CATEDRA DE BIOQUIMICA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

AO 2007
Autores Dr. Gustavo Agolti. Profesor Adjunto por

Concurso. Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE Dr. Alexis Codutti. Jefe de Trabajos Prcticos Adscripto .Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE Sr. Carlos Alexis Vera. Ayudante alumno por concurso .Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE. Srta. Roco M. Campos Collado. Ayudante Alumno por concurso .Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE. Dra. Nora C. Brandan. Jefa de Ctedra por concurso. Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE

INDICE

Bibliografa: ------------------------------------------------------------------- 33 CONSTRUCCIN Y CLONACIN DE MOLCULAS DE DNA RECOMBINANTE ----------------------------------------------------------4 GLOSARIO: ------------------------------------------------------------------ 30 INTRODUCCION: ------------------------------------------------------------2 ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS ------------- 29 OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL DNA. ------------------------------------------------------------------------- 18 OTRAS TECNICAS RELEVANTES DE LA BIOLOGIA

MOLECULAR ------------------------------------------------------------- 27 REVISIN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN: -----------------------3 SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAO EN CLONES BACTERIANOS: ---------------------------------------------------------- 12

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

1.INTRODUCCION:

La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la expresin de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la biologa y la medicina. La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos que eran inaccesibles por otros mtodos. Estas investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos de los cuales tienen profundas implicancias ticas. La Tecnologa del DNA recombinante se origin en los comienzos de 1970 con el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, enzimas capaces de realizar el clivaje especfico del DNA en fragmentos determinados.

2.REVISIN DE LA ESTRUCTURA ADN / GEN: El cido desoxirribonucleico (DNA) est formado por dos cadenas polinucletidicas antiparalelas (5' fosfato > 3' hidroxilo, 3' hidroxilo > 5' fosfato) unidas por puentes de hidrgeno entre los pares de bases (pb) complementarias dAMP - dTMP y dCMP - dGMP. Los genes son hileras lineales de pares de bases de DNA y son usualmente

transcriptos en molculas de cido ribonucleico (RNA) de cadena nica. El cromosoma es una hilera lineal (circular en bacteria) de genes y el genoma es el complemento haploide de DNA en la clula.

Una clula bacteriana (por ejemplo Escherichia coli) contiene un cromosoma (haploide) con 3 x 106 pb y cerca de 2.000 genes. Una clula humana contiene 46 cromosomas (diploide, 23 pares haploides) con cerca de 3 x 109 pb (tamao del genoma haploide) y cerca de 50.000 genes. Debido al azar estadstico en la secuencia de DNA, cada 4 4 (256) pb o 46 (4096) pb se incluirn en el promedio, por ejemplo, las secuencias nicas que se encuentran a continuacin (o alguna otra secuencia de 4 o 6 pb).

GATC

GAATTC

CTAG

CTTAAG

Por convencin, la cadena superior en una secuencia de DNA de doble cadena se lee 5' fosfato a 3' hidroxilo y la cadena inferior se lee 3' hidroxilo a 5' fosfato. Las dos secuencias de doble cadena ilustradas se denominan Palndromes ya que se leen exactamente igual en ambas cadenas en la direccin 5' a 3'.

Figura 1: Secuencia de doble cadena denominada Palndrome.

3.CONSTRUCCIN Y CLONACIN DE MOLCULAS DE DNA RECOMBINANTE:

3.1. ENZIMAS DE RESTRICCIN:

Las enzimas de restriccin son endonucleasas que clivan (hidrolizan) en una forma especfica puentes fosfodister 3' - 5' entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de DNA. Las enzimas de restriccin reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas por ejemplo: EcoRI de Escherichia coli, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Las tres primeras letras en el nombre de la enzima, corresponden la primera al genero (E) y las otras dos a la especie (co). stas pueden ir seguidas por la designacin de una cepa ( R) y un nmero romano (I) para indicar el orden del descubrimiento. El tipo ms comn de enzimas de restriccin (tipo II) usado en la tecnologa del DNA recombinante proviene de bacterias y no requiere fuente de energa para el clivaje del puente. Requiere en cambio iones Mg++ para la unin especfica al DNA y posterior clivaje. Otras enzimas de restriccin clivan palndromos de DNA de 4 o 6 pb. Algunas otras enzimas de restriccin clivan una secuencia nica. Estas enzimas que reconocen la misma secuencia se llaman ISOCHIZOMERS. Las enzimas de restriccin de tipo OO son parte de un sistema de restriccin / modificacin en la bacteria. La misma tiene un sistema de proteccin contra sus propias enzimas de restriccin a travs de una enzima acompaante que metila nucletidos de su ADN y los convierte en un sustrato inadecuado para ser digerido en las secuencias de

