Zoonosis Parasitaria

PER
Ministerio de Salud
Instituto Nacional de Salud
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS ZOONOSIS PARASITARIAS
SERIE DE NORMAS TCNICAS N. 32
Lima, 2010
MINISTERIO DE SALUD DEL PER MINISTRO Dr. Oscar Ugarte Ubillz VICEMINISTRO Dr. Elias Melitn Arce Rodrguez INSTITUTO NACIONAL DE SALUD JEFE Dr. Anbal Velsquez Valdivia SUBJEFE Dr. Csar Cabezas Snchez
CENTRO NACIONAL DE SALUD PBLICA Director General Dr. Pedro Valencia Vsquez CENTRO NACIONAL DE PRODUCTOS BIOLGICOS Director General Dr. Alberto Valle Vera CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIN Y NUTRICIN Director General Dr. Wilfredo Salinas Castro
CENTRO NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD Director General Q. F. Rubn Tabuchi Matsumoto CENTRO NACIONAL DE SALUD INTERCULTURAL Director General Dr. Oswaldo Salaverry Garca CENTRO NACIONAL DE SALUD OCUPACIONAL Y PROTECCIN DEL MEDIO AMBIENTE PARA LA SALUD Directora General Dra. Mara del Carmen Gastaaga Ruiz
COMIT EDITOR INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PRESIDENTE Dr. Csar Cabezas Snchez MIEMBROS Lic. Mnica Aguilar Surez Dr. Pedro lvarez Falcon Blga. Elizabeth Anaya Ramrez Q. F. Rosario Belleza Zamora Dr. Walter Curioso Vlchez Estad. Marco Gonzales Noriega Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Claudio Lanata de Las Casas ASISTENTE EDITORIAL Lic. Bertha Huarez Sosa Dr. Percy Mayta Tristn Dr. Edward Mezones Holgun Dr. Jaime Mirando Montero Mg. Graciela Rengifo Garca Dr. Oswaldo Salaverry Garca Dra. Lely Solari Zerpa Dr. Alonso Soto Tarazona Dr. Javier Vargas Herrera CORRECTOR DE ESTILO Lic. Daniel Crdenas Rojas
PER
Ministerio de Salud
Instituto Nacional de Salud
ELABORADO POR: Elizabeth Luz Snchez Roman Csar Gabriel Nquira Velarde Emilia Silvia Vega Chirinos Eduardo Fernando Miranda Ulloa William Marcelino Quispe Paredes Eduardo Renato Ayala Sulca
Serie de Normas Tcnicas N. 32 2. edicin Lima, 2010
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Instituto Nacional de Salud (Per) Manual de procedimientos para el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias. / Elaborado por Elizabeth Luz Snchez Roman, Csar Gabriel Nquira Velarde, Emilia Slvia Vega Chirinos, Eduardo Fernando Miranda Ulloa, William Marcelino Quispe Paredes, Eduardo Renato Ayala Sulca. 2da. ed. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2010. 108p. : tab., ilus. 21 cm. -- (Serie de Norma Tcnica; 32.) 1. ZOONOSIS 2. ZOONOSIS/PARASITOLOGA 3. DIAGNOSTICO SEROLOGICO 4 NORMAS TCNICAS 5. PER I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. Snchez Roman, Elizabeth Luz Nquira Velarde, Csar Gabriel Vega Chirinos, Emilia Silvia Miranda Ulloa, Eduardo Fernando Quispe Paredes, William Marcelino Ayala Sulca, Eduardo Renano Per. Ministerio de Salud Instituto Nacional de Salud. (Lima)
ISBN: 978-9972-857-87-4 Hecho el Depsito Legal en la Biblioteca Nacional del Per N. 2010-16763 2.a edicin, 2010 Tiraje: 1000 ejemplares Ministerio de Salud, 2010 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 431-0410 Telefax: (511) 315-6600 anexo 2669 Pgina web: www.minsa.gob.pe Instituto Nacional de Salud, 2010 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 617-6200 Correo electrnico: postmaster@ins.gob.pe Pgina web: www.ins.gob.pe Diseo y diagramacin: Segundo Eliades Moreno Pacheco Correccin de estilo: Daniel Crdenas-Rojas La versin electrnica de este documento se encuentra disponible en forma gratuita en www.ins.gob.pe Se autoriza su reproduccin total o parcial, siempre y cuando se cite la fuente.
CONTENIDO
INTRODUCCIN....................................................................................... 7 SECCIN 1: GENERALIDADES .............................................................. 9 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Objetivo ........................................................................................... Campo de aplicacin ....................................................................... Responsabilidades .......................................................................... Documentos de referencia .............................................................. Definiciones y abreviaturas ............................................................. 11 11 11 12 13
SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD ......................................... 17 2.1 Del personal de laboratorio ............................................................. 19 2.2 Del ambiente de laboratorio ............................................................ 20 2.3 Accidentes ....................................................................................... 21 SECCIN 3: OBTENCIN DE MUESTRAS ............................................ 23 SECCIN 4: CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS ..................... 31 4.1 Conservacin .................................................................................. 33 4.2 Envo de muestras .......................................................................... 33 SECCIN 5: TCNICA DE INMUNOBLOT PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y CISTICERCOSIS HUMANA .................................... 35 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 Fundamento .................................................................................... 37 Equipos e intrumentos..................................................................... 37 Materiales y reactivos...................................................................... 38 Muestra ........................................................................................... 38 Antgenos ........................................................................................ 38 Procedimiento ................................................................................. 39 Lectura ............................................................................................ 44 Resultados ...................................................................................... 44 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 45
SECCIN 6: TCNICA DE DOBLE DIFUSIN PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y FASCIOLOSIS HUMANA .............. 47 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 Fundamento .................................................................................... 49 Equipos e instrumentos ................................................................... 49 Materiales y reactivos...................................................................... 50 Muestra ........................................................................................... 50 Antgenos ........................................................................................ 50 Procedimiento ................................................................................. 51 Lectura ............................................................................................ 54 Resultados ...................................................................................... 55 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 55
SECCIN 7: TCNICA DE ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA EL DIAGNSTICO DE CISTICERCOSIS E HIDATIDOSIS HUMANA........................................................................... 57 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 Fundamento .................................................................................... 59 Equipos e instrumentos ................................................................... 59 Materiales y reactivos...................................................................... 60 Muestra ........................................................................................... 61 Antgenos ........................................................................................ 61 Procedimiento ................................................................................. 61 Lectura ............................................................................................ 63 Resultados ...................................................................................... 63 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 63
SECCION 8: TCNICA DE AGLUTINACIN DE LTEX PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS HUMANA 8.1 Fundamento .................................................................................... 67 8.2 Equipos e instrumentos ................................................................... 67 8.3 Materiales y reactivos...................................................................... 67 8.4 Muestra ........................................................................................... 68 8.5 Antgenos ........................................................................................ 68 8.6 Partculas de ltex ........................................................................... 68 8.7 Suspensin madre de partculas de ltex ....................................... 69 8.8 Sensibilizacin de partculas de ltex ............................................. 69 8.9 Procedimiento ................................................................................. 69 8.10 Lectura ............................................................................................ 69 8.11 Resultados ...................................................................................... 70 8.12 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 70 SECCION 9: TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS .................................. 71 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 Fundamento .................................................................................... 73 Equipos e instrumentos ................................................................... 73 Materiales y reactivos...................................................................... 73 Muestra ........................................................................................... 75 Antgenos ........................................................................................ 75 Procedimiento ................................................................................. 75 Lectura ............................................................................................ 76 Resultados ...................................................................................... 77 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 77
SECCION 10: TCNICA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS ............................................. 79 10.1 Fundamento .................................................................................... 81 10.2 Equipos e instrumentos ................................................................... 81
10.3 Materiales y reactivos...................................................................... 81 10.4 Muestra ........................................................................................... 83 10.5 Antgenos ........................................................................................ 83 10.6 Procedimiento ................................................................................. 83 10.7 Lectura ............................................................................................ 85 10.8 Resultado ........................................................................................ 85 10.9 Sensibilidad y especificidad de la prueba ....................................... 85 BIBLIOGRAFA......................................................................................... 87 ANEXOS ANEXO A: ZOONOSIS PARASITARIAS .................................................. 89 ANEXO B: MATERIALES PARA OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA ................................................................. 99 ANEXO C: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT ........................................................................ 99 ANEXO D: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA BOBLE DIFUSIN .................................................................. 103 ANEXO E: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA ELISA .. 103 ANEXO F: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA AGLUTINACIN DE LTEX ................................................... 105 ANEXO G: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA IFI ..... 105 ANEXO H: PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACIN INDIRECTA ......................................... 106
INTRODUCCIN
Las zoonosis parasitarias son infecciones transmitidas de los animales al hombre y viceversa. Estas infecciones son ms frecuentes en las zonas ganaderas, sin embargo, algunas zoonosis como la toxoplasmosis estn difundidas en animales domsticos, de abasto y silvestres. En nuestro pas, las zoonosis parasitarias ms importantes son la hidatidosis, la cisticercosis, la toxoplasmosis y la fascioliosis, con tasas de prevalencia muy altas comparadas con otros pases y con el agravante que han dejado de ser exclusivamente rurales, para encontrarse actualmente casos autctonos de zonas urbanas. El diagnstico de estas zoonosis necesita exmenes de laboratorio para su confirmacin, considerando que la demostracin directa del parsito no siempre es posible, por las caractersticas de estas infecciones, es necesario utilizar otras opciones como los exmenes serolgicos, por lo que es conveniente conocer las metodologas apropiadas para cada uno. Este manual tiene como finalidad uniformizar los procedimientos de diagnstico serolgico de las principales zoonosis parasitarias estandarizados en el Laboratorio de Zoonosis Parasitarias del Centro Nacional de Salud Pblica del Instituto Nacional de Salud. En esta segunda edicin se ha considerado, adems de las tcnicas ya existentes, la prueba de ELISA y la tcnica de aglutinacin de ltex para el diagnstico de la hidatidosis humana. Los Autores
seccin
GENERALIDADES
Generalidades
1.1
OBJETIVO
Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico serolgico de las principales zoonosis parasitarias: hidatidosis, cisticercosis, fasciolosis y toxoplasmosis (Anexo A).
1.2
CAMPO DE APLICACIN
Se aplica en los laboratorios de establecimientos de salud que cuenten con personal calificado, instalaciones, equipos y materiales idneos para llevar a cabo el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias (hidatidosis, cisticercosis, fasciolosis y toxoplasmosis) a partir de muestras de pacientes hospitalizados y pacientes ambulatorios.
1.3
RESPONSABILIDADES
1.3.1 El Centro Nacional de Salud Pblica (CNSP) a travs de su Direccin Ejecutiva de Enfermedades Transmisibles es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente manual, de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS). Los jefes o responsables de los laboratorios de salud deben asegurar el control de calidad interno, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificar las acciones, organizar, controlar y cumplir las disposiciones contenidas en el presente manual. El personal mdico, tcnico y operativo es responsable de seguir las especificaciones tcnicas contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicados.
1.3.2
1.3.3
1.3.4
11
MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
1.4
DOCUMENTOS DE REFERENCIA
1.4.1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (1). Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas N. 15. Instituto Nacional de Salud. Manual de bioseguridad en laboratorios de ensayo, biomdicos y clnicos. 3ra ed. Lima: INS; 2005. Serie de Normas Tcnicas N. 18. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos tcnicos para el diagnstico serolgico de la hidatidosis humana. Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas N. 22. Centro Panamericano de Zoonosis. Prueba de doble difusin arco 5 para el diagnstico de la hidatidosis humana. Buenos Aires: OPS; 1979. Nota Tcnica N. 22. Escalante H, Miranda E, Lorca M, Verstegui M., Torres P. La tcnica de Western Blot con antgenos de fluido vesicular de Cyticercus cellulosae para el diagnstico de la cisticercosis. Bol Peru Parasitol. 1995; 11: 26-31. Lorenzo C, Ferreira E, Monteiro K, Roszenzvit M, Kamenetzky L, Garca H, et al. Comparative analysis of the diagnostic performance of six major Echinococcus granulosus antigens in a double-blind, randomized multicenter study. J Clin Microbiol. 2005; 43(6): 2764-70.
1.4.2.
1.4.3.
1.5
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 ALVC: antgeno de lquido vesicular de cisticerco. ATLH: antgeno total de lquido hidatdico. ATF: antgeno total de Fasciola. Anticuerpo: protenas (inmunoglobulinas especficas) producidas por el organismo, en respuesta al ingreso de una sustancia extraa (antgeno). Antgeno: sustancia extraa al organismo que induce la respuesta del sistema inmune. Cercaria: estadio juvenil en los tremtodos digenticos producidos por multiplicacin asexuada dentro de un esporoquiste o de una redia.
1.5.5 1.5.6
12
1.5.7
Cisticerco: forma larvaria (metacstodo) en la familia Taeniidae constitudo por una vescula llena de lquido que contiene un esclex invaginado. DAB: 33 diaminobenzidine. Dilucin: mezcla de una sustancia con una o ms partes de otra (diluyente) que no altera las caractersticas de la primera y reduce su concentracin.
1.5.8 1.5.9
1.5.10 Enfermedad: proceso mrbido con sntomas definidos que afecta a todo el organismo o parte de l. 1.5.11 1.5.12 Enzima: protena que acta como catalizador orgnico sobre un sustrato especfico. Estrbilo: toda la cadena de progltides de la tenia, excluyendo el esclex y el cuello.
1.5.13 Esclex: porcin de la cabeza de una tenia que le sirve como rgano de fijacin para adherirse a la pared intestinal. 1.5.14 Helminto: nombre genrico de los vermes parsitos y que abarca acantocfalos, nemtodos, cstodos y tremtodos.
1.5.15 Hexacanto: larva con seis ganchitos que emergen de los huevos de los eucstodes. 1.5.16 Hidtide: larva (metacstodo) del gnero Echinococcus de aspecto vesicular, llena de lquido y de protoesclices. 1.5.17 Hospedero: organismo en el o sobre el cual vive un parsito. 1.5.18 Hospedero accidental: hospedero circunstancial para un parsito. 1.5.19 Hospedero definitivo: hospedero en el cual el parsito alcanza su madurez sexual. 1.5.20 Hospedero intermediario: hospedero en el cual el parsito desarrolla parte de su ciclo evolutivo, sin alcanzar su madurez sexual. 1.5.21 Identidad inmunolgica: indica determinantes antignicos idnticos. 1.5.22 Infeccin: penetracin y mutiplicacin de un microorganismo en un husped, independientemente de la presentacin de sntomas o de enfermedad manifiesta.
13
1.5.23 Inmunoglobulinas: protena con actividad de anticuerpo especfico responsable de la inmunidad humoral. Existe cinco clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. 1.5.24 1.5.25 kDa: kilodaltons. Larva: progenie en la evolucin de los helmintos y artrpodos, de aspecto muy diferente al del estado adulto.
1.5.26 Mr: masa relativa. 1.5.27 Miracidio: larva ciliada que emerge del huevo de los tremtodes. 1.5.28 Oncsfera: huevo de cstodo que contiene el embrin hexacanto. 1.5.29 Ooquiste: forma qustica que contiene el cigoto resultante de la esporogonia en los Apicomplexa y los cuales pueden estar cubiertos por una envoltura translcida (isospora) o estar desnudos (Plasmodium). 1.5.30 OPD: O-fenilendiamina. 1.5.31 Partculas de ltex: microesferas de ltex cuya superficie tiene la particularidad de unirse covalentemente con las protenas a travs de sus grupos carboxil y amino. 1.5.32 PBS: solucin tampn fosfato. 1.5.33 PBS-T: solucin tampn fosfato-Tween. 1.5.34 PBS-T-L: solucin tampn fosfato-Tween-leche. 1.5.35 1.5.36 1.5.37 Progltida: segmento de la estrbila de los cstodos, que contiene los rganos reproductores masculinos y femeninos. Protoesclices: esclex juvenil que nace a partir de brotes internos (yemacin) en el quiste hidatdico. Quiste hidatdico: estado larval de la tenia del gnero Echinococcus que consiste en una vescula grande que posee una membrana germinal interna, desde la cual los escolex y los quistes hijos avanzan para proyectarse en la vescula. Quiste unilocular: quiste que contiene slo una cavidad.
1.5.38 Quiste multilocular: quiste que contiene muchas cavidades. 1.5.39
14
1.5.40 1.5.41 1.5.42
Redia: estado larval de los tremtodos digenticos y que se forma por reproduccin asexual dentro de un miracidio. SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida y sulfato dodecil de sodio. Ttulo serolgico: cantidad de suero necesaria para producir una reaccin biolgica con otra sustancia, medida generalmente como la mxima dilucin del suero testigo que an mantiene dicha reactividad.
1.5.43 Trofozoto: forma vegetativa activa entre los protozoarios y que se reproduce. 1.5.44 Zoonosis: enfermedad de animales transmisible a los seres humanos.
15
seccin
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
17
Medidas de bioseguridad
Es un conjunto de medidas preventivas, destinadas a proteger la salud y seguridad del personal, durante su trabajo en los laboratorios donde se manipula productos biolgicos y qumicos. El principal producto biolgico que se procesa en las pruebas de diagnstico inmunolgico de las zoonosis parasitarias es el suero sanguneo y, en ocasiones, el lquido cefalorraqudeo. Los laboratorios donde se realizan estas pruebas diagnsticas son de nivel de bioseguridad 2, lo cual implica las siguientes medidas:
2.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO

2.1.1. 2.1.2. Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre, debe vestir mandil, amarrarse el cabello largo o usar gorro y evitar tener brazaletes y collares. Usar guantes, jeringas y agujas descartables o vacutainers. Nunca utilizar slo la aguja para la extraccin de sangre.
2.1.3.
2.1.4. Evitar pipetear fluidos con la boca; preferir el uso de una propipeta para tal fin. 2.1.5 Manipulacin y eliminacin de sangre y sus productos 2.1.5.1. 2.1.5.2. La extraccin, centrifugacin y separacin de los sueros debe realizarse usando guantes descartables. Las agujas usadas no deben devolverse al capuchn de plstico sino colocarlas en leja, junto con las jeringas, en un recipiente metlico o resistente al calor para su esterilizacin en autoclave, luego de lo cual se procede a eliminarse.
19
2.1.5.3.
El operador es responsable de desinfectar el rea de trabajo, antes y despus de cada sesin de trabajo, con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejndolos actuar durante 30 minutos. El cogulo y suero innecesarios, deben eliminarse en un recipiente con desinfectante (por ejemplo una solucin de agua y leja al 5%). Antes de lavarlos, los tubos de prueba, pipetas y lminas portaobjetos pueden descontaminarse sumergindolos en leja.
2.1.5.4.
2.1.5.5.
2.2
DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO

2.2.1 Las paredes y pisos deben ser lisos, de preferencia paredes enchapadas con maylica y pisos de marmolina o cemento, que faciliten la limpieza con soluciones desinfectantes. Los pisos deben limpiarse todos los das con soluciones desinfectantes (pinosan, cresol, entre otros). No se debe barrer en seco ni encerar. Slo se debe eliminar en el sistema de desage, los agentes biolgicos y qumicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados. El ambiente debe ser amplio, con suficiente iluminacin, adecuada ventilacin y con servicios de agua, luz y gas funcionando satisfactoriamente. Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material slido de fcil limpieza y con superficies lisas, impermeables y resistentes a las sustancias corrosivas.
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.3
ACCIDENTES
2.3.1 Inoculacin accidental, cortes o abrasiones y quemaduras pequeas La persona accidentada debe lavarse las zonas afectadas y concurrir al servicio mdico ms cercano, para el tratamiento adecuado del problema. 2.3.2 Ingestin de material posiblemente peligroso La persona acudir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado.
20
2.3.3
Contacto con material sospechoso de poder contener virus de la hepatitis B o virus de la inmunodeficiencia humana, dengue, fiebre amarilla, influenza, entre otros. 2.3.3.1 Lavarse la zona afectada con agua y jabn, favoreciendo el sangrado de la lesin. De ser necesario, cubrir la herida con un apsito. Concurrir al servicio mdico ms cercano para determinar la gravedad y la posible contaminacin con sangre. Informar del competentes. accidente a las autoridades
2.3.3.2
2.3.3.3 2.3.3.4
Tomar una muestra inicial del trabajador, la que ser examinada serolgicamente para determinar la presencia de anticuerpos contra agentes transmisibles por sangre (hepatitis B, VIH, dengue, fiebre amarilla, etc.) Examinar, de la misma manera, una muestra del material con que se contamin el personal. Si la serologa de VIH del trabajador es negativa, este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. La continuidad de la serologa negativa indicar que el trabajador no se contamin.
2.3.3.5 2.3.3.6
21
seccin
OBTENCIN DE MUESTRAS
23
Obtencin de muestras
El suero sanguneo es el material biolgico que comnmente se solicita para los exmenes de las zoonosis parasitarias. Estas muestras se obtienen de sangre venosa, siguiendo el procedimiento que se indica a continuacin. 3.1 3.2 Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesita para obtener la muestra (Anexo B). Si el paciente se encuentra en el laboratorio, hacer que se siente de manera que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyndolo en un pequeo cojn bajo el codo y manteniendo la palma de la mano hacia arriba (Figura 1).
Figura 1. Posicin del paciente para la obtencin de la muestra de sangre
3.3
Si el paciente se encuentra en cama, extender su brazo en una posicin descansada.

25
3.4
El sitio ms adecuado para la extraccin de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde es ms gruesa y visible (Figura 2).
Figura 2. Zona de venopuncin (pliegue anterior del codo).
3.5 3.6
Colocar la ligadura alrededor del brazo y sujetar firmemente los extremos. Con la mano izquierda, tirar del extremo de la ligadura cruzndola y a continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura. De acuerdo con la Figura 3, sta se deber ajustar slo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por la arteria.
Figura 3. Ligadura del brazo
26
3.7 3.8 3.9
Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en que introducir la aguja. Con un pedazo de algodn embebido en alcohol yodado desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin, (Figura 4).
Figura 4. Asepsia de la zona de venopuncin.
3.10
Tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducindola en el centro de la vena, sin titubear, 1-1,5 cm aproximadamente (Figura 5).
3.11
Figura 5. Introduccin de aguja de venopuncin.
27
3.12 Con la mano izquierda tirar hacia atrs el mbolo de la jeringa, muy lentamente. Deber extraer la sangre en la jeringa, hasta completar 5mL, si no obtiene sangre intntelo nuevamente. Verificar la ubicacin de la aguja dentro de la vena. 3.13 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado al haber completado el volumen de sangre requerido. (Figura 6)
Figura 6. Retiro de la aguja de venopuncin.
3.14 Aplicar un pedazo de algodn seco sobre la zona por donde se punz la piel. Sacar la aguja con un movimiento rpido. 3.15 Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodn durante tres minutos, con el brazo extendido. 3.16 Luego de extrada la sangre por venopuncin, retirar la aguja de la jeringa y colocar en un depsito de metal (para autoclavar); vierta lentamente la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y tpelo. Dejar reposar el tubo con la sangre en posicin vertical, en una gradilla, por un lapso de 30 minutos a 2 horas; centrifugar la sangre de 2000 a 2500 r.p.m. durante 5 minutos. Si no dispone de centrfuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separar del cogulo. 3.17 Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta Pasteur. 3.18 Depositar el suero en un tubo limpio y seco, as estar listo para realizar la prueba.
28
3.19 Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, colocar el suero en viales de plstico con tapa rosca, en frasco de Weathon o los del tipo penicilina estril de 5 mL de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y sellarlo con parafilm o cera. 3.20 Codificar el frasco de inmediato (Figura 7).
Figura 7. Codificacin de la muestra.
29
seccin
CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS
31
Conservacin y envo de muestras

4.1 CONSERVACIN
Las muestras contenidas en viales o frasquitos pueden conservarse en refrigeracin (4 C) por perodos cortos (hasta un da) y deben congelarse (Congelador 0 C), si se requiere conservarlas por mayor tiempo, (-20 C o -80 C).
4.2
ENVO DE LAS MUESTRAS

