos que no se arrastran. Este tipo de destilacin se emplea principalmente para la separacin de aceites esenciales (ver figura 3).

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Figura 3. Aparato para destilacin por arrastre de vapor d) Extraccin contnua en Soxhlet Esta forma de separacin de metabolitos secundarios no es propiamente una destilacin pero implica el calentamiento de un solvente de tal forma que entre en contacto con el material biolgico repetidas veces y permite la extraccin de sustancias de inters una vez que el solvente que esta en contacto con el material biolgico ya no presenta coloracin, se considera que se ha llevado a cabo la extraccin total y se termina el proceso, en la figura 4 se muestra el equipo Soxhlet.

Figura 4. Aparato Soxhlet para extraccin de componentes orgnicos

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REACTIVOS Y DISOLVENTES: Acetona, pastillas de ibuprofeno, hojas de eucalipto, u hojas de te de limn, o canela (alumnos), piedras de ebullicin, acetato de etilo, Papel aluminio sulfato de de sodio anhidro, Papel filtro. Materiales y equipo 1 Cristalizador 1 Vaso de precipitados de 50 mL 2 Parrillas elctricas 1 Equipo para determinar el punto de fusin 1 Termmetro 1 Equipo Soxhet 1 Equipo para destilacin a presin reducida o rotavapor 1 Equipo de destilacin por arrastre con vapor 1 Equipo de destilacin simple 3 Matraces Erlenmeyer de 25 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 Probeta graduada de 25ML 1 Probeta graduada de 100 mL 2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Bomba para vaco Mechero Bunsen 3 Embudo de separacin 2 Frasquito con tapa 1 Embudo de tallo recto 1 Matraz bola de 250 mL Piedras de ebullicin 1 Embudo de tallo corto 1 Esptula

PROCEDIMIENTO CRISTALIZACIN Para la cristalizacin de sustancias orgnicas se hace lo siguiente: el slido impuro se disuelve en la mnima cantidad de disolvente caliente. Las impurezas insolubles se eliminan por filtracin de la solucin caliente. Se deja enfriar la solucin lentamente a temperatura ambiente y luego en un bao de hielo o en el refrigerador. En este lapso el material purificado se separa como cristales mientras que las impurezas solubles permanecen en solucin. Los cristales purificados se colectan por filtracin. Cuando hay trazas de contaminantes coloridos, se eliminan aadiendo carbn activado a la solucin caliente antes de filtrar. Para llevar a cabo la cristalizacin de la sustancia activa del frmaco se realizar el procedimiento indicado en la prctica anterior y que se describe a continuacin, utilizando paracetamol en lugar de ibuprofeno: 1. Pesar 1 tableta de frmaco comercial y calcular la cantidad equivalente a 0,5 g de paracetamol. 2. Triturar en un mortero las tabletas necesarias, pesar la cantidad equivalente antes calculada de material pulverizado, guardar cantidad sobrante para determinar punto de fusin, disolver el equivalente a los 0.5 g de paracetamol en 10-20 mL de etanol agitar y filtrar, evaporar el filtrado hasta sequedad calentando en bao mara. Cristalizar el residuo con 10 mL de acetona, separar los cristales, dejar secar al aire y utilizar el residuo como sustancia problema, determinarle el punto de fusin a la pastilla completa (sustancia problema 1-2), al residuo del papel filtro (sustancia problema 2) y a los cristales obtenidos (sustancia problema 1).Determine el punto de fusin del compuesto impuro y del recristalizado. DESTILACIN: a).- Por Arrastre de vapor. Montar el aparato de destilacin por arrastre de vapor, de acuerdo a al figura 3, colocar 700 mL de agua destilada en el matraz no. 1: generador de vapor y agregue cuerpos de ebullicin. En el matraz no. 2 coloque 65 g del hojas cortadas en trozos pequeos o la cantidad 19

equivalente para que se cubran las 3/4 partes del matraz. Al tapar este matraz, cuide que la conexin de vidrio no se obstruya con los trozos del material biolgico; pues de ser as, no habr paso de la corriente de vapor. Caliente con el mechero el matraz no. 1 hasta ebullicin, con el fin de generar el vapor que pasar al matraz no. 2, extrayndose de esta manera el aceite esencial de material biolgico utilizado; el cual es inmediatamente arrastrado por el vapor de agua en un proceso de codestilacin. Suspenda el calentamiento cuando el volumen del destilado sea de 100 o 150 mL aproximadamente; de este codestilado, extraiga totalmente el aceite esencial, mediante extracciones con acetato de etilo en un embudo de separacin, las fases acuosas se desechan y los extractos orgnicos se colectan en un matraz Erlenmeyer o vaso de precipitados, agregue entonces la cantidad necesaria de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente. Elimine el disolvente con el rotavapor, determine el volumen obtenido y el rendimiento. Conservar la muestra obtenida en refrigeracin perfectamente tapada. Con este extracto y los otros que obtenga de los siguientes experimentos, haga una cromatografa en capa fina (c.c.f.) para comparar resultados. b).- Extraccin continua con equipo Soxhlet. Monte el equipo se la figura 4, en el matraz redondo de 500 mL coloque 300 mL de acetato de etilo. Llene el cartucho de celulosa con 6.5 g de t limn cortado en pequeos trozos y colquelo en la cmara de extraccin. Caliente cuidadosamente hasta la ebullicin del acetato de etilo, cuyos vapores debern condensarse en el refrigerante para caer sobre el material biolgico, se considera que una gota por segundo es en el condensado es idnea para la extraccin. En el momento en que la cmara de extraccin se llena con el acetato de etilo, ste cae por diferencia de presiones al matraz. Este proceso se repite continuamente de tal manera que cada vez se extrae mayor cantidad del aceite esencial. El nmero de descargas del extracto puede variar en funcin de la cantidad y calidad de la muestra, suspenda el calentamiento cuando ya no observe coloracin del destilado en la cmara de calentamiento, se dar por terminada la extraccin. Al finalizar, desmonte el equipo, pase a un vaso de precipitados de 500 mL, por medio de decantacin y filtracin el extracto obtenido y squelo con sulfato de sodio anhidro, decante el solvente, concentre a presin reducida con ayuda del rotavapor, hasta que ya no tenga solvente, colquelo en un vial y utilcelo para la c.c.f. comparativa. c).- Extraccin continua directa. Montar el equipo para destilacin simple, con el refrigerante colocado en forma vertical, agregar en el matraz redondo de 500 mL, 300 mL de acetato de etilo y 65 g de t limn cortado en trozos, agregue cuerpos de ebullicin. Caliente a reflujo durante 30 minutos para extraer el aceite esencial (el tiempo de reflujo empieza a partir de que cae la primera gota de disolvente condensado). Desmonte el equipo, decante y filtre el extracto obtenido. Squelo con sulfato de sodio anhidro y decntelo en un matraz limpio y seco. Concentre a presin reducida con ayuda del rotavapor, dejando aproximadamente 5 mL del solvente concentrado. Colquelo en un vial y utilcelo para la cromatografa en capa fina (c.c.p.) comparativa. RESIDUOS Y SU MANEJO Enfriar los trozos de material biolgico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgnicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. REFERENCIAS: Enciclopedia Britnica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33 vila, Z. J., Garca, C. M., Gaviln, I. C. G., Len, F. C., Mndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodrguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Qumica Orgnica. Experimentos con enfoque ecolgico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico. 622 p. Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 20

Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Qumica Orgnica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p.

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INFORME sesin 3. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE DE INTEGRANTES FECHA Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del frmaco trabajado Sustancia Paracetamol Excipientes Pastilla completa *Buscar en bibliografa 2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de rendimiento obtenido al utilizar los tres mtodos de obtencin aceite esencial: Mtodo Arrastre de vapor Extraccin en Soxhet Extraccin destilacion Con los tres tipos de extractos obtenidos realiza una cromatografa en capa fina y discute la calidad de los componentes obtenidos. CUESTIONARIO: 1. En una destilacin a) Cul es la funcin de los cuerpos de ebullicin? b) Por qu no se debe poner ms de la mitad del lquido en el matraz de destilacin? c) Por qu debe colocarse el bulbo del termmetro a la altura del brazo lateral de la T de destilacin? d) En el refrigerante Por qu entra el agua por abajo y sale por arriba? e) Qu precauciones se deben tomar al destilar lquidos muy flamables y voltiles? 2. En qu casos es conveniente aplicar la decantacin para la separacin de fases? 3. Para qu casos aplicara una filtracin por gravedad y cuando es necesario aplicar una filtracin por succin? 4. Qu criterios aplicara para seleccionar el poro del papel filtro que va a emplear en una filtracin? 5. Para qu caso(s) sustituira la filtracin por la centrifugacin? Punto de fusin g de material g aceite esencial Rendimiento Punto de fusin *Tf (terico) Tf (experimental) Observaciones Rendimiento

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Prctica II.- SEPARACIONES CROMATOGRFICAS

2.1.- Cromatografa en capa fina y en papel.