reconocimiento. Por esto es que las ADN metilasas de sitio especfico y las enzimas de restriccin siempre estn por pares en una bacteria. En el palndrome de 6 pb ilustrado antes, la enzima de restriccin EcoRI (una enzima aislada de E. coli) cliva el puente fosfodister entre G y A en ambas cadenas para producir dos fragmentos asimtricos con el extremo 5' fosfato que sobresale del extremo 3' hidroxilo.

Figura 2 : Clivaje de la enzima de restriccin de EcoRI entre G y A.

Las enzimas de restriccin cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos cohesivos o adherentes son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimtricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena complementarias entre s. Los extremos cohesivos o adherentes son particularmente tiles en la construccin de molculas de ADN hbridas o quimricas. Por otro lado, los extremos romos son generados

cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.

Figura 3: Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos cohesivos o romos.

En promedio, un genoma de la bacteria E. coli tendra alrededor de 800 sitios de clivaje de EcoRI y el genoma humano tendra alrededor de 800.000 sitios de clivaje de EcoRI. Los fragmentos de DNA generados por digestin con enzimas de restriccin pueden ser determinados por electroforesis en gel de agarosa. Este mtodo toma en cuenta la porosidad del agar, smil agarosa a travs del cual pequeos fragmentos de DNA migran ms rpido que los fragmentos de mayor tamao en presencia de una solucin buffer y un campo elctrico.

3.2.DNA LIGASA.

La DNA ligasa es una enzima que cataliza la formacin de puentes fosfodister entre los extremos adyacentes 3' OH y 5' fosfato en el DNA. Para la actividad la enzima
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requiere Mg++ y una unin covalente, derivada del ATP en el caso de la DNA ligasa del bacterifago T4. La enzima T4 puede unir covalentemente molculas de DNA con extremos cohesivos compatibles (por ejemplo, unin de hidrgeno del extremo ms largo 5' de EcoRI digiriendo fragmentos de DNA) y tambin fragmentos de DNA con extremos sin punta. El uso en la digestin / restriccin del DNA seguido por unin covalente de extremos cohesivos de diferentes fragmentos de DNA forma la base de la enzimologa del DNA recombinante.

Figura 4: Accin de la DNA ligasa.

3.3. PLSMIDOS Y CLONACIN DE DNA EXTRAO.

Los plsmidos son pequeas molculas de DNA (de 5.000 pb aproximadamente) que se replican en forma autnoma en clulas bacterianas.

Son crculos covalentemente cerrados de DNA de doble cadena. La mayora de los plsmidos contienen genes resistentes a antibiticos, los que permiten el crecimiento de clulas bacterianas refugiando a los plsmidos bajo condiciones selectivas. Los ejemplos de genes resistentes a antibiticos son los que codifican para la lactamasa o neomicina fosfotransferasa, enzimas que inactivan ampicilina o aminoglucsidos respectivamente.

Figura 5: Genes resistentes a antibiticos. Sitios de replicacin importantes PstI, EcoRI, BamHI, SalI, PvuII. Origen de replicacin (ori).

Los plsmidos contienen uno o ms genes de resistencia a antibiticos y son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciacin. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genmico. Debido a su tamao relativamente pequeo, los plsmidos contienen solo algunos nicos sitios de clivaje de enzimas de restriccin. Luego de la digestin de un plsmido en un nico sitio de restriccin el plsmido circular se vuelve lineal. Se puede crear una molcula de ADN recombinante usando un plsmido. Este proceso consta de las siguientes etapas:
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1.