4.2.1 Cuando las muestras no pueden ser procesadas en el mismo laboratorio, o cuando se desea una confirmacin diagnstica, enviarlas a otro laboratorio. Para efectuar el envo de las muestras de suero se debe seguir los siguientes pasos:
4.2.2
4.2.2.1 Colocar los frasquitos con las muestras, rotuladas apropiadamente y en una bolsa plstica, luego acondicionarlas en un contenedor secundario (recipiente de plstico) rodeado de hielo seco o cubos de hielo. 4.2.2.2 Colocar el recipiente secundario en una caja de poliestireno (tecnoport) u otro material que conserve temperaturas bajas. 4.2.2.3 Se debe adjuntar la ficha epidemiolgica envuelta en una bolsa de plstico o una mica. 4.2.2.4 Cerrar y sellar hermticamente la caja trmica. 4.2.2.5 En caso de ser enviado al Laboratorio Referencial Nacional, rotular la caja trmica con los siguientes datos:
33
URGENTE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Calle Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima Telfono: 471-9920; Fax 471-2529 Contiene: MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE
Figura 8. Embalado ideal de sustancias infecciosas para el envo por correo (segn OMS)
34
seccin
TCNICA DE INMUNOBLOT PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y CISTICERCOSIS HUMANA
35
Tcnica de inmunoblot para el diagnstico de hidatidosis y cisticercosis humana

5.1 FUNDAMENTO
5.1.1 Este mtodo permite observar la reaccin de los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes frente al ATLH de E. granulosus o al ALVC deT. solium. Los componentes proteicos de los parsitos, son separados por electroforesis y despus transferidos a una membrana de nitrocelulosa, la membrana es incubada con el suero problema y luego con anti- IgG humano marcado con una enzima. Si el suero tiene anticuerpos, al agregar un sustrato cromgeno adecuado, se origina un producto insoluble que precipita formando bandas en las zonas de las protenas antignicas.
5.1.2
5.2
EQUIPOS E INSTRUMENTOS
5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 Balanza de precisin. Potencimetro. Refrigeradora. Congeladora a -80 C. Sistema de electroforesis vertical. Sistema de electroforesis de transferencia de protenas. Rotador elctrico. Micropipetas de 1-10 L.
37
5.2.9 5.2.11
Micropipetas de 10-100 L. Micropipeta multicanal de 50 200 L.
5.2.10 Micropipetas de 200-1000 L.
5.3
MATERIALES Y REACTIVOS
5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8 5.3.9 5.3.11 Nitrocelulosa con poros de 0,22 m. Placas de plstico divididas en compartimentos. Gel de poliacrilamida (Anexo C). Anti-IgG humano (molcula total) marcado con peroxidasa (titulado). Estndar de peso molecular. Estndar de peso molecular preteido. Perxido de hidrgeno al 30%. Tampn fosfato salino (PBS) (Anexo C). Tampn de lavado (PBS -Tween 20) (Anexo C). Cromgeno: 33 diaminobenzidina (DAB).
5.3.10 Solucin de bloqueo (PBS -Tween-Leche) (Anexo C). 5.3.12 Suero control positivo a quiste hidatdico. 5.3.13 Suero control positivo a cisticerco. 5.3.14 Sueros control negativo.
5.4 5.5
MUESTRA
Suero sanguneo.
ANTGENOS
5.5.1 Antgeno total de lquido de quiste hidatdico (ATLH) liofilizado para diagnstico de hidatidosis El antgeno es reconstituido con tampn Tris/HCl 0,05M; pH 8,0 (Anexo C) en concentracin de 50 mg de peso seco por mL, luego centrifugado a 15 000 rpm por 30 minutos a 4 C. El sobrenadante es conservado a -70 C hasta el momento de su uso.
38
5.5.2
Antgeno total de lquido vesicular de cisticerco (ALVC) liofilizado para diagnstico de cisticercosis El antgeno es reconstituido con tampn Tris/HCl 0,05M; pH 8,0 (Anexo C) al volumen original, luego centrifugado a 15 000 rpm por 30 minutos a 4 C. El sobrenadante es conservado a -70 C hasta el momento de su uso.
5.6
PROCEDIMIENTO
5.6.1 Etapa I: separacin de las protenas del antgeno por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 5.6.1.1 La separacin de los componentes antignicos proteicos por SDS-PAGE es realizada siguiendo la metodologa descrita por Tsang et al. (19831986), empleando un sistema discontinuo en el gel de separacin y en el gel de empaquetamiento. Un sistema vertical (Mini-Protean II Electroforesis Cel, BIO-RAD) resulta apropiado para realizar la separacin de las protenas. Tratamiento de antgenos Los extractos antignicos parasitarios, en este caso ATLH y ALVC, son mezclados separadamente volumen a volumen con la solucin de tratamiento (Anexo C). Los antgenos son entonces sometidos a 100 C en bao Mara por cinco minutos. 5.6.1.3 Preparacin del gel de separacin para el modelo Mini Protean II, BIO-RAD a. Usar dos placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1mm de espesor y dos espaciadores de plstico de 0,75 mm de espesor. b. Limpiar las placas de vidrio con alcohol y luego secarlas. c. Ensamblar las placas, empleando los espaciadores untados con una capa fina de vaselina neutra para unir las placas. d. Preparar el gel a la concentracin de 15% segn la frmula (Anexo C). e. Fijar las placas a un soporte.
5.6.1.2
39
f.
Con ayuda de una jeringa colocar el gel en el espacio de las placas ensambladas hasta 65 mm de altura e inmediatamente completar con agua destilada.
g. Dejar polimerizar el gel a temperatura ambiente por 30 minutos. 5.6.1.4 Aplicacin del gel de empaquetamiento para el modelo Mini Protean II, BIO-RAD a. Con ayuda de una jeringa, eliminar el agua destilada de la parte superior del gel. Secar con papel filtro la superficie del gel de separacin. b. Preparar el gel de empaquetamiento como se indica (Anexo C). c. Agregar el gel de empaquetamiento preparado sobre el gel de separacin, e inmediatamente insertar un peine preparativo de 0,75 mm de espesor, dejando un espacio de 0,5 cm entre el fondo del peine y el gel de separacin. d. Dejar polimerizar el gel a temperatura ambiente por 30 minutos. 5.6.1.5 Preparacin de la electroforesis a. Retirar el peine y lavar las cavidades que deja con tampn Tris-Glicina-SDS (Anexo C). b. Aplicar en la cavidad del gel de empaquetamiento la solucin antignica del parsito: ATLH 40L de solucin a la concentracin de 4g/L de protenas. En el caso de ALVC, 50 L de solucin antignica a la concentracin de 1g/L de protenas. c. En las cavidades del extremo derecho de los geles, colocar 5 L de protenas del estndar de peso molecular y 3l del estndar de peso molecular preteido.
40
d. Adicionar aproximadamente 200 mL de tampn de corrida en el recipiente superior y 300 mL del mismo tampn en el recipiente inferior de la cubeta, para iniciar la corrida electrofortica. 5.6.1.6 Corrida electrofortica a. Conectar los terminales elctricos en la fuente de poder. La electroforesis se efecta a 15 mA por gel. b. Prestar atencin al colorante marcador de corrida. c. Cuando los complejos SDS-protenas entran uniformemente en el gel de separacin o de corrida, la corriente es aumentada a 30 mA por gel. d. Desconectar el sistema cuando el colorante marcador de corrida alcanza la base del gel de separacin (Figura 9).
Figura 9. Equipo para electroforesis en gel de poliacrilamida y perfil proteico de antgenos.
5.6.2
Etapa II: transferencia de protenas del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa 5.6.2.1 Las protenas antignicas son transferidas electroforticamente del gel hacia la membrana de nitrocelulosa con poros de 0,22 m, empleando una cmara de transferencia. Preparacin de la transferencia a. En un recipiente conteniendo tampn de
5.6.2.2
41
transferencia (Anexo C) se coloca el gel sobre una membrana de nitrocelulosa. Estos, a su vez, se colocan entre dos hojas de papel filtro embebidas en el mismo tampn. b. El conjunto de gel, nitrocelulosa y papel filtro se coloca entre dos esponjas de 3 mm de espesor y a su vez todo este conjunto queda sujeto en una pieza plstica con perforaciones en ambos lados (Figura 10). c. A continuacin, este conjunto se coloca en una cmara de transferencia, con el gel ubicado hacia el ctodo y la membrana de nitrocelulosa hacia el nodo.
5.6.2.3
Electrotransferencia a. La electrotransferencia se efecta a voltaje constante de 55 voltios por una hora, variando de 1,5 Amperios a 10C al inicio, hasta 2,05 Amperios a 35 C al final del proceso. Al terminar la electrotransferencia, retirar la membrana de nitrocelulosa y lavar cinco veces por cinco minutos cada una, con PBS 0,01M, pH 7,2. (Anexo C) conteniendo 0,3% de Tween 20 (PBS-T) (Anexo C) y finalmente realizar una lavada ms con PBS sin Tween. Cortar la tira de nitrocelulosa que contiene los patrones de peso molecular y colorear con solucin de tinta China al 1%. A continuacin, cortar la membrana de nitrocelulosa conteniendo las protenas antignicas, en tiras de 3 mm de ancho, y guardar a 20 C entre hojas de papel filtro humedecidos en PBS, hasta el momento de su uso.
b.
c.
d.
42
Figura 10. Transferencia del antgeno del gel a nitrocelulosa mediante electroforesis.
5.6.3
Etapa III: reaccin inmunoenzimtica 5.6.3.1 5.6.3.2 Emplear placas de plstico divididas en compartimentos (Figura 11). Colocar tiras de nitrocelulosa conteniendo el antgeno hidatdico o antgeno de cisticerco (segn requerimiento de diagnstico) en los compartimentos de las placas.
Figura 11. Placa de incubacin para las tiras de nitricelulosa.
43
5.6.3.3
Incubar las tiras en 1 mL de PBS-T conteniendo 5% de leche descremada (PBS-TL) (Anexo C) por 30 minutos a temperatura ambiente y en agitacin. Descartar el PBS-TL y adicionar 1 mL de los sueros problema diluidos 1:100 (en PBS-TL) en cada compartimiento de la placa e incubar por una hora a temperatura ambiente y en agitacin. Lavar las tiras cinco veces durante cinco minutos con PBS-T. Adicionar una solucin de anti-IgG humano marcado con peroxidasa diluido a 1:1000 en PBS-TL e incubar por una hora a temperatura ambiente y en agitacin. Lavar las tiras cinco veces durante cinco minutos cada vez con PBS-T y una vez ms con PBS solo. Revelar la reaccin adicionando una solucin reveladora (5 mg de DAB), 10l de H2O2 (30%) en 10 mL de PBS. Luego de visualizar las bandas, lavar las tiras varias veces con agua deionizada.
5.6.3.4
5.6.3.5 5.6.3.6
5.6.3.7 5.6.3.8
5.6.3.9
5.6.3.10 Dejar secar las tiras a temperatura ambiente y en oscuridad.
5.7
LECTURA
Consiste en visualizar en las tiras de nitrocelulosa, la presencia o ausencia de bandas de precipitacin. En caso de presencia de bandas, anotar sus respectivas masas relativas (Mr) expresadas en kilodaltons (kDa).
5.8
RESULTADOS
5.8.1 El criterio de positividad para el diagnstico de hidatidosis es el reconocimiento de uno o ms pptidos antgnicos de Mr entre 21 y 31 kDa por anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente (Figura 12).
44
200,0 116,2 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4

MW 1
2 3 5 8 9 11 10 12 13 14 15 16 17 19 20
Figura 12. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot. Observar bandas de 21 a 31 kDa
5.8.2
El criterio de positividad para el diagnstico de cisticercosis es el reconocimiento de uno o ms pptidos antignicos de Mr 13,14,17,18,23,24,31,35 kDa por anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente (Figura 13).
5.9
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA Sensibilidad: 98% Sensibilidad: 95% Especificidad: 100% (para cisticercosis) Especificidad: 100% (para hidatidosis)
42 35 31 24 23 18 17 14 13
c+ c-
1 2 3
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Figura 13. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot . Observar bandas de 13 a 35 kDa
45
seccin
TCNICA DE DOBLE DIFUSIN PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y FASCIOLOSIS HUMANA
47
Tcnica de doble difusin para el diagnstico de hidatidosis y fasciolosis humana
6.1
FUNDAMENTO
Es una reaccin de precipitacin antgeno - anticuerpo en un medio semislido (gel), que consiste en detectar en el suero del paciente, anticuerpos contra antgenos parasitarios, y que se evidencia por la formacin de lneas opacas de precipitacin. En este caso, los antgenos de la forma larvaria de Echinococcus granulosus y de la formas juveniles y adultas de Fasciola hepatica.
6.2
6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 6.2.10 6.2.11 Refrigeradora. Estufa de 37 C. Balanza. Potencimetro. Centrfuga. Reloj para control de tiempo. Micropipeta de 20 - 200 L y de 2 a 10 L. Lpiz con punta de diamante. Sacabocados para corte de 1 mm de dimetro. Sacabocados para corte de 2 mm de dimetro. Sacabocados para corte de 6 mm de dimetro. Sacabocados para corte de 10 mm de dimetro. Esptula fina.
49
6.3
6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.3.6 6.3.7 6.3.8 6.3.9 6.3.11 Lminas portaobjetos. Pipetas Pasteur. Pipeta de 5 mL. Placas petri 150 x 20 mm. Frasco Coplin. Papel filtro (Whatman N. 1). Pizeta de 500 mL. Tampn fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Anexo D). Solucin colorante (Anexo D). Gel de agar noble (Anexo D).
6.3.10 Solucin decolorante (Anexo D). 6.3.12 Gel de agarosa (Anexo D). 6.3.13 Suero control positivo a quiste hidatdico. 6.3.14 Suero control positivo a Fasciola hepatica.
6.4 6.5
MUESTRA
Suero sanguneo.
ANTGENOS
6.5.1 Antgeno total de lquido hidatdico de Echinococcus granulosus Resuspender 50 mg de ATLH liofilizado en 1 mL de PBS y conservar en congelacin a -20 C o a 4 C hasta por diez das. Antgeno total (ATF) de Fasciola hepatica Resuspender 50 mg de ATF liofilizado en 1 mL de PBS y conservar en congelacin a -20 C o a 4 C hasta por diez das Antgeno de excresin/secresin (E/S) de Fasciola heptica Cuando se utiliza este antgeno en la prueba de DD2, la concentracin de protenas debe ser 9 g/L.
6.5.1 6.5.1
50
6.6
PROCEDIMIENTO
6.6.1 6.6.2 Utilizar lminas portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm limpios, que fueron sumergidos en alcohol y secos. Rotular en un extremo de las lminas con lpiz punta de diamante, el nmero y fecha correspondiente (Figura 14).
Figura 14. Datos de la lmina portaobjetos
6.6.3
Sobre una superficie nivelada, colocar en la lmina con ayuda de una pipeta, 3,5 mL del gel (Anexo D) licuado en bao Mara (Figura 15).
26/04/97
Figura 15. Colocacin del gel sobre la lmina.
6.6.4 6.6.5
Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente durante diez minutos. Colocar la lmina en cmara hmeda y dejar enfriar por 15 minutos a 4 C.
51
6.6.6
Retirar la lmina de la cmara hmeda y colocarla sobre el diagrama de corte correspondiente (Figura 16).
DD5
DD2
A
6.6.7
Figura 16. Plantilla tamao natural para el corte de agar, A: DD5 y B: DD2.
Cortar en el gel los orificios, utilizando los sacabocados con los dimetros correspondientes. Para DD5: sueros problema (10 mm), suero control positivo (6 mm) y antgeno (1 mm); y para DD2: sueros problema (6 mm), suero control positivo (6 mm) y antgeno (2 mm). (Figura 17). Retirar los geles cortados con una esptula fina evitando daar los bordes de los orificios.
Figura 17. Perforacin de los orificios en el gel.
6.6.8 6.6.9
Colocar la lmina en cmara hmeda. Llenar los orificios respectivos utilizando pipetas Pasteur o pipetas automticas. Para DD5: sueros problema (150 L), suero control positivo (50 L) y antgeno (3 L); y para DD2: sueros problema (50 L), suero control positivo (50 L) y antgeno (6 L). No debe haber burbujas en su interior (Figuras 18 y 19) y el nivel superior debe ser convexo respecto a la superficie del agar.
52
Figura 18. Llenado del orificio del antgeno. (Fuente: OPS).
Carga correcta
Carga insuficiente
Figura 19. Llenado de los orificios de 6 mm con suero control y 10 mm con suero problema. (Fuente: OPS).
6.6.10
Dejar difundir el antgeno y los anticuerpos en el agar de la lmina a temperatura ambiente durante 40 a 48 horas (Figura 20).
Figura 20. Difusin de las muestras en cmara hmeda
53
6.6.11
Finalizada la difusin, sumergir la lmina en tampn fosfato salino (PBS), pH 7,4, a temperatura ambiente, por 36 horas. Durante este perodo, se cambiar cinco veces la solucin de lavado (PBS), en los dos primeros lavados, eliminar de los orificios los posibles precipitados que pudiera haber, para lo cual, con ayuda de una pipeta, se rociar con PBS a presin moderada. Concluido el lavado, sumergir la lmina en agua destilada por diez minutos.
6.6.12
6.6.13 Envolver la lmina en papel filtro Watman N. 1 previamente humedecido en agua destilada. 6.6.14 6.6.15 6.6.16 Dejarla secar en estufa a 37 C por 18 horas. Retirar cuidadosamente el papel que envuelve la lmina, humedecindolo con agua destilada, en caso necesario. Sumergir la lmina en solucin colorante (Anexo D), durante 15 a 20 minutos y observar la banda de precipitacin entre antgeno y suero control; de no existir, dejar la lmina ms tiempo en la solucin y continuar este paso. Escurrir la lmina, enjuagar con agua de cao y volver a escurrir. Sumergir la lmina en solucin decolorante (Anexo D) durante 20 a 30 minutos, hasta obtener una decoloracin satisfactoria en la lmina y apreciar claramente la banda entre el antgeno y el suero control.
6.6.17 6.6.18
6.7
LECTURA
6.7.1 La lectura consiste en observar el nmero de bandas de precipitacin entre los orificios de los sueros problemas y el antgeno. Verificar si alguna de ellas presenta identidad inmunolgica con la banda formada entre el orificio del antgeno y el suero control positivo (Figuras 21 y 22). La prueba es vlida cuando se observa la banda de precipitacin entre el antgeno y el suero control positivo; en caso contrario, la prueba carece de valor y debe repetirse el ensayo.
6.7.2
54
Figura 21. Las muestras aplicadas en los orificios 1,2 y 4 presentan bandas de identificacin del arco 5
Figura 22. Las muestras aplicadas en los orificios 1 y 2 presentan bandas de identificacin del arco 2
6.8
RESULTADOS
Informar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) del Arco 5 en caso de Hidatidosis, arco 2 en caso de fasciolosis. Adems, anotar el nmero total de bandas observadas.
6.9
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA

Sensibilidad: 65% Sensibilidad: 80% Especificidad: 95% (DD5) Especificidad: 95% (DD2)
55
seccin
TCNICA DE ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA EL DIAGNSTICO DE CISTICERCOSIS E HIDATIDOSIS HUMANA
57
Tcnica de ensayo inmunoenzimtico (ELISA) para el diagnstico de cisticercosis e hidatidosis humana

7.1 FUNDAMENTO
La tcnica de ELISA emplea antgenos de lquido vesicular de cisticerco de Taenia solium, (diagnstico de cisticercosis) o lquido de quiste hidatdico de E.granulosus (diagnstico de hidatidosis), adheridos a soportes inertes (placa de microtitulacin) y antigammaglobulinas humanas conjugadas con enzimas como detectores de la reaccin antgeno-anticuerpo, evidenciado por la liberacin de color al actuar el sustrato (Figura 23).
7.2
7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7 7.2.8 7.2.9 7.2.10 7.2.11 7.2.11 Lector ELISA para leer absorbancia a 490 o 492 nm. Lavador de placas ELISA. Estufa de incubacin 37 C. Refrigeradora Congeladora a -80 C. Congeladora a -20 C. Potencimetro. Balanza de precisin. Micropipeta de 0,5-10 L. Micropipetas de 5-50 L. Micropipetas de 10-100 L. Micropipeta multicanal de 50-200 L.
59
7.2.12 Micropipeta de 200 - 1000 L. 7.2.13 Puntas para micropipeta 10 - 200 L. 7.2.14 Puntas para micropipeta 1000 L.
7.3
7.3.1 7.3.2 Placas de microtitulacin de alta adherencia con fondo plano de 96 pozos. Antgenos: 7.3.3 Lquido vesicular de cisticerco (LVC) de T. solium (de diagnstico de cisticercosis). Lquido de quiste hidatdico (LQH) de E. granulosus (de diagnstico de hidatidosis). Suero control positivo a cisticercosis o hidatidosis (segn enfermedad en estudio). Suero control negativo a cisticercosis o hidatidosis (segn enfermedad en estudio).
Sueros: -
7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8 7.3.7 7.3.8 7.3.9 7.3.11
Crioviales de 1,5 mL. Lmina adhesiva para cubrir las placas. Papel absorvente. Guantes de ltex. Hipoclorito de sodio (leja) al 5%. Anti IgG humano (cadena especfico) marcado con peroxidasa. Perxido de hidrgeno al 30%. PBS pH 7,2 (Anexo E). Solucin de bloqueo (PBS-Tween 0,05%-BSA 1% o PBSTween 0,05%-Leche descremada 5%) (Anexo E).
7.3.10 Tampn de lavado (PBS-Tween 0,05%) (Anexo E).
7.3.12 Cromgeno: Ortofenilendiamina (OPD). 7.3.13 Resevorio para micropipeta multicanal. 7.3.14 cido sulfrico 2,5 M (Anexo E).
60
ELISA
Figura 23. Prueba de Elisa.
7.4 7.5
MUESTRA
Suero sanguneo.
ANTGENOS
Solucin antignica de cisticerco: lquido vesicular de cisticerco (LVC) de Taenia solium, a la concentracin de 1g de protenas/L, diluido 1/500 en tampn Tris/HCl 0,01 M, pH 7,5. Solucin antignica de lquido hidatdico: lquido de quiste hidatdico (LQH) de Echinococcus granulosus, a la concentracin de 1g de protenas/L, diluido 1/100 en tampn Tris/HCl 0,01 M, pH 7,5.
7.6
PROCEDIMIENTO
7.6.1 Sensibilizar la placa de microtitulacin colocando 100 L por pozo de solucin antignica (LVC o LQH, item 7.5, segn sea el caso).
61
7.6.2 7.6.3 7.6.4 7.6.5 7.6.6 7.6.7
Cubrir la placa de microtitulacin con tapa o parafilm y luego incubar a 4 C durante toda la noche. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con solucin antignica y vaciar el contenido de los pozos. Bloquear los sitios inespecficos mediante la adicin de 100 L de PBS- Tween 0,05%, leche descremada al 5% en cada pozo. Cubrir la placa e incubar en estufa a 37 C por 30 minutos. Lavar los pozos de la placa adicionando a cada uno de ellos 200 L de PBS-Tween 0,05%, utilizando lavador de microplacas. Repetir el lavado por cuatro veces ms, en el ltimo lavado eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). Siguiendo el esquema de distribucin de sueros (Figura 24 A) aadir en los pozos respectivos lo siguiente: Suero control positivo SCP: diluido 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E), 100 L por pozo (2 pozos) Suero control negativo SCN: diluido 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E), 100 L por pozo (dos pozos) Suero problema SP: diluido a partir de 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E), 100 L por pozo
7.6.8
7.6.9 7.6.10
Cubrir la placa e incubar a 37 C por una hora. Descartar el contenido de los pozos sobre un recipiente conteniendo hipoclorito de sodio al 5%, mediante inversin de la microplaca. Lavar los pozos de la placa al igual que en los tems 7.6.6 y 7.6.7 Colocar en cada pozo 100 L de anti IgG humano peroxidasa HRP diluido 1/1000. Incubar en estufa a 37 C por una hora.
7.6.11 7.6.12 7.6.13
62
7.6.14 7.6.15 7.6.16 7.6.17
Lavar los pozos de la placa al igual que en los tems 7.6.6 y 7.6.7. Colocar en cada pozo de la placa 100 L de la solucin de sustrato, (Anexo E). Dejar en oscuridad a temperatura ambiente por 15 minutos. Detener la reaccin adicionando 25 L de cido sulfrico 2,5 M en cada pozo (Anexo E).
7.7
LECTURA
La lectura debe realizarse con el equipo lector de ELISA, utilizando filtros de 490 nm 492 y un filtro de referencia de 620 630 nm. Para que la reaccin tenga validez, los controles deben reaccionar como tales (Figura 24 B). La presencia o ausencia de anticuerpos ALVC de T.solium o anticuerpos anti-hidatdico de E. granulosus, se determina relacionando la absorbancia de la muestra con el valor de corte. Se ha definido el valor de corte (VC) como el promedio de lectura de los sueros controles no reactivos (XCN) + 2 desviaciones estndar (DS). VC = XCN + 2 DS Reactivo: muestras con absorbancias mayores al valor de corte. No reactivo: muestras con absorbancias igual o menores al valor de corte.
7.8
RESULTADO
Positivo: se detecta la presencia de anticuerpos contra antgenos de cisticerco de T. solium o antgenos de E. granulosus, lectura reactiva. Negativo: no se detecta la presencia de anticuerpos contra antgenos de cisticerco de T. solium o antgenos de E. granulosus, lectura no reactiva.
7.9
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA

Sensibilidad: 98% Especificidad: 60%
63
1 A B C D E F G H B S6 S12 S18 S25 S33 S38 S44
2 B S6 S12 S18 S26 S33 S38 S44
3 S1 S7 S13 S19 S27 S34 S39 S45
4 S1 S7 S13 S19 S27 S34 S39 S45
5 S2 S8 S14 S20 S28 C+ S40 S46
6 S2 S8 S14 S20 S28 C+ S40 S46
7 S3 S9 S15 CS30 S35 S41 S47
8 S3 S9 S15 CS30 S35 S41 S47
9 S4 S10 S16 S21 S31 S36 S42 S48
10 S4 S10 S16 S21 S31 S36 S42 S48
11 S5 S11 S17 S23 S32 S37 S43 S49
12 S5 S11 S17 S24 S32 S37 S43 S49
Figura 24A. Esquema de la distribucin de sueros

B: Blanco C - : suero control negativo C +: suero control positivo S1-S49: sueros problema
Figura 24B. Placa de reaccin de ELISA REACTIVO NO REACTIVO
64
seccin
TCNICA DE AGLUTINACIN DE LTEX (AL) PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS HUMANA
65
Tcnica de aglutinacin de ltex (AL) para el diagnstico de hidatidosis humana

8.1 FUNDAMENTO
Esta tcnica emplea partculas de ltex (como soporte), sensibilizadas con antgeno hidatdico, que al ser enfrentadas con suero que contiene anticuerpos especficos aglutinan evidenciando la reaccin antgenoanticuerpo (Figura 25 A).
8.2
8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.2.6 8.2.7 Balanza. Bao Mara. Rotador de placas. Potencimetro. Refrigeradora. Congeladora a -80 C. Reloj para control de tiempo.
8.3
8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.4 8.3.5 8.3.6 Partculas de Ltex de poliestireno de 0,25 m de dimetro. Micropipetas de 0,5 a 10 L. Micropipeta multicanal de 5 a 50 L. Puntas para micropipetas 10 - 200 L. Placas de vidrio fondo oscuro. Tampn glicina pH 8,2 (ver Anexo).
67
8.3.7 8.3.8
Suero control positivo a hidatidosis. Suero control negativo a hidatidosis. AL
Ltex
Antgeno
Ltex sensibilizado
Ltex sensibilidad
Anticuerpos especficos
Aglutinacin
Figura 25A. Prueba de aglutinacin de ltex
8.4 8.5
MUESTRA
Suero sanguneo inactivado a 56 C en bao mara por 30 minutos.
ANTGENO
El antgeno utilizado para esta prueba se prepara a partir de lquido de quiste hidatdico de E. granulosus liofilizado. Para sensibilizar las partculas de ltex se utiliza solucin antignica a una concentracin de 2 mg de protenas (ATLH) por mL de tampn glicina pH: 7,2
8.6
PARTCULAS DE LTEX: se emplean partculas de ltex de

poliestireno de aproximadamente 0,25 m de dimetro promedio. Estas partculas se adquieren comercialmente en una suspensin al 10,2% (Bangs Laboratories, Inc).
68
8.7
SUSPENSIN MADRE DE PARTCULAS DE LTEX Se prepara diluyendo la suspensin comercial en 1:8 con tampn glicina pH 8,2.
8.8
SENSIBILIZACIN DE LAS PARTCULAS DE LTEX

Para sensibilizar las partculas de ltex con ATLH se mezcla: 3 mL de tampn glicina pH 8,2, ms 1 mL de la solucin antignica (tem 8.5) y se aade 0,6 mL de la suspensin madre de partculas de ltex.(tem 8.6). Luego se agita y se incuba primero a 37 C por 30 minutos y luego a 4 C por 24 horas.
8.9
PROCEDIMIENTO
8.8.1 En una placa de aglutinacin, colocar 20 L de partculas de ltex sensibilizadas con ATLH, ms 20 L de suero problema y mezclar ambos reactivos con ayuda de un palito mondadientes. Luego agitar suavemente por rotacin, balanceando la placa durante ocho minutos y finalmente realizar la lectura. En caso de que la reaccin no muestre aglutinacin a los ocho minutos, espera hasta 15 para dar el resultado definitivo.
8.8.2 8.8.3
8.10 LECTURA
La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la aparicin de pequeos grumos de aglutinacin de las partculas de ltex y que representa la formacin del complejo antgeno-anticuerpo especfico, en tanto que, la falta de reactividad (negativo) se manifiesta por la permanencia de suspensin de las partculas al no estar presente anticuerpos especficos en el suero del paciente.
Reaccin positiva
Reaccin negativa
Figuras 25B. Reaccin de aglutinacin de ltex
69
8.11 RESULTADOS
POSITIVO: cuando se detecta la presencia de anticuerpos especficos contra quiste hidatdico de E.granulosus. NEGATIVO: ausencia de anticuerpos especficos contra quiste hidatdico de E. granulosus.
8.12 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA

Sensibilidad: 98% Especificidad: 90%
70
seccin
TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS
71
Tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para el diagnstico de toxoplasmosis

9.1 FUNDAMENTO La tcnica de inmunofluorescencia indirecta, emplea como antgeno a trofozoitos de Toxoplasma gondii fijados en lminas, sobre las que se realiza la reaccin antgeno-anticuerpo. La formacin de este complejo es evidenciada por una antigamaglobulina humana marcada con fluorescena (Figura 26). 9.2 EQUIPOS E INSTRUMENTOS 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.2.4 9.2.5 9.2.6 9.2.7 9.2.8 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3 Microscopio de fluorescencia. Estufa a 37 C. Balanza. Potencimetro. Refrigeradora. Congeladora a -70 C. Reloj cronmetro. Secador o ventilador. Placas para microtitulacin, fondo en U. Micropipetas de 5 - 50 mL. Puntas de 10 - 200 mL.
73
9.3.4 9.3.5 9.3.6 9.3.7 9.3.8 9.3.9
Frasco Coplin. Pizetas. Papel toalla o secante. Laminilla cubre objetos de 24 x 48 mm. Cmara hmeda. Lminas IFI recubiertas con suspensin de trofozoitos de T. gondii.
9.3.10 Suero control positivo a T. gondii. IFI
PRIMERA ETAPA
ANTGENO DE TOXOPLASMA
COMPLEJO Ag-Ac
SEGUNDA ETAPA
COMPLEJO Ag-Ac
ANTIGAMAGLOBINA MARCADA CON FLUOROCROMO
COMPLEJO Ag-Ac MARCADA
Figura 26. Prueba de inmunofluorescencia indirecta
74
9.3.11
Suero control negativo a T. gondii.
9.3.12 Anti-IgG humano marcado con Isoticianato de fluorescena (FITC). 9.3.13 Tampn fosfato salino pH 7,4 (Anexo F). 9.3.14 Solucin diluyente de suero (Anexo F). 9.3.15 Solucin diluyente de conjugado (Anexo F). 9.3.16 Glicerina tamponada pH 8,5 (Anexo F). 9.3.17 Agua destilada. 9.3.18 Solucin de Azul de Evans (Anexo F). 9.4 9.5 MUESTRA Suero sanguneo. ANTGENO Trofozoitos de T. gondii cultivados en exudado peritoneal de ratones infectados experimentalmente y tratados con formol al 2%, son fijados en lminas IFI a concentracin de 40 parsitos por campo microscpico cuando son observados a 40X de aumento. 9.6 PROCEDIMIENTO 9.6.1 Retirar del congelador las lminas recubiertas con el antgeno y dejarlas secar a temperatura ambiente o hacerlo con ayuda de un secador elctrico. Siguendo el esquema de distribucin de sueros (Figura 27), aadir en las reas circulares respectivas 15 L de los controles diluidos 1/10 y 15 L de los suro problema diluidos en 1/16 a 1/2048.
9.6.2
Figura 27. Suero control positivo CP: 15 L diluido 1/16 (en solucin diluyente). Suero control negativo CN: 15 L diluido 1/16 (en solucin diluyente). Suero problema SP:15 L diluido a partir de 1/16 (en solucin diluyente).
75
9.6.3 9.6.4
Colocar la lmina en cmara hmeda e incubar a 37 C por 30 minutos. Lavar las lminas con PBS tres veces consecutivas, para retirar el suero de los pozos, la segunda y tercera por inmersin durante diez minutos cada vez, en frasco Coplin y en agitacin. Escurrir los bordes de la lmina con papel filtro y dejar secar a temperatura ambiente. Agregar 15 mL de anti-IgG humano marcado con fluorescena (titulado y diluido en solucin diluyente de conjugado) en cada rea circular e incubar a 37 C por 30 minutos.Lavar y secar como en 9.6.4 y 9.6.5. Colocar gotas de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla. Observar con un microscopio de fluorescencia a 40X de aumento.
9.6.5 9.6.6
9.6.7 9.6.8 9.7
LECTURA Revisar al microscopio de fluorescencia las reas circulares con los sueros controles positivo y negativo. En el suero control positivo debe observarse toda la superficie del parsito de un color verde amarillento fluorescente (Figura 28A) y en el suero control negativo se observar el parsito de color rojizo opaco (Figura 28B).
Figura 28A. Suero positivo.
Figura 28B. Suero negativo.
76
9.8
RESULTADOS POSITIVO: se detecta la presencia de anticuerpos anti T. gondii evidenciados por la fluorescencia del parsito (color verde amarillento) NEGATIVO: no se detecta la presencia de anticuerpos anti T. gondii evidenciado por la ausencia de florescencia del parsito (color rojizo opaco).
9.9
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA Sensibilidad: 95% Especificidad: 100%
77
seccin 10
TCNICA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI) PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS
79
Tcnica de hemaglutinacin indirecta (HAI) para el diagnstico de toxoplasmosis
10.1 FUNDAMENTO Esta tcnica emplea glbulos rojos de carnero tratados con cido tnico como soporte del antgeno de T. gondii. Los glbulos rojos sensibilizados con el antgeno, aglutinan formando una malla cuando se les enfrenta a un suero que contiene los anticuerpos correspondientes (Figura 29). 10.2 EQUIPOS E INSTRUMENTOS 10.2.1 Balanza. 10.2.2 Potencimetro. 10.2.3 Refrigeradora. 10.2.4 Congeladora a -70 C. 10.2.5 Reloj para control de tiempo. 10.3 MATERIALES Y REACTIVOS 10.3.1 Placas de microtitulacin con fondo U. 10.3.2 Micropipetas de 5 a 50 L. 10.3.3 Micropipeta multicanal de 5 a 50 L. 10.3.4 Puntas para micropipetas 10 200 L. 10.3.5 Solucin Alsever (Anexo G).
81
10.3.6 Sangre de carnero. 10.3.7 Suero fisiolgico (Anexo G). 10.3.8 Tampn fosfato salino pH 7,2 (Anexo G). 10.3.9 Tampn fosfato salino pH 6,4 (Anexo G). 10.3.10 cido tnico (Anexo G). 10.3.11 Solucin diluyente (Anexo G). 10.3.12 Suero control positivo a T. gondii. 10.3.13 Suero control negativo a T. gondii. HAI
Figura 29. Prueba de hemoaglutinacin indirecta.
82
10.4 MUESTRA Suero sanguneo inactivado a 56 C en bao Mara por 30 minutos. 10.5 ANTGENOS Extracto antignico de T. gondii preparado a partir de parsitos obtenidos de exudado peritoneal de ratones infectados experimentalmente en el laboratorio. 10.6 PROCEDIMIENTO 10.6.1 Suspensin de hemates 10.6.1.1 Obtener sangre estril de carnero mediante puncin de la vena yugular en un recipiente tambin estril conteniendo solucin Alsever (v:v). Emplear partes iguales de sangre y Alsever. 10.6.1.2 Lavar los glbulos rojos por tres veces con suero fisiolgico, centrifugando a 3000 r.p.m. durante diez minutos. 10.6.1.3 Preparar una suspensin de glbulos rojos al 2,8% en tampn fosfato pH 7,2. Ejemplo: para preparar 5mL de suspensin de glbulos rojos, tomar 0,14 mL del sedimento de glbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL de tampn fosfato, pH 7,2. 10.6.2 Adsorcin de anticuerpos heterfilos 10.6.2.1 Adicionar 0,2 mL de suero problema a 0,2 mL de suspensin de glbulos rojos, 10.6.2.2 Incubar a 37 C por 30 minutos (bao Mara). 10.6.2.3 Mantener a 4 C por dos horas. 10.6.2.4 Centrifugar a 2 000 r.p.m. por diez minutos. Separar los sueros adsorbidos de los glbulos rojos. 10.6.3 Tanizacin de los glbulos rojos 10.6.3.1 Mezclar 5 mL de glbulos rojos con 5 mL de una solucin de cido tnico 1/20,000 e incubar a 37 C por diez minutos. 10.6.3.2 Centrifugar a 2 000 r.p m. por siete minutos. 10.6.3.3 Decantar el sobrenadante.
83
10.6.3.4 Resuspender el sedimento en 10 mL de tampn fosfato pH 7,2. 10.6.3.5 Centrifugar a 2 000 r.p.m. por siete minutos. 10.6.3.6 Descartar el sobrenadante. 10.6.3.7 Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin salina. 10.6.4 Sensibilizacin de los glbulos rojos tanizados con antgeno de T. gondii 10.6.4.1 Tubo N.1: colocar 5 mL de antgeno ( diluido 1/20 en tampn fosfato pH 6,4). 10.6.4.2 Adicionar 5 mL de suspensin de glbulos rojos tanados. 19.6.4.3 Tubo N.2 (control): colocar 5 mL de tampn fosfato pH 6,4. 10.6.4.4 Incubar los tubos en bao Mara a 37 C durante 20 minutos. 10.6.4.5 Centrifugar a 2 000 r.p.m. por diez minutos. 10.6.4.6 Eliminar el sobrenadante. 10.6.4.7 Lavar el sedimento con 10 mL de solucin diluyente. 10.6.4.8 Centrifugar a 2 000 r.p.m. 10.6.4.9 Descartar el sobrenadante. 10.6.4.10 Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin diluyente. 10.6.5 Hemoaglutinacin 10.6.5.1 Rotular una placa de microtitulacin para realizar diluciones de los sueros, incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la dilucin 1/16 hasta1/2048. 10.6.5.2 Colocar en los pozos de la fila A 150 L de la solucin diluyente (Anexo G) y 50 L de la misma solucin en los pozos de las filas B,C,D,E,F,G,H. 10.6.5.3 Agregar a cada pozo de la fila A, 10 L del suero a evaluar, homogeneizar aspirando y expeliendo
84
varias veces con la pipeta, seguidamente retirar 60 L de cada pozo y descartarlo sobre un recipiente conteniendo hipoclorito de sodio al 5%. 10.6.5.4 Luego realizar diluciones sucesivas. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 L de la dilucin 1/16 de cada suero a evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogeneizar y repetir igual con la siguiente fila, teniendo cuidado de descartar las puntas. 10.6.5.5 Agregar 50 L de la solucin de glbulos rojos sensibilizados con antgeno de T. gondii en cada pocillo. 10.6.5.6 Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. 10.6.5.7 Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. 10.6.5.8 Realizar la lectura a la hora y a las 24 horas. 10.7 LECTURA (Figura 29) La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formacin de una malla homognea de bordes irregulares que cubren al 50-100% del fondo del pocillo, en tanto, la falta de reactividad (negativo) se manifiesta por la sedimentacin de glbulos rojos en forma de botn en el fondo del pocillo. Se considera positiva la muestra a partir de la dilucin 1/32 y se informa con el ttulo de la ltima dilucin positiva. 10.8 RESULTADOS POSITIVO: cuando se detecta la presencia de anticuerpos contra T. gondii. Ttulo segn lectura. NEGATIVO: ausencia de anticuerpos contra T. gondii. 10.9 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA Sensibilidad: 95% Especificidad: 80%
85
MUESTRAS
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
CP CN
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048