OBJETIVOS: 1.- Determinar por cromatografa en capa fina (TLC por sus siglas en ingls: Thin Layer Chromatography) la composicin de algunos medicamentos analgsicos para determinar los principios activos presentes. 2.- Determinar por cromatografa en papel y en capa fina los pigmentos presentes en los cloroplastos. INTRODUCCIN: La cromatografa en varias de sus modalidades (papel, capa fina, columna, etc.) es un mtodo de separacin y purificacin de compuestos orgnicos que depende de la distribucin de ellos en la fase estacionaria. Para efectuar una separacin cromatogrfica se requiere de una fase estacionaria slida (material adsorbente como almina, gel de slice, carbn o celulosa) y de una fase mvil (eluyente). Se elige el adecuado para efectuar la separacin considerando las solubilidades relativas de los componentes de la mezcla. La muestra se aplica en el adsorbente (en la columna, placa o tira de papel) y luego se deja que pasen a travs del adsorbente los componentes de la mezcla, que se desplazarn dependiendo de su solubilidad relativa en el eluyente y en el adsorbente. Aquellos que son ms solubles y que son menos atrados por la fase estacionaria se desplazarn ms rpido, mientras que componentes insolubles quedan en el punto de aplicacin. Para el caso del papel y placa fina, despus del proceso se tiene como resultado un cromatograma en el cual los componentes separados se revelan, ya sea por su color inherente o por medio de un mtodo fsico o qumico. La cromatografa generalmente se usa como un mtodo cualitativo, pero tambin se puede usar para efectuar anlisis cuantitativo. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Metanol, cloroformo, ter etlico, cido actico, hexano, acetato de etilo, pastillas de analgsicos, cafena, cido acetilsaliclico, iburofeno, paracetamol, hojas de espinaca y acelga, Papel filtro, placas de slica gel para cromatografa con indicador. Materiales y equipo 2 Vaso de precipitados de 50 mL 2 Pipetas Pasteur 1 mortero con pistilo 2 Vidros de reloj 4 tubos de ensaye de 10 mL 10 tubos de ensaye de 5 mL 1 Pipeta de 5 mL 1 Gradilla para tubo de ensaye 1 Pipeta 10 mL 1 Pipeta 1 mL 2 Sopote universal con anillo 2 Vial con tapa 4 Tubos capilares 2 Pinzas para tubo de ensaye 2 Embudo de tallo recto 1 Embudo de tallo corto 1 Esptula 1 Caja Petri de vidrio de 10-15 cm diam. 1 Lmpara de UV

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PROCEDIMIENTO: 1.- CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (ANLISIS DE PASTILLAS DE ANALGSICOS) Los analgsicos comerciales tales como Aspirina, Gelocatil, Neobrufen, Dalsi, Apiretal, Frenadol, Termalgin etc. contienen uno o ms de los siguientes principios activos: Acido acetilsaliclico, ibuprofeno, 4-acetamidofenol (paracetamol) y cafena.

La presencia de alguna de estas molculas se detectar por comparacin con patrones de las sustancias puras. Cada equipo analizar dos pastillas distintas a las que denominar como X e Y, tomar aproximadamente una octava parte de una pastilla y triturarla bien con ayuda del mortero. Introducir el polvo obtenido en un vial. Aadir 1 mL de metanol, agitar con ayuda de una esptula durante un par de minutos y dejar reposar. En una placa de slica gel de 2x5 cm trazar una lnea a lpiz 0.5 cm por encima del borde inferior de la placa (figura 1).

Figura 1. Marcado y colocacin de las muestras en la placa de slica gel.

Sobre la lnea hacer marcas equidistantes etiquetndolas X, A, C, I, P, segn sea las sustancias disponibles. En cada una de esas marcas se agregar independientemente la siguientes substancias: X, el compuesto desconocido; y A, C, I, P las disoluciones patrn de cido acetilsaliclico, Cafena, Ibuprofeno y Paracetamol respectivamente. Utilizar un capilar para realizar la colocacin de la muestra, es importante limpiar el capilar despus de cada muestra introducindolo en un vial con metanol y vaciando su contenido sobre un papel de filtro varias veces. En un vaso de precipitados de 50 mL (cmara cromatogfica) agregar la Mezcla eluyente: Acetato de etilo: Hexano: cido actico, 80:20:1, teniendo cuidado que el nivel del eluyente en la cmara debe de ser menor que la distancia entre el borde inferior de la placa de cromatografa y la lnea trazada con lpiz, introducir cuidadosamente la placa de slica en el vaso de precipitados y taparlo con un vidrio de reloj. Una vez que el eluyente haya alcanzado casi el final de la placa, extraer la placa de la cubeta y trazar una lnea con lpiz sealando el frente del eluyente. Dejar que el eluyente se evapore. Visualizar las manchas con la lmpara de luz ultravioleta (UV). Marcar los contornos de las manchas obtenidas con lpiz. Repetir la operacin para la pastilla Y. Una vez analizadas ambas pastillas completar la tabla siguiente (pregunta al profesor los nombres comerciales de los analgsicos que has analizado) y calcula los Rf de las cuatro sustancias. 24

2.- CROMATOGRAFA EN PAPEL (ANLISIS DE PIGMENTOS DE CLOROPLASTOS) Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones. Aparecern, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o ms, dependiendo del material utilizado) que estarn ms o menos alejados de la disolucin alcohlica segn la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseern diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolucin. Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas o acelgas por separado, quitando las nervaduras ms gruesas, junto con 10 o 15 mL de ter etlico. Triturar sin golpear hasta que el lquido adquiera una coloracin verde intensa (utilizar campana de gases a lo largo de toda la prctica). Filtrar en un embudo con papel filtro y recoger en un tubo de ensayo (es suficiente con 2 o 3 mL. de solucin de pigmentos). Colocar en un frasco de de vidrio metanol absoluto hasta una altura de 0.5 a 1.0 cm. Cortar una tira de papel de filtro para cromatografa, Whatman No. 3, de unos 8 cm de ancho y unos 10 a 15 cm de alto, poner con el capilar en el papel de cromatografa entre 5 y 10 gotas de solucin de pigmentos, espaciadas en el tiempo con el fin de que vaya secndose el ter etlico y aumente la cantidad de pigmentos. Las gotas se pondrn siempre en el mismo punto (marcar con un lpiz), situado a 2 cm por encima del borde inferior del papel. Doblar el papel cromatogrfico a lo largo y colocarlo en la placa de Petri con la mancha de pigmento a 1 cm. de la superficie del eluyente. Cuando el frente del solvente est aproximadamente a 1 cm. del borde superior del papel filtro, retirar el papel y marcar el frente del solvente con lpiz. Determinar el Rf de cada mancha obtenida. Tambin se deber hacer una cromatografa en capa fina, siguiendo las instrucciones dadas en la primera parte de sta prctica. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biolgico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgnicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Residuos de los frmacos, dejar en el papel filtro y depositar en la basura. Minicolumnas utilizadas, dejar que se seque completamente la slica gel y retirarla de la pipeta Pasteur, la cual deber conservarse en un frasco de residuos para su posterior limpieza. Las pipetas Pasteur pueden se lavan para utilizarse posteriormente. REFERENCIAS: Enciclopedia Britnica. 2002. Reino Unido Vol. 3. pp 31-33 vila, Z. J., Garca, C. M., Gaviln, I. C. G., Len, F. C., Mndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodrguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Qumica Orgnica. Experimentos con enfoque ecolgico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico. 622 p. Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Qumica Orgnica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. 25

INFORME sesin 4. TITULO DE LA PRCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1- Escribe en el siguiente cuadro los datos obtenidos para el principio activo del frmaco trabajado Sustancia *terico RF experimental Observaciones

Muestra X Muestra Y Paracetamol Ibuprofeno Cafena Acetilsaliclico *Buscar en bibliografa De acuerdo con los valores de Rf obtenidos y el nmero y tipo de manchas, discute tus resultados. 2.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos detectados para hojas de espinaca y de acelga, da los valores de Rf. Pigmento Color del pigmento Espinaca Acelga Valor de Rf

De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados. CUESTIONARIO: 1. La solubilidad en alcohol de los pigmentos es de mayor a menor: carotenos, clorofila a, clorofila b y xantofila. Indicar qu pigmento corresponde a cada banda. 2. Por qu empleamos ter etlico para extraer la clorofila? 3. Qu pigmentos son los ms abundantes? 4. Por encima de las clorofilas aparece ms de una banda, qu significado tiene?

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2.

SEPARACIONES CROMATOGRFICAS

2.2.- Cromatografa en columna

La cromatografa en columna (CC) es el mtodo ms utilizado para la separacin y purificacin de compuestos orgnicos, slidos o lquidos, a escala preparativa. La fase estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase mvil). La mezcla a separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase mvil atraviesa el sistema (Figura 3). Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo ordenadamente en fracciones de pequeo volumen (1,2,.....) y se analizan por cromatografa en capa fina (CCF). Los productos van saliendo de la columna segn su polaridad, primero salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los ltimos los ms polares por su mayor retencin en la fase estacionaria. El adsorbente ms utilizado para este tipo de cromatografa es gel de slice y en segundo lugar la almina. El tamao de partcula del adsorbente es importante para la separacin y su eleccin depende en gran medida de que la elucin de la cromatografa se realice por gravedad o a media presin (flash chromatography). En una elucin a media presin se pueden emplear tamaos de partcula ms pequeos, que permiten una separacin ms eficaz. Sin embargo, en una elucin por gravedad el uso de tamaos de partcula pequeos impedira el flujo del disolvente. Antes de realizar una separacin en cromatografa de columna hay que elegir adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF.