Se corta el ADN circular del plsmido con enzimas de restriccin, para generar

extremos cohesivos. 2. Se corta el ADN que se quiere multiplicar. Asegurndose que los extremos del

plsmido y los del ADN a insertar sean complementarios y puedan unirse. 3. Se une el gen que se desea introducir (inserto) por medio de la enzima ADN-

ligasa y luego se introduce el plsmido inserto en bacterias. 4. Se selecciona las bacterias que hayan introducido el plsmido con la ayuda de

antibiticos. Dado que los plsmidos contienen un gen de resistencia a antibitico, al exponer las bacterias a ese antibitico, slo las que hayan incorporado el plsmido (y con l la resistencia) sobrevivirn, mientras que las que no lo tengan morirn. Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molcula multiplicada a partir de una nica bacteria que dio origen a la colonia, esta tcnica lleva el nombre de clonacin.

Figura 6: Clonacin de DNA.

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La unin por la DNA ligasa forma una molcula de DNA recombinante con una estructura covalentemente cerrada. Una molcula recombinante circular puede ingresar a la clula bacteriana, replicarse y por virtud el gen del plsmido con resistencia a antibiticos, transformar la clula normal sensitiva a una que crecer en presencia de antibiticos. Si la unin es realizada en un tubo de prueba con millones de molculas plsmidas digeridas por EcoRI y millones de fragmentos de DNA extrao nico con extremos cohesivos (por ejemplo genoma humano digerido con EcoRI) son formadas millones de molculas de DNA recombinante, cada una conteniendo el mismo DNA vector plsmido pero con un fragmento nico (gen en algunos casos) de DNA humano. Cuando clulas bacterianas receptoras son transformadas con esta mezcla y colocadas en placas de agar conteniendo el antibitico apropiado, solo una clula conteniendo un plsmido crecer y formar una colonia visible conteniendo millones de bacterias, todas con el idntico plsmido vector y el DNA extrao inserto (clones). De un pequeo nmero de placas de agar es posible tener suficientes clones bacterianos individuales, as cada gen en el genoma humano es clonado en una colonia bacteriana nica. Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el fago lambda, cromosomas creados de forma artificial y quimeras (DNA quimrico). Para clonar genes especficos se puede preparar una biblioteca genmica que consiste en una coleccin de fragmentos de DNA genmicos, clonados en vectores (plsmidos, bacterifagos o csmidos), que representan el genoma entero del organismo. Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA (DNA complementario) que representan la coleccin completa de los mRNA que se sintetizan en un momento en una clula dada. El DNA extrao clonado que est en esta biblioteca son molculas de DNA de doble cadena sintetizadas por la enzima transcriptasa inversa a partir de la poblacin de RNA mensajeros, moldes encontrados en un tejido especfico. As una biblioteca cDNA contiene regiones clonadas codificantes para todas las protenas expresadas en un tejido particular y variar de tejido en tejido.

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El DNA clonado no contendr intrones (a diferencia del DNA genmico) y por consiguiente permite la expresin directa del RNAm transcripto a protena in Vitro o en bacteria.

Figura 7: Biblioteca de cDNA.

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4.SCREENING Y EXPRESION DE DNA EXTRAO EN CLONES BACTERIANOS:

4.1.BANCOS DE SCREENING DE CLONES.

Tratando de escoger una colonia especfica abrigando un gen especfico o cDNA inserto en un plsmido fuera de varios millones presentes en un banco de clones es semejante a la bsqueda proverbial para la aguja en un pajar. Es necesario conocer algo acerca del fragmento de DNA a ser aislado. En la mayora de los casos esto involucra tener la secuencia de DNA de un gen evolutivamente relacionado conociendo la secuencia proteica codificada por el gen a ser aislado, o teniendo un anticuerpo especfico contra esta protena. El screening es a menudo realizado por hibridacin selectiva con una indagacin de DNA (DNA probe). La hibridacin se refiere al proceso por el que bases apareadas o fortalecidas ocurre entre cadenas complementarias de una sola hebra de DNA. La indagacin puede ser un fragmento de DNA o varios cientos de pares de bases o con ms homologa al gen a ser aislado. Tambin una indagacin pequea de hebra nica de DNA puede hacerse sintticamente, el que hibridar con el cdigo gentico por una secuencia aminoacdica conocida. Luego de transferir de una biblioteca de colonias bacterianas de una o ms placas de Petri a un papel de filtro o de nylon, el resto bacteriano es removido dejando el DNA celular y el plsmido unidos al filtro en precisamente la misma posicin como la colonia bacteriana original (una rplica de la placa bacteriana es retenida). El DNA en el filtro es luego desnaturalizado e hibridizado con una indagacin del DNA alterado marcado radiactivamente. