Jess Alejandro Cornejo Toledo

Por qu secuenciar el ADN?

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FINALIDAD
La secuenciacin nos proporcionar la informacin

bsica necesaria para el estudio de un organismo. El anlisis de la secuencia del ADN es informacin crtica para predecir la secuencia de aminocidos de los productos proteicos, tanto de genes ya conocidos como de los nuevos genes aislados, as como en la deteccin de mutaciones individuales en enfermedades genticas y en el diseo de iniciadores los cuales son utilizados en procedimientos de diagnostico molecular. Adems es un pre-requisito para la obtencin del ADN recombinante y en su manipulacin posterior.
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Mtodos no automatizados
Son el mtodo enzimtico didedoxy descrito por

Sanger y colaboradores y el mtodo qumico descrito por Maxam y Gilbert, difiriendo entre s en la tcnica para generar la escalera de oligonucletidos. En el mtodo enzimtico se utiliza ADN polimerasa que sintetiza un copia marcada complementaria de un molde de ADN. En el mtodo qumico una hebra de ADN marcada es sujeta a un juego de reactivos qumicos especficos de bases.

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 Ambas tcnicas estn basadas en procedimientos

electroforticos en geles desnaturalizantes de poliacrilamida de alta resolucin (geles de secuenciacin) son capaces de resolver hebras de hasta 500 pb.

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Mtodo qumico
Se basa en la degradacin de las cadenas de ADN. Los

cuatro juegos de desoxioligonucletidos son generados al exponer un desoxioligonucletido purificada y marcado en el extremo 3 o 5, a un reactivo que funciona como base qumica especfica, hidroliza el ADN en uno o dos nucletidos especficos al azar.

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 Se basa en la habilidad de la hidrazina, dimetilsulfato,

o cido frmico para modificar especficamente a las bases dentro de la molcula de ADN. Cuando estas molculas son expuestas a la piperidina, se cataliza un rompimiento de la hebra en el sitio donde los nucletidos han sido modificados. La especificidad reside en la primera reaccin con hidrazina, DMS o cido frmico que reaccionan slo con un porcentaje de las bases. La segunda reaccin, es decir la exposicin a piperidina, hidroliza la cadena de manera cuantitativa.

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O S H3C O

O O CH3
R

H3 C N

NH N NH2

+
O R

N N

O R
H3 C

NH
N

NH2

O
NH

R
N

O
NH

R
N N

NH2

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G+A
NH2

NH2 N
N

NH2 N R O N

O
N

N
+

O H

+R
R

R
N

N O

N
H

HN

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C+T
O H N H N H H H3C NH O N O H2N OH O NH H3C NH NH N NH2 HN H2N
+ +

O H3C N R NH2

O H3C NH O H HN R NH2 N R O H NH

+HO

O H3C N R

NH O H

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Mtodo enzimtico
Utiliza terminadores especficos de la elongacin de la cadena de ADN denomindaos 23 didedoxinucleotidostrifosfata dos (ddNTPs). Son incorporados normalmente en una cadena de ADN que est creciendo. Debido a que no tienen 3OH no pueden formar un enlace fosfodiester

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Nuevas tecnologas de secuenciacin

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Pyrosequencing
Un primer es hibridado a

una ampliacin de cadena sencilla por PCR que sirve como base, y es incubado con las enzimas, DNA polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apyrase ademas de los sustratos adenosina 5 fosfosulfato (APS) y luciferin.
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 El

primer dNTP es agregado a la reaccin. La ADN polimerasa cataliza su incorporacin a la cadena, si este es complementario. Cada imcorporacin es acompaada de la liberacin de un grupo PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de nucletidos incorporados.

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 La

ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP en presencia de APS. Este ATP va hacia la luciferasa promoviendo la conde luciferin a oxyluciferin, la cual genera una luz que es proporcional a la cantidad de ATP. La luz es detectada por un detector (CCD) y lo muestra como un pico, su altura es proporcional al nmero de nucletidos incorporados.

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 Apyrase,

una enzima degradadora de nucletidos, posteriormente degrada los dNTP no incorporados. Cuando la degradacin es completa, otro nucletido es agregado

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 La adicin de los dNTPs es hecha secuencialmente.

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Resumen
Tiempo de corrida ~8 horas. Produce cientos de Mb se secuencias. Lee segmentos de 300-400pb. Es la mas madura de las nuevas tecnologas.

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Ilumina Genome Analyzer

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Secuenciacin Ilumina/Solexa

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Sequencing By Synthesis (SBS)

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Imagen mayor en Pseudo-color

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Rendimiento
Cada lnea puede secuenciar de 20-30 millones de

molculas
- 8 lneas, es igual a mas de 240 millones de lecturas.

Lecturas propicias para el recuento de experimentos

basados en 36 pb. Capacidad de lectura de mas de 100pb

- 50Gb de secuencia por corrida

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Hiseq2000
Misma qumica

Celdas ms grandes
Hardware mejorado

- Mejor laser, detector 8 das de corrida para las 2 celdas.

- Todo el genoma en 8 dias

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SOLiD from Applied Biosystems

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Two-base encoding

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Ligation-based extension

Primera deteccin

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Pacific Biosiences

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Novedades

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USOS

Deteccin de mutaciones Mtodo de diagnstico rutinario (relacin entre enfermedad y mutacin puntual)

Secuenciacin de ADNs fsiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias

Diagnstico de enfermedades genticas

Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro

Identificacin de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciacin de genomas

Conocimiento bsico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

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7millons-thousands

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 NHGRI Current Topics in Genome Analysis 2010,Week

5: Next-Generation Sequencing Technologies, February 9, 2010, Elliott Margulies, Ph.D http://www.youtube.com/watch?v=g0vGrNjpyA8&feat ure=related Molecular biology, Lodish Biologa molecular e ingeniera gentica, Luque.

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