Figura 3. Montaje de una columna cromatogrfica PROCEDIMIENTO: 4.- CROMATOGRAFA EN COLUMNA (OBTENCIN DE CAROTENOIDES Y PIGMENTOS) Separacin de carotenoides Pesar 1.0 g de chile guajillo seco, eliminando las semillas, cortarlo en trozos pequeos y agregar 10 mL de una mezcla de tolueno-ter de petrleo 1:1; macerar en el mortero y dejar reposar por 10 minutos; decantar el extracto orgnico y concentrar en bao Mara hasta un volumen de 1 mL (en campana de extraccin). Durante el periodo de reposo de la muestra empacar la columna. Para la preparacin de la columna: se toma una una columna de vidrio de 20 cm de longitud por 1.5 cm de dimetro (en caso extremo se puede sustituir por una bureta), se sujeta en el soporte con las pinzas. Se revisa que la llave y funcione correctamente (que no halla fugas) y se mantiene en posicin de 27

cerrado. Se introduce hasta el fondo un pequeo trozo de algodn ayudndose con la varilla de vidrio, se agregan 3 mL de la mezcla eluyente (Tolueno-ter de petrleo, 1:1), se presiona suavemente el algodn para que quede bien colocado y sin burbujas, se prepara una suspensin de 8 g de gel de Slice 60, 63-200 micras en 50 60 ml de mezcla eluyente y se agita durante 5 minutos para eliminar las burbujas. A travs del embudo se vierte la suspensin en la columna golpeando ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme. Se abre la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la gel de Slice. Se podra haber empaquetado en seco, pero teniendo cuidado de que no queden espacios vacos, y luego pasarle disolvente. Abriendo la llave de paso al mismo tiempo; dejar que pase el eluyente hasta que quede un nivel de 1 mL arriba del adsorbente, cerrar la llave y agregar el extracto de Capsicum con ayuda de pipeta Pasteur. Abrir la llave y drenar la columna con Tolueno-ter de petrleo (1:1). Observar la separacin de los pigmentos a medida que se eluye la columna, y recolectarlos en tubos de ensayo o matraces Erlenmeyer de 25 mL para su posterior anlisis cromatogrfico. La separacin del extracto tambin se puede hacer por cromatografa en capa fina, usando en este caso una placa de silica gel de 20 x 20, se aplica el extracto en forma de banda Hacer el mismo procedimiento en otra columna utilizando los extractos de espinaca o acelga obtenidos en la sesin prctica anterior. Debes de re-disolver previamente tu extracto seco en ter etlico. Anlisis cromatogrfico. Una vez que se tiene las fracciones de cada columna, se corren cromatografas en capa fina para identificar los componentes obtenidos, se determinan los valore de Rf. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biolgico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgnicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Slica gel. Se retira de la columna empleando una corriente de aire y recibindolas sobre una toalla de papel se depositan en el recipiente de los residuos de soportes cromatogrficos para su posterior limpieza. Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los contienen y se depositan en frascos etiquetados. Sern utilizados en otras prcticas. REFERENCIAS: vila, Z. J., Garca, C. M., Gaviln, I. C. G., Len, F. C., Mndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodrguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Qumica Orgnica. Experimentos con enfoque ecolgico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico. 622 p. Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Qumica Orgnica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem. Ed. 53 (1): 43. 28

Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988

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INFORME sesin 5. TITULO DE LA PRCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los pigmentos y caraotenoides detectados para hojas de espinaca y de acelga, da los valores de Rf. Pigmento Color del pigmento Carotenoide Espinaca o Acelga Valor de Rf

Menciona el nmero de fracciones obtenidas tanto para el guajillo como para la espinaca o acelga, segn corresponda. De acuerdo al tipo de machas obtenido y a los valores de Rf, discute tus resultados. CUESTIONARIO: 1. Qu ventajas tienen las separaciones cromatogrficas (cromatografa en capa fina y columna) comparadas con otros mtodos de separacin y cules son sus desventajas? 2. En que otras fuentes se pueden encontrar carotenoides adems de las plantas superiores Cul es su funcin en el cuerpo humano?

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Practica III.- ANLISIS PRELIMINAR FITOQUMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS

3.1.- Preliminar fitoqumico

OBJETIVOS 1.- Realizar el anlisis cualitativo de las sustancias qumicas que se obtienen a partir de vegetales y cuerpos fructferos de macromicetos. 2.- Identificar los principales metabolitos secundarios presentes en plantas y hongos. INTRODUCCIN Este anlisis se efecta para determinar los principales grupos de metabolitos presentes en plantas y hongos, los extractos obtenidos se ponen en contacto con diferentes reactivos qumicos y se observan las reacciones de coloracin y/o precipitacin que se obtengan y a partir de ellas se determina la presencia o ausencia de los diferentes metabolitos. Como ciencia, la fitoqumica estudia multitud de compuestos qumicos que se encuentran en la complejidad de las clulas vegetales, pero no slo como entidades qumicas, sino tambin como productos de una serie de mecanismos que intervienen en su biognesis, es decir que aporta elementos importantes para el estudio de la relacin entre estructura qumica y la accin fisiolgica de los metabolitos secundarios. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Metanol, cloroformo, ter etlico, ter de petrleo, tolueno, placas de slica gel para cromatografa, placas de slica gel con indicador. Materiales y equipo Matraz fondo plano de 250 mL Refrigerante 1 mortero con pistilo 20 tubos de ensaye de 10-15 mL 1 Gradilla para tubo de ensaye 1 Pipeta de 5 mL 1 Pipeta 10 mL 1 Pipeta 1 mL 1 Bao Mara 1 Varillas de vidrio PROCEDIMIENTO 25 g de muestra o material biolgico seco y molido (pueden ser hojas, corteza, semilla, etc deuna planta o un cuerpo fructfero de champin, portobello u otro hongo) se colocan en un matraz de fondo plano de 250 a 500 mL, se le agrega etanol procurando que cubra mximo 2/3 partes de su volumen (no olvidar agregar perlas de ebullicin). Se extrae por reflujo durante media hora. El extracto etanlico obtenido despus de filtrar, se concentra en bao Mara. El residuo semislido se usa para los siguientes ensayos: Alcaloides. 31 2 Pipetas Pasteur 1 Parrilla 2 Sopote universal con anillo 2 Viales con tapa 4 Tubos capilares 2 Pinzas de tres dedos 2 Embudo de tallo corto 1 Esptula 1 Lmpara de UV

Se tomar una porcin del extracto y adicionar entre 5 mL a 10 mL de cido clorhdrico al 10%, calentar a ebullicin por cinco minutos, se enfriar y filtrar. Posteriormente dividir el filtrado en 3 tubos de ensaye, uno de los cuales servir como testigo. Tubo 1. Se adiciona una gota del reactivo Dragendorff, la prueba se considera positiva si se forma un precipitado naranja. Tubo 2. Se adiciona una gota del reactivo Sonneschain la prueba se considera positiva si se forma un precipitado naranja. Flavonoides. Se disolver 0.5 mL del extracto en 2mL de etanol absoluto y dividir en tres tubos. El tercero ser el testigo. 1) Reaccin de Shinoda. Adicionar 2 gotas de cido clorhdrico concentrado, si se obtiene una coloracin roja indica la presencia de auronas o chalconas. En caso de haber cambio, se colocar un trozo de magnesio metlico, si se forma una coloracin naranja a rojo, indica la presencia de flavonas; si es rojo flavonoles y si es magenta flavononas. 2) Reaccin de hidrxido de sodio al 10%. Se adicionan 3 gotas de hidrxido de sodio si se forma una coloracin de amarillo a rojo, indica la presencia de xantonas y flavonas; de caf a naranja de flavonoles; de prpura a rojizo de chalconas y azul de antocianinas. Glicosidos Cianogenicos. En un tubo de ensaye con 0.5 mL de extracto, se adicionar 1 mL de cido clorhdrico al 10% y 1 mL de cloroformo. Calentar el tubo en bao Mara colocando en la boca del tubo una tira de papel filtro impregnado con reactivo de Grignard. La formacin de una mancha rosa a rojo indica prueba positiva. Azucares Reductores. Se tomaron 2 mL del extracto, midiendo el pH y adicionando hidrxido de sodio al 10% (si es necesario) hasta tener un pH de 11. Dividir el extracto en dos tubos de ensaye para las siguientes pruebas. 1) Reaccin de Fehling. Se adicionan 0.5 mL de solucin Fehling A y 0.5 mL de solucin Fehling B y 1 mL de agua destilada. 2) Reaccin de Benedict. Se adicionan 0.5 mL de reactivo Benedict y 1 mL de agua destilada. Se preparar un blanco para cada tubo, sin extracto. Se colocar los cuatro tubos en bao mara por 15 minutos. Cuando hay azcares en los tubos que contienen el extracto se forma un precipitado de color naranja a rojo. Saponinas. Prueba de altura y estabilidad de espuma. En un tubo de ensaye se colocar 1 mL de extracto, agitar vigorosamente y se tomar la altura de la espuma, en caso de que se presentara. Se considera positivo si la espuma alcanza un altura de 8 mm a 10 mm y se mantena estable por 30 minutos. Reaccin de Lieberman Bouchard. Se concentran 0.5 mL de extracto hasta 0.2 mL; despus se agregan 2 gotas de actico anhdro y se estratifica con 2 gotas de cido sulfrico concentrado. Al formarse una coloracin azul o verde en la interfase, hay presencia de saponinas esteroidales; si la coloracin es rosa, rojo, magenta o violeta habr presencia de saponinas triterpenoides. Reaccin de Rosenthaler. A otra porcin del extracto concentrado, adicionar dos gotas del reactivo Rosenthaler y estratificando con dos gotas de cido sulfrico concentrado. Si se forma coloracin violeta, se considera positiva para saponinas triterpenoides.

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Taninos. A 1 mL del extracto adicionar 2 mL de agua destilada y 3 gotas de cloruro de sodio al 2%, calentar a ebullicin por un minuto, enfriando y filtrando. Dividir el filtrado en cuatro tubos de ensaye, el cuarto utilizar como testigo. Reaccin con gelatina. Adicionar 2 gotas de reactivo de gelatina. La formacin de un precipitado blanco indica presencia de taninos. Reaccin de Cloruro frrico. Se adiciona una gota de cloruro frrico al 1%, la formacin de coloraciones de azul a negro indica la presencia de derivados del cido glico y coloraciones verdes de derivados del catecol. Al tercer tubo, se agrega una gota de ferricianuro de potasio al 1%. La formacin de una coloracin azul, indica la presencia de compuestos fenlicos. Quinonas. Se colocan 2 mL del extracto en una cpsula de porcelana y se concentra a sequedad, posterior a ello se divide el extracto siruposo en tres porciones. Reaccin de hidrxido de amonio. Se adiciona una gota de hidrxido de amonio concentrado al extracto. Se considera positiva la prueba para antraquinonas al tener la presencia de una coloracin roja que aparece en los dos primeros minutos. Reaccin con cido sulfrico. Se agrega 1 gota de cido sulfrico concentrado a otra porcin del extracto. La formacin de una coloracin roja indica la presencia de antraquinonas. Reaccin de Brntraguer. Se diluye una porcin del extracto con 3 mL de agua destilada, se filtra, al lquido filtrado, se le aaden 3 mL de hidrxido de potasio al 5%; calentando a ebullicin por 3 minutos, enfriando y realizando una extraccin con 3 mL de cloroformo. Se elimina la fase acuosa y a la fraccin clorofrmica se le adicionan 2mL de hidrxido de potasio al 5%. Un color rojo indica la presencia de benzoquinonas; si es amarillo verdoso, adicionar 1 gota de perxido de hidrgeno al 6%. Si la coloracin cambia a roja, se consider positiva para derivados de antrona. Cumarinas. Reaccin de Erlich. Se colocan 0.5 mL de extracto en una cpsula de porcelana, se concentra y se agregan dos gotas de Reactivo Erlich y una gota de cido clorhdrico concentrado. La coloracin naranja, indic presencia de cumarinas. Reaccin con hidrxido de amonio. Se concentra otra porcin del extracto y se le adicionan 0.5 mL de etanol y dos gotas de hidrxido de amonio concentrado. Se considera positiva la prueba si se presenta una fluorescencia azul-violeta. Glicosidos Cardiacos. Se transfieren 2 mL del extracto a una cpsula de porcelana y se concentran a la tercera parte de su volumen original. Se divide en tres porciones en una placa de porcelana con muescas. Reaccin de Legal. Se deja evaporar el disolvente y se adicionan 2 o 3 gotas de piridina, se agrega una gota de nitroprusiato de sodio al 5% y 4 gotas de hidrxido de potasio, una coloracin roja poco estable indica la presencia de glucsidos cardiacos. Reaccin de Baljet. Se adicionan 3 gotas del reactivo Baljet. Una coloracin de naranja a rojo obscuro indica presencia de glucsidos cardiacos. Sesquiterpenlactonas. Reaccin con Hidroximato frrico. Se agrega una porcin del extracto a una cpsula de porcelana, se le adicionan dos gotas de clorhidrato de hidroxilamina 2 N y una gota de hidrxido de potasio 2 N en metanol. Calentar la mezcla a ebullicin de 1 a 2 minutos, enfriar y se llevar a pH de 1 con cido 33

clorhdrico 0.5 N. Se adiciona una gota de cloruro frrico 1%. Las coloraciones roja, violeta o rosa indican que la prueba es positiva para este metabolito. Con los extractos etanlicos obtenidos hacer por duplicado una cromatografa en capa fina y revelar primero una de las placas con luz ultravioleta y la otra con sulfato crico amioniacal. Identificar las manchas obtenidos y calcular el Rf correspondiente. RESIDUOS Y SU MANEJO Retirar los trozos de material biolgico y colocar en bolsa de papel de estraza, posteriormente depositar en la basura. Solventes orgnicos: Recuperar en frascos individuales para destilar y re-usar. Extractos vegetales obtenidos. Se agrega un poco de la mezcla eluyente a los tubos que los contienen y se depositan en frascos etiquetados. Sern utilizados en otras prcticas. REFERENCIAS: vila, Z. J., Garca, C. M., Gaviln, I. C. G., Len, F. C., Mndez, J. M. S., Cendejas, G. Rodrguez, P., Vela, M. A. A., Mendoza, J. S., Santos, A. A. S.,E. S.y Soto, R. M. H. 2001. Qumica Orgnica. Experimentos con enfoque ecolgico. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico. 622 p. Bailey, P. and Bailey Ch.A. 1975. Experimental Chemistry of Contemporary Times. Allyn and Bacon, Inc. USA. 334p. Brewster R.Q., Vanderwerf, C.A. y McEwen, W. E. Curso de Qumica Orgnica Experimental Alambra, Madrid, 1974. Elder, J.W., Abbruzzese, J., Murray, J. y Zielski, M. 1976. Separation of Paprika pigments J. Chem. Ed. 53 (1): 43. Moore J.A. and Dalrymple D.L. Experimental Methods in Organic Chemistry W. B. Saunders USA, 1976 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988

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Apndice 1: Preparacin de reactivos que se utilizaron durante la realizacin del anlisis fitoqumico preliminar. REACTIVO DE WARNER: 1.27g de Yoduro de Potasio aforado a 100mL de agua destilada. CLORURO FERRICO: Sol. al 1% 0.5g de Cloruro Ferrico aforado a 50mL de agua destilada. REACTIVO DE GELATINA: 0.5g de grenetina pura aforado a 50mL de agua destilada. REACTIVO DE BENEDICT: 8.65g de Citrato de Sodio + 5g de Na2CO3 anh. en 30mL de agua destilada se aadi lentamente y agitando + 0.865 CuSO4 en 7.5mL de agua y se afora a 50mL. REACTIVO DE FEHLING: Sol. A: 3.5g de CuSO4 5H2O aforado a 50mL de agua destilada. Sol. B: 17.5g de tartrato de sodio y potasio + 5g de NaOH aforado a 50mL de agua. HIDROXIDO DE SODIO 5%: 2.5g de Hidrxido de Sdio aforado a 50mL de agua destilada. HIDROXIDO DE SODIO 10%: 5g de Hidrxido de sdio aforado a 50mL de agua de agua destilada. REACTIVO DE EHRLICH: 15 mL de cido Clorhdrico concentrado, 25mL de agua destilada, 25 mL de etanol al 95% y 1g de para-dimetilaminobenzaldehido. REACTIVO DE MAYER: 0.1355 g de Cloruro de Mercurio y 2.5 g de Yoduro de Potasio en agua. Aforada a 50 mL. REACTIVO DE ROSENTHALER: 0.5 g de vainillina a 50 mL con etanol. REACTIVO DE GRIGNARD: 0.5g de Carbonato de sodio + 50 mg de cido pcrico y agua hasta 50 mL. HIDROXIDO DE POTASIO 2N: 2.8 g de Hidrxido de potasio en 50 mL de agua destilada. HIDROXIDO DE POTASIO AL 5 %: 2.5g de hidrxido de potasio a 50 mL de agua destilada. FERROCIANURO DE POTASIO AL 1%: 0.5g de Ferrocianuro de potasio en 50 mL de agua destilada. CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA 2N: 1.7375 g en 50 mL de agua destilada. REACTIVO DE SONNESCHAIN: Sol. Saturada de Molibdato de amonio en agua se aade lentamente a una sol. saturada de fosfato disdico a 40 C. se forma un precipitado, este precipitado se lava con agua y se pasa a un vaso donde se agrega una solucin concentrada de carbonato de calcio (puede ser al 40%). NOTA: Se agregan 2.2g de Molibdato de amonio, 1.4g de Fosfato disdico y 20g de carbonato de calcio.

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INFORME sesin 6 TITULO DE LA PRCTICA. NOMBRE DE INTEGRANTES FECHA Resultados 1.- Escribe en la siguiente tabla los datos de los metabolitos secundarios detectados para el material biolgico trabajado Material Metabolito PRUEBA REALIZADA

Para cada metabolito indicar las pruebas que se realizaron y marcar con + presencia y - ausencia Haz una tabla en la que indiques los valores de Rf obtenidos para los extractos trabajados. CUESTIONARIO: 1. Escribe cuales son las principales reacciones qumicas y el mecanismo de reaccin de las mismas, que se presentan en la deteccin de los metabolitos secundarios que identificaste en el prctica. 2. Una vez detectados los metabolitos secundarios que otros mtodos utilizaras para realizar el aislamiento y purificacin de los mismos y como determinaras su estructura qumica?, describe por lo menos tres mtodos a emplear.

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Practica III.- ANLISIS PRELIMINAR FITOQUMICO DE PLANTAS MEDICINALES Y HONGOS

3.2.- Anlisis espectroscpico infrarrojo y resonancia magntica

OBJETIVO El alumno obtendr los espectros de IR y 1HRMN de extractos y sustancias puras y utilizar dichos espectros para caracterizar las substancias trabajadas. INTRODUCCIN: Espectroscopia Infrarroja (IR). El espectro Infrarrojo (IR) de la mayora de los compuestos orgnicos puede dividirse en dos partes: la banda de vibracin, de sustituibles especficos entre 1350 y 4000 cm-1 y las bandas de vibracin del esqueleto hidrocarbonado (C-C y C-H) entre 650 y 1400 cm-1. Aunque algunas bandas en la zona de nmeros de onda bajos pueden correlacionarse con grupos especficos (por ejemplo: C-0 entre 1100 y 1250 cm-1, CH de distintos tipos), estos suelen ser menos sensibles a cambios en el entorno de la molcula. Esta zona (de la impresin digital) se utiliza en general para comparar compuestos. En el anlisis estructural la zona entre 1400 y 4000 cm-1 es de gran utilidad, as las bandas entre 1650 y 1800 cm-1 indican C=O y en estos ltimos, segn el valor exacto puede referirse al tipo de grupo funcional del que forma parte el carbonilo, s se encuentra conjugado, etc. La presencia de dobles enlaces aislados o conjugados y de sistemas aromticos, al igual que los distintos tipos de sustitucin sobre anillos bencnicos, constituye informacin importante que tambin puede obtenerse a partir del espectro de IR.
Resonancia Nuclear Magntica (RMN, por sus siglas en ingls). La espectroscopia RNM, es aplicable a una variedad de problemas qumicos y bioqumicos. Las ventajas principales del mtodo son su naturaleza no destructiva y el hecho de que en muchos casos la informacin obtenida permite la asignacin inequvoca de la estructura de un compuesto ya que a diferencia de los mtodos anteriores, cada seal obtenida puede ser asignada en general a un ncleo (o grupos de ncleos) de la molcula. S bien en un principio la mayora de los estudios de RNM versaron sobre el 1H por su elevada abundancia natural (99.9 %), sensibilidad slo superada por 3H y por poseer spn, los instrumentos modernos que funcionan por el sistema de pulsos y transformadas de Fourier han permitido extender este mtodo a la observacin de cualquier ncleo cuyo spn, sea distinto de cero. Desde el punto de vista de la determinacin estructural de productos naturales, los ncleos generalmente observados son aquellos ms comunes en los compuestos orgnicos es decir 1H y 13C (este ltimo con una abundancia en la naturaleza de 1.1%) ambos de spin 1/2. Un espectro RMN brinda especialmente la siguiente informacin: 1. La posicin de seal (su desplazamiento qumico) que indica las caractersticas del entorno que rodea al ncleo en cuestin. 2.La estructura fina (dada por el acoplamiento spin-spin) que provee informacin sobre la relacin espacial y el nmero de ncleos acclicos con spin distinto de cero. 3.El rea de la seal que es proporcional al nmero de ncleos que constituyen dicha seal.

REACTIVOS Y DISOLVENTES: Acetona, cloroformo, ibuprofeno, paracetamol, extractos de eucalipto, carotenoides, cloroplastos, cloroformo deuterado, DMSO deuterado, agua deuterada. Hojas blancas para impresin (alumno). 37

Materiales y equipo 5 Tubos para resonancia 1 Vaso de precipitados de 50 mL PROCEDIMIENTO. Espectro Infrarrojo: Tomar una fraccin pequea de cada compuesto puro y de cada extracto, disolverlo y agregar unas gotas en el aditamento ATR del espectrmetro de infrarrojo, ayudado del sofware obtener el espectro correspondiente para cada una de las sustancias. Conservar cada espectro obtenido para su posterior anlsis. Espectro de resonancia. Disolver los compuestos puros y los extractos por separado en los disolventes deuterados y colocarlos en los tubos para reonancia respectivos, etiquetar cada tubo. Con ayuda del profesor y siguiendo sus indicaciones colocar los tubos en el equipo de resonancia y obtener el especto caracterstico, conservar la impresin de cada espectro obtenido para realizar el anlisis correspondiente. Retirar el tubo del equipo de resonancia y vaciar el contenido de cada uno de ellos en viales diferentes para su posterior uso. RESIDUOS Y SU MANEJO Debido a que las tcnicas empleadas utilizan cantidades mnimas de disolventes, se dejan evaporar los disolventes en la campana de extraccin. Extractos vegetales y compuestos puros obtenidos. Se colocan en viales etiquetados, se deja que se evapore el disolvente utilizado y se conservan para su utilizacin posterior. Sern utilizados en otras prcticas. REFERENCIAS: Pecsok R. L. y Shields L. D. 1973 Mtodos Modernos de anlisis qumicos. Limusa. Mxico. p, 487 Pavia, D.L., Lampman, G.M. Introduction to Organic Laboratory Techniques W.B. Saunders 1988 Silverstein RM y Webster FX .Spectrometric Identification of Organic Compounds, , 6th ed. John Wiley & Sons Inc. 1998 Espectrmetro de IR Espectrmetro de RMN

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INFORME sesin 7 TITULO DE LA PRCTICA: NOMBRE DE INTEGRANTES: FECHA: Resultados 1.- Fotocopiar e insertar los espectros de RMN obtenidos de compuestos puros y extractos. Con base en el anlisis de los mismos hacer la asignacin de protones para los compuestos puros y comparar con los datos bibliogrficos (reportar un cuadro de datos con los valores obtenidos). 2.- Para los espectros de RMN de los extractos hacer lo mismo y sugerir los posible compuestos que se encuentran presentes en los extractos analizados. 3.- Para los espectros de infrarrojo obtenidos fotocopiarlos y presentarlos en este informe, despus del anlisis correspondiente, indicar los principales grupos funcionales que se encuentran presentes en los compuestos puros y complementar con el espectro de resonancia obtenido, comparar con datos bibliogrficos. 4.- Con los espectros de IR de los extractos identificar los principales grupos funcionales e indicar de que posibles compuestos se trata (apoyarse con los espectros de resonancia obtenidos). CUESTIONARIO: 1. Escribe cuales son las principales ventajas y/o desventajas del usos de la resonancia magntica para la identificacin de productos naturales. 2. Que otros estudios requeriras para caracterizar los compuestos trabajados, descrbelos.

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Prctica IV. DETECCIN DE CIDOS FENLICOS EN TEJIDOS VEGETALES OBJETIVOS: 1.- Identificar a los cidos fenlicos por reacciones cromognicas especficas INTRODUCCIN: Los compuestos fenlicos incluyen un amplio grupo de substancias vegetales que poseen como caracterstica comn un anillo aromtico que contiene uno o ms sustituyentes hidroxilos. Como los compuestos fenlicos son todos aromticos, muestran una intensa absorcin en la regin UV del espectro electromagntico. Los compuestos fenlicos tienden a ser solubles en agua, sin embargo frecuentemente en los organismos vivos se encuentran combinados con azcares como glucsidos y por lo tanto generalmente estn ubicados en las vacuolas de los vegetales. Tanto los fenoles libres como los cidos fenlicos son considerados como grupo nico ya que la mayora de las veces se identifican juntos durante el anlisis fotoqumico de las plantas. Los cidos p-hidroxibenzico, vainllico y sirngico se encuentran usualmente presentes en las angiospermas, sin embargo, en las gimnospermas se ha indicado que el cido sirngico est ausente. Otros cidos como el saliclico o el o-protocatecuco son caractersticos de las Ericceas. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Hojas frescas de angiospermas y gimnospermas (alumno), Acetato de etilo, Acetona, cloroformo, Acido actico, Hidrxido de amonio 2M, cido p-hidroxibenzico, cido vainllico, cido sirngico, cido saliclico, Reactivo de Folin, cido clorhdrico 2 M (500 mL), etanol de 96 Materiales y equipo 5 Tubos para resonancia 2 Matraces Erlenmeyer 250 mL 1 Probeta graduada de 50 mL 2 Vasos de precipitados de 100 mL 2 Vasos de precipitado de 10 mL 1 Embudo de separacin de 150 mL 1 Cmara cromatogrfica con tapa 1 Bao de agua con temperatura controlada 1 Lpiz suave 1 Regla de plstico de 30 cm 1 Vaso de precipitados de 50 mL 1 Soporte Universal y anillo Rotaevaporador Lmpara de Luz UV Cromatoplacas de silicagel de 20X20cm

PROCEDIMIENTO: Colocar hojas (5-10 g aproximadamente) del material vegetal elegido; tambin puede analizarse un helecho o el cuerpo fructfero de un hongo. En cada caso, sumergir los trozos del tejido en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con HC1 2M (cantidad suficiente para que cubra las hojas) y calentar por 1 hora en un bao de agua hirviente. Enfriar, decantar y extraer la fase acuosa con acetato de etilo en el embudo de separacin (3 lavados con 20 mL cada uno). Separar el extracto orgnico y concentrar a sequedad en el rotaevaporador. Disolver cada residuo en 1-2 gotas de etanol de 95%. Analizar por cromatografa en capa fina cada extracto hidrolizado, para ello utilizar placas de slicagel de 25 mm y desarrollar la cromatografa, por duplicado utilizando cido actico-cloroformo (1:9) como eluyente. En las placas cromatogrficas colocar tambin patrones de cidos vainllico, phidroxibenzico y sirngico. Despus de desarrollar las placas, dejarlas secar, observarlas bajo luz ultravioleta y en seguida revelarlas primero con el reactivo de Folin y luego con vapores de amoniaco, adems de otros reveladores indicados por el profesor (Ver apndice 2 para su preparacin). Los cidos aparecern como manchas azules o malva en un fondo blanco con el 40

reactivo de Folin. Verificar la presencia de cido sirngico en el tejido de angiospermas y notar la ausencia de cidos de este tipo en el tejido de plantas inferiores o gimnospermas. RESIDUOS Y SU MANEJO: Residuos de tejidos vegetales. Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Residuos cidos. Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidrxido de potasio 0.1 M y se vierten en el recipiente de residuos acuosos. Acetato de etilo. Se obtiene como producto de la destilacin en el rotaevaporador; puede ser reutilizado si se coloca en un frasco limpio de color mbar. Mezcla eluyente (cido actico: cloroformo). Se ajusta el pH entre 6 y 7 con hidrxido de potasio 0.1 M y se vierte en el recipiente de residuos orgnicos. Gel de slice. Se retira de las placas raspando con una navaja de un filo y se deposita en el frasco de residuos de slica gel para su posterior limpieza y reutilizacin. Este procedimiento se realiza con mascarilla y lentes protectores. REFERENCIAS: Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3ra ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p. Ikan, R. 1991. Natural Products. A laboratory guide. Academic Press, New York. 360 p. Stahl, E. 1969. Thin Layer Chromatography. Springer Verlag. New York. 1041 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoqumica, Manual de prcticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.

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INFORME sesin 8. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- En la siguiente tabla resuma los resultados obtenidos a partir de la cromatografa en capa fina. Especie vegetal Muestra Rfs Estndar Muestra Color Estndar Compuesto probable

2.- Indicar la estructura de los cidos fenlicos empleados como estndar en la prctica. 3.- Realizar la discusin de resultados y comparar con datos bibliogrficos. CUESTIONARIO 1.- Qu importancia tiene el estudio de los cidos fenlicos? 2.- Hacer un diagrama de su ruta biosisnttica de los cidos fenlicos utilizados en al prctica.

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Prctica V. ANLISIS DE PIGMENTOS FLAVONOIDES EN SEMILLAS DEL GNERO Phaseolus OBJETIVO: Aislar e identificar el pigmento flavonoide ms abundante en la testa de semillas del gnero Phaseolus. INTRODUCCIN: Los flavonoides son compuestos que estn considerados dentro del grupo de los compuestos fenlicos, debido a la presencia de anillos aromticos en su estructura. Poseen un esqueleto carbonado C6-C3-C6, en el cual los fragmentos C6 son anillos de benceno que estn unidos por C3. Su estructura puede ser abierta o cerrada. La variacin en el estado de oxidacin del anillo central de pirano de los flavonoides, da lugar a la diferenciacin entre estos compuestos. Se han identificado 14 tipos de flavonoides, los cuales se mencionan a continuacin: flavonas, flavonoles, flavanonas, dihidroflavonoles, chalconas, dihidrochalconas, auronas, isoflavonoides, antocianidinas, leucoantocianidinas, neoflavonoides, biflavonoides, rotenoides y pterocarpanos. Los flavonoides estn distribuidos universalmente en las plantas superiores tanto en angiospermas como en gimnospermas. Tambin estn presentes regularmente en helechos musgos y hepticas. Recientemente se ha reportado su presencia en algas, hongos y bacterias. Por lo general se encuentran en estado libre o como glucsidos o derivados metilados. En el caso de los pigmentos, la glicosilacin es de gran importancia porque los hace solubles en la savia, los protege de la oxidacin enzimtica y los hace fotoestables. Al igual que en las hojas y flores, las antocianinas son las principales contribuyentes en el color de los frutos de las plantas superiores. En algunos casos se encuentran en todo el fruto como en la fresa (pelargonidina), o bien confinadas en el epicarpio como en la manzana (cianidina), o en el jugo del fruto como en las uvas ( delfinidina). En las leguminosas las antocianinas pueden colorear las vainas de algunas especies o la testa de las semillas como en el gnero Phaseolus en donde las diferentes especies presentan pigmentaciones que han sido estudiadas por Feenstra (1960) quien ha aislado las 6 antocianinas ms comunes as como varios flavonol glucsidos. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Semillas de frjol: Phaseolus vulgaris L. y Phaseolus coccineus L (alumno), cido clorhdrico 2M, cido clorhdrico: metanol (1:1) Butanol, cido trifluoro actico, Amoniaco. Materiales y equipo 1 Vaso de precipitados de 10 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Micropipeta 1 Agitador de vidrio 1 Soporte Universal 1 Campana y embudos para filtracin con vaco 2 Cubetas de vidrio para el anlisis espectofotomtrico Espctrofotmetro UV-Vis Rotaevaporador

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PROCEDIMIENTO: Se pesan 25 g de semillas de frjol, se colocan en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se agregan 50 mL de una solucin de cido trifluoroactico en metanol al 3%, dejndolo reposar a 4C por al menos 24 h; filtrar teniendo cuidado que durante el proceso permanezcan las semillas intactas. Concentrar el extracto a presin reducida. Se resuspende la muestra en metanol acidificado con cido clorhdrico al 1%. Se analiza por espectrofotometra UV, Visible y por cromatografa descendente en papel. Para la cromatografa se toma una hoja de papel Whatman No. 3 de 46 x 57 cm y se coloca la muestra en forma de banda. Se desarrolla la cromatografa en forma descendente utilizando butanol: cido actico y agua, 4:1:5, (BAW, por sus siglas en ingls) como mezcla eluyente. (Fase superior). Revelar con luz UV, vapores de amoniaco y revelador (NP) sin dejar pasar mucho tiempo (Ver apndice para su preparacin). Para el anlisis con el espectrofotometra, se utiliza el espectrofotmetro UV-Vis, obteniendo el espectro al hacer un barrido a diferentes longitudes de onda, utiliza como blanco para ajustar el espectro una solucin de metanol acidificado al 1%. RESIDUOS Y SU MANEJO: 1 Granos de frjol. Se colocan en una bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Metanol acidificado y Mezcla eluyente Se ajusta el pH entre 6 y 7 con NaOH 1M y se depositan en el recipiente de residuos orgnicos REFERENCIAS: Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 1. Academie Press. New York.870 p. Goodwin, T. W. 1976. Chemistry and Biochemistry of Pigments. 2da.Ed. Vol. 2 . 1 Academic Press. New York.372 p. Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rded. Chapman & Hall. Londres. 288p. Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed. Springer Verlag. New York. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoqumica, Manual de prcticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.

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INFORME sesin 9. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Obtener el espectro de absorcin graficando los datos de absorbancia contra longitud de onda, revisar datos bibliogrficos e indicar que tipo de compuestos se encuentran presentes en el extracto. 2.- De igual forma escanear el cromatograma en papel obtenido o fotografiarlo y anexarlo a este informe, hacer el anlisis y comparacin con datos bibliogrficos para identificar los tipos de compuestos de los que se trata. 3.- Escribir la posible estructura qumica de los compuestos identificados. 4.- Menciona las ventajas y desventajas de las tcnicas utilizadas para caracterizar los compuestos qumicos. CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los flavonoides en las plantas 2.- Escribe la ruta metablica de los flavonoides y cuales son los principales usos que les ha dado la humanidad.

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Prctica VI. ANLISIS DE ACEITES ESENCIALES DE SEMILLAS DE umbelferas OBJETIVOS: 1.- Obtener aceites esenciales de semillas de umbelferas y su deteccin por cromatografa en capa fina. 2.- Identificar los compuestos voltiles de semillas de umbelferas por reacciones cromgenas. INTRODUCCIN: Los aceites esenciales pertenecen al grupo de los terpenoides. Bajo este trmino se agrupa a una enorme cantidad de sustancias vegetales que tienen como caracterstica fundamental originarse a partir de una ruta biosinttica comn. Todos los terpenoides tienen como punto de partida la molcula del isopreno: CH2 = C (CH3 ) - CH = CH2 y su esqueleto carbnico se constituye a partir de dos o ms de esas unidades de 5 carbonos. En su calidad de terpenoides, los aceites esenciales pueden ser qumicamente divididos en 2 grupos: mono y sesquterpenoides (C10, C15), los cuales difieren en el intervalo de su punto de ebullicin: monoterpenoides entre 140 a 180C y sesquiterpenoides > 200C. Los aceites esenciales son los responsables de los aromas y sabores caractersticos encontrados en muchas plantas. Por ello son comercialmente importantes en la perfumera, la industria de la alimentacin y la medicina. Entre las familias de plantas que son especialmente ricas en aceites esenciales se incluye a las compuestas, pinceas, rosceas, rutceas y umbelferas, estas ltimas sern motivo de estudio en esta prctica. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Semillas de ans (Pinpinella anisum L.), cilantro (Coriandrum sativum L.), comino (Cominum cyminum L.), eneldo (Anethum graveolens L. ), perejil (Pertroselinum crispum L.), Cardamomo (Elleteria cardomomum L. Maton), alcaravea (Carum carvi L.) (alumno), Eter etlico Tolueno, Revelador de anisaldehdo en medio cido*, Revelador vainillina-cido sulfrico*, Revelador 2, 4-dinitrofenilhdrazina* (*ver apndice 2 para su preparacin) Materiales y equipo 2 Pipetas de 1 mL 1 Mortero con pistilo 1 Matraz volumtrico de 25 mL 2 Vasos de precipitados de 10 mL 1 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Probeta de 25 mL 1 Matraz bola de 250 o 500 mL 5 Micropipetas 1 Agitador de vidrio 2 Placas cromatogrficas de silicagel FG254, de 20 X 20 cm. 1 Cmara cromatogrfica con tapa Parrilla elctrica. Estufa de aire forzado Lmpara de luz UV

PROCEDIMIENTO: Moler las semillas en el mortero, cubrirlas con ter y dejar reposar el extracto durante 30 min. Decantar y concentrar el extracto a bao Mara o tomar una placa cromatogrfica y trazar una lnea horizontal, a una distancia de 2 cm. del borde inferior de la placa. Sobre la lnea trazada, aplicar con las micropipetas los extractos por analizar, es decir, apoyando el capilar sobre la lnea. Repetir varias veces la aplicacin de las muestras. Preparar otra placa de la misma manera. Introducir las placas 46

cromatogrficas en la cmara de elusin la cual deber contener la mezcla de tolueno:acetato de etilo 93:7, tapar la cmara y esperar a que el eluyente suba hasta 0.5 cm. del borde superior, (40-60 min. aproximadamente). Sacar las placas de la cmara, marcar inmediatamente con el lpiz la distancia recorrida por la mezcla eluyente y dejarlas secar. Observar las placas bajo luz UV y marcar las manchas. Asperjar la primera placa con el revelador vainillina-cido sulfrico, calentar a 100C durante 10 minutos para desarrollar color. Asperjar la segunda placa con el revelador 2,4-dinitrofenilhdrazina (DNP) y observar las manchas de color naranja, alternativamente la placa se puede asperjar con el revelador de anisaldehdo-cido sulfrico, calentando a 100C por 10 minutos para desarrollar color (Ver apndice para la preparacin de los reveladores). RESIDUOS Y SU MANEJO: Tejido vegetal macerado Se coloca en una bolsa de papel de estraza y se deposita al cesto de la basura. Mezcla de elusin tolueno:acetato de etlo Se vierte en el recipiente de los residuos orgnicos. Gel de Slice Una vez que se tomaron todos los datos se retira la silicagel de la placa raspando con una navaja de un filo y se coloca en el recipiente de desechos de silica gel, para su posterior limpieza y reutilizacin. Tener la precaucin de realizar esta actividad con mascarilla y lentes. REFERENCIAS: Ikan, R. 1991. Natural Prroducts. A Laboratory Guide. Academic Press, New York.360p. Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3rd ed. Chapman & Hall. Londres. 288p. Wagner, H., S. Bladtt. 1996. Plant Drug Analysis A Thin Layer Chromatography Atlas. 2d. Ed. Springer Verlag. New York. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoqumica, Manual de prcticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.