REACTIVO (positivo) NO REACTIVO (negativo)
Figura 30. Placa de reaccin de hemoaglutinacin indirecta.
86
DILUCIONES
Bibliografa
1 Centro Panamericano de Zoonosis. Prueba de doble difusin arco 5 para el diagnstico de la hidatidosis humana. Buenos Aires: OPS; 1979. Nota Tcnica N. 22. Coltorti E, Varela-Daz V. Inmunologa e inmunodiagnstico de la hidatidosis humana. Med Argent. 1978; 6: 135-47. Corwin RM, Dimarco NK, Mc Dowell AE, Pratt SE. Internal parasites. In: Leman. Diseases of swine. 6th ed. Ames: Iowa State University Press; 1986. p. 646-64. Del Brutto OH, Sotelo J. Etiopatogenia de la neurocisticercosis. Rev Ecuat Neurol. 1993; 2: 22-32. Escalante H, Miranda E, Lorca M, Verstegui M, Torres P. La tcnica de Western Blot con antgenos de fluido vesicular de Cyticercus cellulosae para el diagnstico de la cisticercosis. Bol Peru Parasitol. 1995; 11: 26-31. Gmes de Moraes R. Parasitologa mdica. Rio de Janeiro: Atheneu; 1971. p. 219. Kagan IG. A review of serological tests for the diagnosis of hydatid disease. Bull World Health Organ. 1968; 39: 25-37. Laemmi UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227: 680-5. Legua G, Casas E. Enfermedades parasitarias y Atlas parasitolgico de camlidos sudamericanos. Lima: Ed. De Mar; 1999.
2 3
4 5
6 7 8 9
10 Lorenzo C, Ferreira E, Monteiro K, Roszenzvit M, Kamenetzky L, Garca H, et al. Comparative analysis of the diagnostic performance of six major Ehinococcus granulosus antigens in a double-blind, randomized multicenter study. J Clin Microbiol. 2005; 43(6): 2764-70. 11 Maddison SE, Slemenda SB, Schantz PM, Fried JA, Wilson M, Tsang VC. A specific diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa. Am J Trop Med Hyg. 1989; 40(4): 377-83. 12 Nquira C, Bullon F, Balvin G, Reyes N, Snchez E. Epidemiologa de la hidatidosis en el Per. En: Anales del Seminario Nacional de Zoonosis y Enfermedades de Alimentacin Alimentaria. Lima: Ministerio de Salud; 1989. p. 122-34.
87
13 Noble E, Noble G. Parasitologa: biologa de los parsitos animales. 2a ed. Mxico DF: Interamericana; 1965. p. 258-62. 14 Organizacin Panamericana de la Salud. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Washington DC: OPS; 1986. Publicacin Cientfica N. 503. 15 Planchart S, Botto C, Alarcn de Noya B, Bonifacio R, Vivas L, Spencer L, et al. Evaluation of the double diffusion, enzyme immunoassay and immunoblotting techniques, for the diagnosis of human hydatid disease in tropical areas. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1994; 36(3): 205-10. 16 Snchez E. Determinacao de antigenos relevantes da forma larvar do Echinococcus granulosus: Padronizacao e aplicacao do Immunoblot no diagnostico da hidatidose humana. [Tese de Mestria] Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz-FIOCRUZ; 1995. 17 Snchez E, Nquira C, Gutierrez S, Ayala E, Medina S. Manual de procedimientos tcnicos para el diagnstico serolgico de la hidatidosis humana. Lima: Instituto Nacional de Salud; 1997. Serie de Normas Tcnicas N. 22. 18 Shambesh MK, Craig PS, Gusbi AM, Echtuish EF, Wen H. Immunoblot evaluation of the 100 and 130 kDa antigens in camel hydatid cyst fluid for the serodiagnosis of human cystic echinococosis in Libya. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1995; 89(3): 276-79. 19 Tsang V, Hancock K, Wilson M, Palmer D, Whaley S, Mc Dougal J, et al. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot tecnique (western blot) for human T-lymphotropic virus type III/lymphad- enopathy-associated virus (HTLV-III/LAV) antibodies. Atlanta: CDC; 1986. Immunology Series N. 15; Procedual Guide. 20 Tsang VC, Peralta JM, Simons AR. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot tecniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Methods Enzymol. 1983; 92: 377-91. 21 Varela-Daz V, Guarnera EA, Coltorti EA. Ventajas y limitaciones de los mtodos inmunolgicos y de deteccin por imgenes para el diagnstico de la hidatidosis. Bol Oficina Sanit Panam. 1986; 100(4): 369- 83. 22 Varela-Daz VM, Guisantes JA, Ricardes MI, Yarzbal LA, Coltorti EA. Evaluation of whole and purified hydatid fluid antigens in the diagnosis of human hydatidosis by the immunoelectrophoresis test. Am J Trop Med Hyg. 1975; 24(2): 304-11.
88
Anexos
ANEXO A
ZOONOSIS PARASITARIAS Las zoonosis parasitarias ms importantes en el pas son: hidatidosis, cisticercosis, fasciolosis y toxoplasmosis. HIDATIDOSIS Es una infeccin parasitaria del hombre y de algunas especies de animales, que tiene como agente etiolgico la larva (hidtide) de cstode del gnero Echinococcus (RUDOLPHI, 1801). Cuatro especies del gnero Echinococcus pueden infectar al hombre: E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus, E. vogeli. De stas, E. granulosus es la especie de mayor importancia desde el punto de vista de salud pblica y de produccin animal. Ciclo de transmisin del E. granulosus (Figura A1) El E. granulosus tiene dos hospederos: el definitivo y el intermediario. El hospedero definitivo es el perro, en cuyo intestino se encuentra la forma adulta. Los hospederos intermediarios son mamferos hervboros, incluyendo al hombre, en quienes se encuentra la forma larvaria. En el hospedero definitivo, el adulto se encuentra fijo a las vellosidades de la mucosa del intestino delgado. Las progltidas grvidas, conteniendo varias centenas de huevos, son eliminadas con las heces del animal a medida que se desprenden del estrbilo y contaminan el suelo, los vegetales y el agua. Los huevos conteniendo la oncsfera (o embrin hexacanto), son ingeridos por los hospederos intermediarios a travs de la vegetacin, a partir del suelo contaminado o el agua de bebida. Cuando la oncsfera es liberada en el intestino delgado de este hospedero, atraviesa la mucosa intestinal y penetra en los vasos sanguneos y linfticos, a travs de las cuales llega al hgado, de all a los pulmones y a otros rganos donde va ha desarrollarse la hidtide o larva. En el hgado o en los pulmones, rganos donde preferentemente se
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localizan los embriones, la gran mayora es destruda por la respuesta inmune del hospedero. Aquellos que sobreviven evolucionan a hidtide. Si las vsceras del hospedero intermediario, conteniendo las larvas o hidtides, son dadas al perro, los esclices se desarrollarn en su intestino dando origen a la forma adulta de E. granulosus. El hombre es un hospedero intermediario accidental y no cumple ningn papel en el ciclo evolutivo, sin embargo, es el principal responsable en perpetuar la infeccin, ya que alimenta a los perros por costumbre o por necesidad, con vsceras portadoras de quistes. Patogenia En la mayora de los casos de infeccin humana, el desarrollo del quiste hidatdico es asintomtico. La infeccin por los huevos de E. granulosus, generalmente se da en la infancia y la sintomatologa slo se manifiesta tardamente, esto es, en la edad adulta, cuando el quiste hidatdico ha alcanzado un mayor tamao. Las manifestaciones clnicas de la hidatidosis se relacionan con el estado fsico del quiste e integridad de sus membranas, as como de su localizacin y tamao. Generalmente, el crecimiento del quiste puede manifestarse como masas palpables, deformacin de rganos, adems de alteraciones funcionales. En casos de localizacin pulmonar los signos y sntomas frecuentemente incluyen tos, dolor torxico, hemoptisis o dsnea. Cuando la localizacin es heptica o abdominal puede haber dolor, masas palpables, ictericia, hepatomegalia o esplenomegalia. Los casos de localizacin sea producen destruccin de trabculas, necrosis y fractura espontnea. Cuando la localizacin es en rganos vitales, como sistema nervioso central, corazn y riones, el pronstico es grave.
90
Figura A1. CICLO DE TRANSMISIN de Echinococcus granulosus: 1. Hospedero definitivo del parsito (perro); 1a. Verme adulto; 1b. Progltida grvida; 1c. Huevos en el medio ambiente; 2. Desarrollo del quiste en el hospedero intermediario (ovino); 2a. Quiste hidatdico; 2b. Protoesclisis invaginado; 2c. Protoesclisis evaginado. 3. Hospedero intermediario accidental (hombre). Fuente: GOMES DE MORAES et al. 1971, modificado.
91
Diagnstico laboratorial La hidatidosis es una infeccin parasitaria humana, cuyo diagnstico de laboratorio es principalmente inmunoserolgico. Sin embargo, son utilizados exmenes microscpicos dirigidos a la bsqueda de esclex en orina, esclices o fragmentos de membrana en la expectoracin bronquial y lquidos pleurales y abdominales extrados por puncin del quiste. Es importante resaltar la contraindicacin de la puncin del quiste, por el riesgo de diseminacin hidatdica, de consecuencias imprevisibles y choque anafilctico con riesgo de vida para el paciente. El diagnstico serolgico de la hidatidosis se basa en la deteccin de anticuerpos circulantes o clulas sensibilizadas contra los antgenos del quiste hidatdico. Los mtodos ms utilizados para el diagnstico son: Doble Difusin Arco 5 (DD5) considerado de referencia, en las reas endmicas de los pases de Amrica del Sur y el inmunoblot o Western Blot que muestra alta sensibilidad y especificidad. CISTICERCOSIS Es tambin una zoonosis parasitaria producida por la larva (cisticerco) de la Taenia solium. Tanto el cerdo como el hombre la adquieren al ingerir alimentos contaminados con huevos del parsito. Ciclo de transmisin de la Taenia solium (Figura A2) El hombre es el nico hospedero definitivo de la tenia adulta; y el cerdo, el hospedero intermediario ms conocido que contiene la larva. El hombre puede ser hospedero intermediario accidental. El parsito adulto habita en el tubo digestivo del ser humano, donde se mantiene firmemente adherido a la pared intestinal mediante sus ventosas y ganchos. Las progltidas grvidas se separan del extremo distal de la tenia y son expulsados con las heces. Cada progltida contiene miles de huevecillos que se liberan en el ambiente y que pueden permanecer viables durante largo tiempo. En lugares donde la eliminacin de excretas es inadecuada, los cerdos se alimentan con heces humanas e ingieren los huevos de T. solium. Una vez ingeridos por el cerdo, las oncsferas (embriones hexacantos) atraviesan la pared intestinal y entran al flujo sanguneo, desde donde son transportados a los tejidos del animal, principalmente msculos estriados y cerebro. En dichos tejidos, las oncsferas evolucionan y se transforman en larvas (cisticerco).
92
Cuando el hombre ingiere carne de cerdo mal cocida y contaminada con cisticerco, las larvas se evaginan en el intestino delgado, el scolex se adhiere a la pared intestinal, y el cuerpo del parsito comienza a crecer y a formar progltides. Por otra parte, el hombre puede tambin convertirse en husped intermediario de la T. solium al ingerir sus huevecillos; bajo estas circunstancias se desarrolla la cisticercosis humana. Patogenia El periodo entre la infeccin inicial y la aparicin de los sntomas es muy variable; ste puede ser de algunos meses o de varios aos. La expresin clnica de la cisticercosis es polimrfica, la enfermedad puede ser desde asintomtica hasta incapacitante y, en ocasiones, mortal; el cuadro clnico depende de si la cisticercosis es subcutnea, muscular u ocular. Cuando afecta al sistema nervioso central las manifestaciones dependen del nmero, localizacin y estado evolutivo del parsito; las ms comunes son cuadros convulsivos confundidos como epilepsias de inicio tardo, parlisis de pares craneales, hemiplejia, alteraciones visuales, cefalea, entre otros.
Figura A2. ciclo de transmisin de Taenia solium: A: El ser humano es el nico hospedero definitivo, B: El cerdo es el hospedero intermediario habitual Fuente: OMS-OPS 1993
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Diagnstico laboratorial Existe varias pruebas destinadas a la deteccin de anticuerpos anticisticerco en suero y LCR, entre las que destacan el ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA) y el inmunoblot. FASCIOLOSIS Esta parasitosis llamada tambien distomatosis heptica, es una zoonosis producida por la Fasciola hepatica, comn en animales hervvoros y ocasionalmente en el hombre. Ciclo de transmisin de la Fasciola heptica (Figura A3) Los parsitos adultos se localizan en los conductos biliares de los animales y el hombre, en tanto los huevos salen al intestino con la bilis y son eliminados con las materias fecales. Para embrionar es indispensables que caigan en agua dulce, en la cual dan origen a la primera forma larvaria que sale a travs del oprculo, el miracidio ciliado nada libremente en el agua e invade un caracol del gnero Lymnaea, en el cual se reproduce y forma esporoquiste, redias y cercarias, esta ltima tiene el cuerpo redondeado y cola no bifurcada. Las cercarias abandonan el caracol, nadan en el agua para buscar plantas a las que se adhieren y se transforman en metacercarias de aproximadamente 0,5 mm, redondeada y cubierta de una membrana gruesa. Estas metacercarias se encuentran dentro del tejido vegetal, de modo que no son eliminados con el lavado de las plantas parasitadas, adems que tambin pueden enquistarse en la superficie del agua, encerrando pequeas burbujas de aire, que les permite mantenerse flotando. Los hospederos definitivos se infectan al ingerir estas plantas contaminadas, de las cuales los berros y hortalizas de tallo corto comestibles son las principales fuentes de infeccin humana. En el intestino delgado se libera el parsito inmaduro, que atraviesa la pared intestinal, el peritoneo y la cpsula heptica, para luego buscar los canales biliares en donde se desarrolla a adulto en tres a cuatro meses. El parsito adulto puede vivir en los canales biliares por varios aos.
94
Figura A3. Ciclo de transmisin de Fasciola hepatica: A. Huevo embrionado, A 1. Miracidio B. Esporocisto, C. Redias, D. Cercaria, E. Metacercaria (forma infectante), F. Forma juvenil, G. Forma adulta del parsito. Fuente: COLIN JOHNSTONE, 1999.
Patogenia En la fasciolosis se distinguen tres presentaciones clnicas: La forma aguda o invasiva que corresponde a la migracin de las fasciolas jvenes a travs del parnquima heptico produciendo lesiones traumticas y necrticas que se traducen clnicamente por hepatomegalia dolorosa, fiebre y eosinofilia alta que puede orientar el diagnstico. La forma crnica que corresponde a la localizacin del parsito adulto en los conductos biliares. La Fasciola adulta produce alteraciones inflamatorias, en las mucosas y una reaccin fibrtica pericanalicular, responsables de los cuadros clnicos de colangitis, colecistitis y colelitiasis. La foma extraheptica que ocurre durante la migracin de las larvas en la cavidad peritoneal, pudiendo producir localizaciones aberrantes en diferentes partes del organismo y cuya sintomatologa vara segn el rgano afectado.
95
Diagnstico laboratorial El modo ms frecuente de establecer el diagnstico etiolgico es el hallazgo de los huevos del parsito en la bilis contenido duodenal o materias fecales. Sin embargo, durante la fase aguda de la fasciolosis humana no es posible efectuar el diagnstico parasitolgico, ya que no hay eliminacin de huevos. Las pruebas inmunolgicas son tiles en esta fase de la infeccin, siendo las reacciones serolgicas ms utilizadas la tcnica de doble difusin del Arco 2, ELISA e inmunoblot. TOXOPLASMOSIS La toxoplasmosis causada por Toxoplasma gondii, esporozoario intracelular obligado del grupo Apicomplexa, es una zoonosis parasitaria mundialmente extendida. Se calcula que 50% de la poblacin mundial est parasitada por T. gondii, siendo mucho menor la proporcin de enfermos por el parsito. Ciclo de transmisin del Toxoplasma gondii (Figura A4) El hospedero definitivo es el gato y otros felinos en los cuales se desarrolla el ciclo sexual, y los hospederos intermediarios son una variedad de animales vertebrados domsticos y silvestres, e incluye accidentalmente al hombre, en quienes se desarrolla el ciclo asexual. Ciclo sexual Ocurre en la capa epitelial de la mucosa del intestino delgado del gato. Este se infecta al ingerir vsceras de animales, principalmente ratones, que tienen quistes tisulares conteniendo los trofozoitos del parsito. Los trofozoitos al ser liberados de los quistes por los jugos digestivos del estmago e intestinos invaden las clulas del epitelio donde se multiplican por dos mecanismos, la divisin binaria y la endodiogenia, dando lugar a nuevos trofozoitos que invadirn a otras clulas; luego de varios ciclos de reproduccin, algunos trofozoitos se diferencian en gametocitos masculinos y femeninos que fecundan en la luz intestinal dando lugar a huevos o zigotes, que se rodean de una membrana qustica que se llaman ooquistes, los que al inicio contienen un esporoblasto (ooquiste inmaduro). Este esporoblasto se divide y se rodea de una membrana qustica dando lugar a esporoquistes,y en cada esporoquiste se desarrollan cuatro esporozoitos (ooquiste maduro). Son estos ooquistes los que se eliminan con las heces del gato las cuales constituyen una de las formas infectantes para el hombre y otros animales domsticos.
96
Ciclo asexual ste se desarrolla, en parte, en las clulas epiteliales de la mucosa intestinal del gato, como se ha mencionado arriba, y en especial en los tejidos de gran variedad de animales, incluyendo al hombre. El hombre y los animales pueden infectarse al ingerir ooquistes maduros, que se encuentran en las heces del gato, o al ingerir vsceras que contienen tejidos con quistes de T. gondii. Los jugos digestivos digieren las cubiertas de los quistes u ooquistes dejando libres los trofozoitos, los que penetran la mucosa intestinal para alcanzar la circulacin general y localizarse en los tejidos, con preferencia de algunos rganos como ganglios, retina ocular, cerebro, msculo etc. Los trofozoitos se introducen en las clulas de los tejidos respectivos donde comienzan a reproducirse por divisin binaria (formas intracelulares) o con el transcurso del tiempo se va desarrollando, alrededor de los trofozotos, una membrana qustica que permite la reproduccin y el desarrollo de los trofozotos en su interior, en forma lenta, bradizotos o rpida taquizotos, segn el estado inmunitario del hospedero.
Figura A4: Ciclo de transmisin de Toxoplasma gondii. Fuente: LEGUIA,G. Y CASAS, E. 1999
97
Patogenia El T. gondii es un parsito intracelular que puede invadir cualquier rgano, sin embargo, las localizaciones que suelen dar sintomatologa con mayor frecuencia son: ganglios, ojos y cerebro. La localizacin ganglionar se caracteriza por agrandamiento de estos, siendo frecuente el compromiso de los ganglios del cuello. Tpicamente hay poca sintomatologa general, debiendo hacerse el diagnstico diferencial con tumores como los linfomas. La localizacin ocular se caracteriza por inflamacin de los tejidos intraoculares, principalmente retina, coroides, uvea, etc. La corioretinitis es la lesin ms frecuente. La localizacin cerebral puede ser una inflamacin difusa o localizada que ha cobrado importancia en los ltimos tiempos, por ser una complicacin de los pacientes VIH positivos, siendo un parsito oportunista del SIDA. La transmisin congnita es una posibilidad poco frecuente, y cuando ocurre, dependiendo del momento de la gestacin en que haya pasado el parsito, puede presentarse abortos espontneos y observarse desde recin nacidos asintomticos, hasta cuadros de hidrocefalia, corioretinitis y calcificaciones cerebrales. Diagnstico laboratorial El diagnstico parasitolgico indirecto, mediante la demostracin de anticuerpos o antgeno circulante, constituye el mtodo ms adecuado para la confirmacin diagnstica. Las pruebas serolgicas (hemaglutinacin indirecta HAI, inmunofluorescencia indirecta IFI e inmunoensayo ELISA) son las ms usadas y tienen alta sensibilidad y especificidad, pero la interpretacin de sus resultados debe hacerse en forma cuidadosa, en relacin con la evaluacin clnica del paciente.
98
ANEXO B
MATERIALES PARA OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA Segn el procedimiento que emplee: Tubos vacutainer estriles. Jeringa descartable de 5 mL. Agujas descartables 20 G x 1. Ligaduras de 2,5 mm de dimetro. Algodn. Alcohol yodado. Depsito de metal (tarros) para descartar las agujas. Frasco de vidrio de boca ancha (con solucin de leja), para jeringas. Leja al 3-5%. Gradillas. Mascarillas (opcional). Guantes. Cuaderno de registro.
ANEXO C
PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT C.1 PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT C.1.1 Tampn Tris/HCl 0,05M, pH 8,0 Tris 0,6 g. NaCl 0,6 g. Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado. Agua desionizada c.s.p 100 mL. C.1.2 Solucin de tratamiento de muestra Tris/HCl (0,5 M, pH 6,8 pH 8,0) 950 L. 2 Mercapto-Etanol 50 L. Dodecil sulfato de sodio (SDS) 20 mg. Diluir la muestra con la solucin de tratamiento (V/V) y hervir por cinco minutos. Adicionar solucin marcador de corrida.
99
C.1.3 Solucin colorante marcador de corrida Azul de bromofenol 50 mg. Glicerol 8 mL. Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 1 mL. Agua desionizada 1 mL. Usar: 1 L por cada 30L de muestra. C.1.4 Solucin stock de poliacrilamida (30%T / 2,7%C) Acrilamida 14,6 g. N N bis-acrilamida 0,4 g. Agua desionizada c.s.p 50 mL. Pesar los reactivos en tubo de plstico. Disolver con agua caliente ( 20 mL), esperar hasta que se enfre y completar el volumen. Conservar a 4 C. C.1.5 Tampn de gel de enpaquetamiento 0,5 M, pH 6,8 Tris 0,5 M 6 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. C.1.6 Tampn de gel de separacin o de corrida 1,5 M pH 8,8 Tris 1,5 M 18,15 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. C.1.7 Solucin de persulfato de amonio (APS) al 10% Persulfato de amonio 10 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. Alicuotar y conservar a -20 C. C.1.8 Solucin de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% SDS 10 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. Conservar a 4 C o a temperatura ambiente. C.1.9 Tampn de corrida (superior/inferior) Tris 0,025 M 3 g. Glicina 0,192 M 14,4 g. SDS al 10% 10 mL. Agua desionizada 1000 mL.
100
C.1.10 Solucin colorante Coomassie Solucin stock 1%: Comassie Blue R 250 1 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. Disolver y filtrar en papel Watman N1. Colorante para uso: Solucin stock 1% 12,5 mL. Metanol 50 mL. Acido actico 10 mL. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. C.1.11 Solucin decolorante Metanol 5 mL. Acido actico 7 mL. Agua desionizada c.s.p. 100 mL.
Tabla C1: Frmula de concentracin de gel de empaquetamiento y de separacin o de corrida al 12, 15 y 40%. Componentes Solucin stock Tampn de gel inferior o de separacin Tampn de gel superior o de empaquetamiento SDS 10% Agua desionizada Persulfato de amonio (APS) al 10% Temed Gel de empaquetamiento y de separacin 40% 12% 15% 1,33 mL 4,8 mL 6,0 mL 3,6 mL 4,5 mL 2,5 mL 100 L 120 L 120 L 6,1 mL 3,6 mL 1,5 mL 50 L 60 L 60 L 5 L 4 L 4 L
C.2
PREPARACION DE TAMPN PARA LA TRANSFERENCIA C.2.1 Tampn de transferencia (solucin madre) Tris 205,6 g. Agua desionizada c.s.p. 1000 mL. Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado.
101
C.2.2 Tampn de transferencia para uso Buffer de transferencia 1:4 500 mL (125 mL solucin madre +75aklsdj a desionizada) Metanol 200 mL. Agua desionizada 300 mL. C.3 PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA REACCIN IMUNOENZIMTICA C.3.1 Tampn fosfato salino 0,01M, pH 7,2 (PBS) Solucin madre A. Na2HPO4 (0,1M) 14,196 g/L. B. NaH2P04 (0,1M) 11,999 g/L. PBS para uso (PBS 0,01 M pH 7,2 ) Na2HP04 (0,1M) (sol. madre) 77,2 mL. NaH2PO4 (0,1M) (sol. madre) 22,8 mL. NaCl (0,15M) 8,77 g. H2O desionizada c.s.p. 1000 mL. C.3.2 Tampn de lavado Tampn fosfato salino + tween 20 al 0,3%. C.3.3 Tampn de bloqueo y diluyente Tampn fosfato salino + tween 20 al 0,3% + leche descremada al 5%. C.3.4 Solucin reveladora Tampn r fosfato salino 10 mL. 3,3 diaminobenzidina tetracloridrato 5 mg. Perxido de hidrgeno 30% 10 L.
102
ANEXO D
PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA DOBLE DIFUSIN D.1 SOLUCIN SALINA TAMPONADA (SST) 0,1M, pH 7,4 Solucin fisiolgica (NaCl 0,85 %) 900 mL. Fosfato de potasio dibsico (K2HPO4) 100 mL. Ajustar pH 7,4 con solucin KH2PO4 0,1 M. GEL DE AGAR NOBLE Solucin salina tamponada 100 mL. Agar noble 1,20 g. Merthiolate 0,01 g. Consevar a 4 C. SOLUCION COLORANTE Amido Schwarz (negro amido) 0,10 g. Acido actico glacial 20 mL. Agua desionizada c.s.p. 1000 mL. Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado. SOLUCION DECOLORANTE Alcohol etlico de 95 G 400 mL. Acido actico glacial 100 mL. Agua desionizada c.s.p. 1000 mL. Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.
D.2
D.3
D.4
ANEXO E
PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA ELISA E.1. TRIS-HCl 0,01M, pH 7,5 Trizma-HCl anhidro 0,12 g. Trizma base anhidro 0,02 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. TAMPN FOSFATO SALINO 0,01M, pH 7,2 (PBS) Solucin madre A. Na2HPO4 (0.1M) 14,196 g/L. B. NaH2P04 (0.1M) 11,999 g/L.
E.2
103
PBS para uso (PBS 0,01 M pH 7,2 ) Na2HP04 (0,1M) (sol. madre) 77,2 mL. NaH2PO4 (0,1M) (sol. madre) 22,8 mL. NaCl (0,15M) 8,77 g. H2O desionizada c.s.p. 1000 mL. E.3 E.4 E.5 TAMPN DE LAVADO Tampn fosfato salino + tween 20 al 0,05%. TAMPN DE BLOQUEO Y DILUYENTE Tampn fosfato salino + tween 20 al 0,05% + seroalbmina bovina al 1%. SOLUCIN ESTABILIZADORA PARA EL SUSTRATO (STOCK) cido ctrico 3 g. Na2HPO4 anhidro 10,7 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. Ajustar el pH a 5,0. Solucin para uso: tomar 8 mL de la solucin estabilizadora del sustrato (stock) y completar con agua desionizada hasta 25 mL. E.6 SOLUCIN DEL SUSTRATO Solucin estabilizadora (para uso) 25 mL. Orto- phenilendiamine (OPD) 10 mg. Perxido de hidrgeno al 30% 10 L. cido sulfrico 2,5 M cido sulfrico 1,4 mL. Agua destilada 8,6 mL.
E.7
104
ANEXO F
F.1 PARTICULAS DE LTEX COMERCIAL Suspensin al 10,2% de partculas de ltex de poliestineno 0,25. SOLUCION MADRE DE PARTCULAS DE LTEX Suspensin de partculas de ltex comercial 1 mL. Tampn glicina pH 8,2 7 mL. F.2 TAMPN GLICINA pH 8,2 NaCl 9 g. CaCl 2,1 g. Glicina 7,31 g. Thimerosal 0,10 g. Agua deionizada c.s.p. 1000 mL. Disolver todos los reactivos en 800 mL de agua deionizada, ajustar pH 8,2 con NaOH 1N. Completar agua hasta 1000 mL.
ANEXO G
PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA IFI G.1 TAMPN FOSFATO SALINO (PBS) pH 7,2, 0,01M Na2HPO4 1,42 g. NaH2PO4 1,20 g. NaCl 8,2 g. Agua desionizada c.s.p. 1000 mL. TAMPN FOSFATO DILUYENTE (PBS+tween 80 al 1%) PBS 99 mL. Tween 80 1 mL. SOLUCIN DE AZUL DE EVANS (SOLUCIN STOCK) Azul de Evans 10 mg. PBS + tween 80 100 mL. Conservar en refrigeracin a 4 C. Preparar la solucin de trabajo antes de usarla. Solucin stock 1 parte. PBS tween 80 9 partes.
G.2
G.3
105
G.4
BUFFER CARBONATO BICARBONATO 0,5M pH 9,5 Solucin A. Na2HCO3 anhidro 5,3 g. Agua deionizada c.s.p. 100 mL. Solucin B NaHCO3 anhidro 4,2 g. Agua deionizada c.s.p 100 mL. Agregar la solucin A sobre la solucin B, hasta obtener un pH 9,5. GLICERINA TAMPONADA Glicerina bidestilada 9 mL. Tampn carbonato-bicarbonato 0,5M, pH 9,5 1 mL.
G.5
ANEXO H
PREPARACIN DE TAMPN Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACIN INDIRECTA H.1 SOLUCIN DE ALSEVER Glucosa anhidra 18,66 g. Cloruro de sodio 4,18 g. Citrato de sodio 8 g. cido ctrico 0,55 g. Agua desionizada c.s.p. 1000 mL. TAMPN FOSFATO SALINO (PBS) 0,15 M Solucin 1 KH2PO4 2,04 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. Solucin 2 Na2HPO4 2,13 g. Agua desionizada c.s.p. 100 mL. PBS pH 7,2 Solucin 1 7 mL. Solucin 2 18 mL. NaCl 2,1 g. Agua desionizada c.s.p. 250 mL.
H.2
106
PBS pH 6,4 Solucin 1 18,4 mL. Solucin 2 6,7 mL. NaCl 2,1 g. Agua desionizada c.s.p. 250 mL. H.3 H.4 SOLUCIN DILUYENTE Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2. CIDO TNICO SOLUCIN STOCK cido tnico 10 mL. Solucin salina 1 mL. Solucin de trabajo: 1/20000 cido tnico (solucin stock) 100 mL. Solucin salina 20 mL.
107
Este documento se termin de imprimir en los talleres grficos de Punto y Grafa S.A.C. Av. Del Ro 113 - Pueblo Libre Telf: (511) 332- 2328 2010
Instituto Nacional de Salud Jirn Cpac Yupanqui 1400, Lima 11, Per Telfonos: (0511) 617-6200 Fax: (0511) 617-6244 Correo electrnico: postmaster@ins.gob.pe Pgina web: www.ins.gob.pe
SERIE DE NORMAS TCNICAS N. 32