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INFORME sesin 10. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- En el cuadro 1 se presentan los valores de Rf de diferentes aceites esenciales encontrados en semillas de plantas de la familia umbelferas, haz un cuadro con los datos obtenidos en la cromatografa y compara los valores de Rf con el cuadro 1, escribe las conclusiones a las que llegues. Cuadro 1.- Listado e identificacin por Rf y color de algunos de los aceites esenciales presentes en las semillas de las umbelferas en estudio. Rf (X100) COMPUESTO GENERONOMBRE COLOR Y ESPECIE COMUN REVELADOR APROX.

Ans Perejil

Pimpinella anisum

Petroselinum crispum Coriandrum sativum Cilantro Comino Cuminum cyminum Alcaravea Carum-carvi L. Anethum graveolens Eneldo Cardomomo Elleteria cardomomum

85 40 64 30 59 46 43 40

Anetol Anilsaldehdo Apiol Linalol Cuminaldehdo Carvona Carvona Cineol

Naranja-DNP Naranja-DNP Caf-Vainillina Malva-vainillina Naranja-DNP Naranja-DNP Naranja-DNP Azul y violeta Vainillina

2.- Escriba las estructuras qumicas de los compuestos identificados. CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los aceites esenciales en las plantas 2.-. Describe por lo menos 3 mtodos de anlisis que se reportan para el estudio de aceites esenciales 3.- Escribe cual es la ruta metablica de biosntesis de los aceites esenciales.

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Prctica VII. ANLISIS DE ALICINA EN Allium spp. OBJETIVO: 1.- Aislar el compuesto azufrado alicina de Allium spp. INTRODUCCIN: Adems de los aminocidos cistena y metionina que contienen azufre, existen otros compuestos orgnicos comprendidos dentro de los metabolitos secundarios que contienen azufre. Su distribucin dentro del Reino Vegetal es restringida. Muchos de ellos son voltiles y presentan un olor o sabor irritante muy caracterstico, lo que facilita su deteccin durante la extraccin y aislamiento. Dentro de este grupo encontramos a los glucosinolatos, universalmente distribuidos en la familia de las Crucferas y familias relacionadas del orden. Los glucosinolatos son precursores del aceite de mostaza y slo provocan el olor irritante despus de sufrir hidrlisis enzimtica. Ello ocurre cuando el tejido fresco es macerado y la enzima hidroltica, una tioglusidasa conocida como mirosinasa libera los isotiocianatos. Se conocen alrededor de 70 glucosinolatos siendo la mayora derivados alifticos con un remanente con sustituyentes bencilo. La estructura es la misma y el azufre ligado al azcar, que es siempre glucosa. Los glucosinolatos son sintetizados a partir de aminocidos. En cuanto a su funcin en las plantas se sabe que tienen accin antibacteriana, y algunos ejercen atraccin alimenticia a orugas y fidos que se alimentan de crucferas. Por lo que se refiere a los tiofenos, estos ocurren nicamente en la familia Asteraceae. Se encuentran en asociacin con poliacetilenos. El primero que se descubri fue el -tertienil en los ptalos de Tapetes, el cual es un trmero de tiofeno, pero la mayora de los 100 o ms tiofenos descubiertos tienen cadenas laterales que contienen sustituciones acetilnicas. Como tercer grupo de compuestos azufrados podernos mencionar a los sulfuros orgnicos, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en el gnero Allium (ajo). El sabor del ajo, rbano y cebolla se debe a la presencia de estos compuestos. Ellos son inmediatamente reconocidos por su olor pungente y sus propiedades lacrimgenas. Probablemente se encuentran en los tejidos intactos como aminocidos sulfurados. Entre ellos se puede mencionar a la alina y alicina. Este ltimo ha sido aislado en estado puro como un lquido incoloro que contiene aproximadamente un 40% de azufre en su molcula. Se ha demostrado tambin su actividad antibacteriana (Cavallito y Bailey 1944). REACTIVOS Y DISOLVENTES: 1 diente de ajo (alumno), Agua destilada, Etanol, ter etlico, Cloroformo, Metanol, Tolueno, Acetato de Etilo, Diclorometano. Materiales y equipo 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Vaso de precipitados de 250 mL 1 Embudo de tallo largo 1 Agitador 1 Embudo de separacin de 300 mL 1 Mortero con pistilo 1 Congelador 1 Matraz Erlenmeyer de 1 L 1 Probeta de 25 mL Papel filtro Whatman # 1 1 Esptula metlica 1 Frasco de cultivo con tapa Placas de slicagel GF254 de 2X5 y de 20X20 cm. 1 Rotaevaporador

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PROCEDIMIENTO: El diente de ajo picado, se ponen en170 mL de etanol al 95% o 15 mL de amortiguador de fosfatos a pH 6. Se agita por 15 minutos y se filtra. En el caso del extracto etanlico se concentra a presin reducida hasta que todo el etanol sea removido. En el caso de la extraccin con el amortiguador de fosfatos agregar 10 mL de hexano y se prosigue como indica mtodo. En el caso del concentrado etanlico, ste se combina con 25mL de agua + 10 mL de hexano. Posteriormente, se separa la fase orgnica y la fase acuosa se extrae con 4 porciones de 25 mL c/u de ter etlico o diclorometano; el extracto obtenido se guarda en congelacin para separar trazas de agua residual. Se evapora el disolvente en el rotaevaporador obtenindose un lquido incoloro, que corresponde a la alicina. La deteccin de los compuestos de azufre en el extracto de ajo puede hacerse a travs de la tcnica de CCF, para la cual se aplica la muestra segn las tcnicas ya indicadas y se desarrolla, utilizando como mezcla eluyente tolueno:acetato de etilo 100:30 (v/v). Una vez desarrollado el cromatograma se retira de la cmara, se permite la evaporacin del disolvente y se observa bajo la lmpara de UV. Enseguida se puede preparar el revelador con los siguientes reactivos: 1).- Cloruro estao en medio cido y anisaldehdo en medio cido. 2).- Vainillina en medio cido. Ver apndice 2 para la preparacin de estos reveladores. Se revela cada placa con cada uno de los reveladores RESIDUOS Y SU MANEJO: Material vegetal macerado (ajo) Se coloca en una bolsa de papel encerado y se deposita en el cesto de la basura. Etanol, ter etlico, Mezcla eluyente Se colocan en el recipiente de residuos orgnicos Placas cromatogrficas. Retirar la slica, utilizando para ello una navaja de un filo, la cual se deposita en el recipiente slica gel, para su limpieza y posterior reuso. REFERENCIAS: Cavallito, C.J. y Bailey, H.J. 1944. the antibacterial principie of Allium sativum.I. Isolation, physical properties and antibacterial action.J. Am. Chem. Soc. 66:1950. Harborne, J.B. 1983. Phytochemical Methods. Chapman and Hall, Londres. 289 p. Keusgen,M. 1997. TLC Analysis of Allium sativum Constituents. Planta Medica 63: 93- 94. Wagner, H., Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis. Springer Verlag. Berlin. 384 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoqumica, Manual de prcticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.

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INFORME sesin 11. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Indicar el rendimiento de alicina obtenido (escribir los clculos correspondientes) 2.- Indicar Rf experimental y compararlo con el obtenido bibliogrficamente, hacer al discusin correspondiente y escribir conclusiones. 3.- Escriba las estructuras qumicas de la alicina CUESTIONARIO 1.- Describe las principales funciones de los compuestos azufrados en las plantas 2.- Menciona los principales usos que se le dan los compuestos azufrados de las plantas. 3.- Escribe cual es la ruta metablica de biosntesis de los compuestos azufrados.

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Prctica VIII. EXTRACCIN DE CAFENA DE HOJAS DE T NEGRO OBJETIVOS: 1.- Aislar cafena de hojas de t negro. 2.- Caracterizar el producto obtenido por su p.f., pruebas de color y formacin de un derivado. INTRODUCCIN: La cafena es uno de los ms importantes metil derivados naturales de la xantina (1, 3, 7trimetilxantina). La concentracin de este alcaloide, que se encuentra en el caf, t, nuez de cola, mate, etc., vara dependiendo de las condiciones climticas y topogrficas en las que se desarrollan los cultivos de donde se extrae. Se ha encontrado un intervalo de variacin entre 2.0 a 4.6% de cafena en dichos vegetales. La cafena presenta varias acciones farmacolgicas de inters teraputico. Es fisiolgicamente activa produciendo un efecto estimulante sobre el sistema nervioso central (SNC). La popularidad de las bebidas que contienen cafena es parcialmente debida a este efecto; sin embargo, su consumo en exceso puede causar efectos irritantes tales como nerviosismo e insomnio. Adems de su efecto sobre SNC la cafena acta sobre el rin para producir diuresis; estimula el msculo cardiaco y relaja el msculo liso, especialmente el bronquial. REACTIVOS Y DISOLVENTES: Hojas de T Negro Camellia sinensis L. o en su defecto bolsitas de te negro (alumno), Diclorometano, Acetato de plomo al 10%, Agua destilada, Hidrxido de amonio Acetona, Yoduro de potasio, Yodo, Metanol, Acetato de etilo, Agua oxigenada, carbonato de calcio, Papel filtro, cido clorhdrico, Tela de algodn. Materiales y equipo 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Anillo metlico 2 Vasos de precipitados de 400 mL 1 Embudo de vidrio tallo corto 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Vaso de precipitado de 50 mL 1 Embudo de separacin de 500 mL 1Matraz Erlenmeyer de 50 mL 1 Matraz Kitazato de 500 mL 1 Vidrio de reloj 1 Embudo Bchner de 8 cm diam. 1 Agitador de vidrio 1 Recipiente p/bao Mara 1 Pipeta Pasteur 1 Soporte metlico 1 Parrilla de calentamiento 1 Esptula 1 Cpsula de porcelana Balanza analtica Rotaevaporador

PROCEDIMIENTO: Poner a hervir 100 mL de agua destilada en vaso de precipitados de 400 mL. Sumergir en el vaso 10-11 g de hojas de t (cinco bolsitas de t negro) y hervir por 15 min. Enfriar, remover las bolsas de t, exprimindolas con unas pinzas. Aadir 5.0 g de carbonato de calcio y calentar por 5 min. Filtrar la mezcla a un vaso limpio a travs de la tela de algodn y exprimir la tela. Filtrar ahora con vaco en un embudo Bchner para eliminar por complet el residuo de t. Enfriar el filtrado a temperatura ambiente y pasarlo al embudo de separacin; aadir 30 mL de diclorometano y agitar el embudo suavemente, dejar separar las fases, quitar el tapn del embudo y drenar la fase orgnica inferior de la fase acuosa superior. Repetir la extraccin de la fase acuosa con dos porciones ms de diclorometano (30 mL c/u). Evaporar el disolvente en el rotaevaporador. Purificar la cafena cruda 52

con acetona. Dejar secar los cristales. Pesar el producto, determinar su p.f. y efectuar las siguientes pruebas: a).- Poner unos cuantos cristales de cafena en una cpsula de porcelana y aadir 3 gotas de H202 + 3 gotas de HC1. Evaporar a sequedad con calor y aadir 2 gotas de hidrxido de amonio; observar la formacin de un color prpura. (Prueba de la Murexida). b).- Como prueba adicional obtener el espectro UV de la cafena, observndose max a 278 nm. c).- Alternativamente realizar la cromatografa en capa fina utilizando como mezcla eluyente acetato de etilo: metanol: agua (100:13.5:10). Revelar con el revelador de yodo/yoduro de potasio en medio cido (Ver apndice 2 para su preparacin). RESIDUOS Y SU MANEJO: Bolsitas con te negro Se colocan en bolsa de papel de estraza y se depositan en el cesto de la basura. Diclorometano Se deposita en el recipiente de residuos halogenados. Mezcla de etanol:ter etlico y ter de petrleo Se vierten en el recipiente de residuos orgnicos. Residuos de la prueba de Murexida (cido clorhdrico, hidrxido de amonio). Dado que se trata de pequeas cantidades del orden de unos cuantos mililitros, se diluye con agua y se vierte en el recipiente de los residuos acuosos. REFERENCIAS: Harborne, J. B. 1991. Phytochemical Methods. 3a ed. Chapman & Hall. Londres. 288 p. Ikan, R. 1991. Natural Products. A Laboratory guide. Academic Press New York. 293 P. Pavia, D.D., Lampman, G.M. y Kriz, G.S. Jr. 1976. Introduction to Organic Laboratory Techniques. W.B. Saunders Co. Filadelfia. 699 p. Soto, H. M. R. 2007. Fitoqumica, Manual de prcticas. Colegio de Postgraduados Campus Montecillos. 102 p.

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INFORME sesin 12. TITULO DE LA PRCTICA NOMBRE FECHA Resultados 1.- Indicar el rendimiento de cafena obtenido (escribir los clculos correspondientes) 2.- Indicar los valores del punto de fusin, Rf experimental y espectro de la cafena obtenida y compararlo con datos bibliogrficos, hacer la discusin correspondiente y escribir conclusiones. 3.- Escriba las estructura qumica de la cafena y las reacciones qumicas con su mecanismo de reaccin, que se efectan en la la prueba de Murexida. CUESTIONARIO 1.- Mencione fuentes naturales para el aislamiento de cafena, incluyendo la referencia bibliogrfica 2.- Explique el fundamento del proceso de extraccin de cafena 3.- En que se basa el proceso de recristalizacin por par de disolventes 4.- Menciona los principales usos que se le dan a la cafena y sus efectos fisiolgicos. 3.- Escriba cual es la ruta metablica de biosntesis de la cafena.

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APNDICE 2 REVELADORES 1) Natural product's polietilenglicol (NP/PEG) La placa se asperja con una solucin al 1% en metanol (10mL) de: P-etl-aminoster del cido difenil brico (NP), seguido por una solucin al 5% de polietilenglicol 4000 en metanol (8 mL). 2) Reactivo de Libebermann-Burchard. Se aade cuidadosamente 5 mL de anhdrido actico y 5 mL de cido sulfrico concentrado a 50 mL de etanol absoluto previamente enfriado en hielo. El reactivo se usa fresco. La placa se asperja con 10 mL del reactivo y se calienta a 100 C por 510 min. 3) Reactivo de 2,4dinitrofenilhidracina (DNPH). Se disuelve 0.1 g del 2,4-dinitrofenilhidracina en 100 mL de metanol, se aade 1 mL de HCL al 36%. La placa se asperja en 10 ml del reactivo y se evala inmediatamente. 4) Reactivo de Dragendorff (DRG) Solucin a) Se disuelven 0.85 g de nitrato bsico de bismuto en 10 mL de cido actico glacial y 40 ml de agua (con calentamiento y filtracin si es necesario). Solucin b) Se disuelven 8 g de ioduro de potasio en 30 mL de agua. Solucin stock. Solucin a y b se mezclan 1:1. La placa se asperja adicionalmente con 10 mL del reactivo para asperjar: 1 mL de sol. Stock se mezcla con 2 ml de cido actico glacial y 10 mL de agua. El color de las manchas se intensifica cuando la placa se asperja adicionalmente con 10mL de cido sulfrico al 10% en etanol o Nitrito de sodio al 10% en agua. La placa se calienta en la estufa por 5 10 min. 5) Reactivo de vainillina cido sulfrico Solucin I. Vainilla al 1% en etanol Solucin II cido sulfrico al 10% en etanol La placa se asperja con 10 ml de solucin I, seguida de 10 mL de solucin II. La placa se calienta a 110 C por 5 10 min. 6) Revelador de anisaldehdo Anisaldehdo, cido sulfrico, cido actico glacial. Se mezclan en la siguiente proporcin: 10:0.2:0.1 mL. La placa se calienta en la estufa por 5 10 min. 7) Revelador de cloruro estanoso y anisaldehdo. a) Se disuelven 250 mg de SnC12 en 5 mL de HC1 y 5 mL de metanol. b) Se disuelven 0.5 mL de anisaldehdo en 10 mL de cido actico, se aaden 85 mL de metanol y 5 mL de cido sulfrico concentrado, en ese orden. c) La placa de asperja con 10 mL de "a" y enseguida con 10 mL de "b" y se calienta a 110C por 7 min. 8) Revelador de Carr-Price. Solucin al 20% de tricloruro de antimonio en cloroformo o etanol. La placa se asperja con 10-15 mL del reactivo y enseguida se calienta por 5-6 min a 100C. Se evala tanto en UV (365nm) como en visible. Reveladores de Acidos Fenlicos 1) Reactivo de Gibbs Se prepara una solucin de 0.5% de 2,6-dicloroquinona cloroimida La placa de asperja con 10 mL de esta solucin e inmediatamente se expone a vapores de amoniaco. 2) Reactivo de Pauli 55

Sol. A. Se disuelven con calentamiento 450 mg de cido sulfanlico en 4.5 mL de HC1 12N y se diluyen a 50 mL. Sol. B. Se prepara una solucin acuosa al 4.5% de nitrito de sodio en agua. Ambas soluciones se mantienen a 4C. Al momento de asperjar la placa se usan volmenes 1:1 de A y B mas 1 vol. igual de Na2CO3; al 10%. 3) Ferricianuro de potasio-cloruro frrico. Sol. A. Se prepara una solucin acuosa al 1% de ferricianuro de potasio Sol. B. Se prepara una solucin acuosa al 2% de cloruro frrico. Cantidades iguales de A y B se mezclan al momento de asperjar la placa. Los colores se realzan al asperjar la placa con HC1 2N 4) Cloruro frrico Se prepara una solucin al 1-5% de cloruro frrico en HC1 0.5N 5) Reactivo de Folin-Ciocalteu Sol. A. Carbonato de sodio al 20% Sol. B: Reactivo de Folin La placa se asperja primero con sol. A y luego con sol. B., despus de un breve secado. 6) Reactivote Vainillina-cido actico 0.8g de vainillina se disuelven en 40 mL de cido actico glacial y se aaden en 2 mLl de cido sulfrico concentrado. La placa se asperja con 10 mL de la solucin y se calienta por 3-5 min (110C)

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