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Serie de Normas Tcnicas N. 32 2. edicin Lima, 2010

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

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1.5.38 Quiste multilocular: quiste que contiene muchas cavidades. 1.5.39

1.5.40 1.5.41 1.5.42

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2.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO

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DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO

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Figura 1. Posicin del paciente para la obtencin de la muestra de sangre

Si el paciente se encuentra en cama, extender su brazo en una posicin descansada.

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Figura 2. Zona de venopuncin (pliegue anterior del codo).

Figura 3. Ligadura del brazo

3.7 3.8 3.9

Figura 4. Asepsia de la zona de venopuncin.

Figura 5. Introduccin de aguja de venopuncin.

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Figura 6. Retiro de la aguja de venopuncin.

Figura 7. Codificacin de la muestra.

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CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS

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Conservacin y envo de muestras

ENVO DE LAS MUESTRAS

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS ZOONOSIS PARASITARIAS

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TCNICA DE INMUNOBLOT PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y CISTICERCOSIS HUMANA

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Tcnica de inmunoblot para el diagnstico de hidatidosis y cisticercosis humana

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Micropipetas de 10-100 L. Micropipeta multicanal de 50 200 L.

5.2.10 Micropipetas de 200-1000 L.

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Figura 9. Equipo para electroforesis en gel de poliacrilamida y perfil proteico de antgenos.

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Figura 11. Placa de incubacin para las tiras de nitricelulosa.

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5.6.3.10 Dejar secar las tiras a temperatura ambiente y en oscuridad.

200,0 116,2 97,4 66,2 45,0 31,0 21,5 14,4

Figura 12. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot. Observar bandas de 21 a 31 kDa

Figura 13. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot . Observar bandas de 13 a 35 kDa

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TCNICA DE DOBLE DIFUSIN PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y FASCIOLOSIS HUMANA

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Tcnica de doble difusin para el diagnstico de hidatidosis y fasciolosis humana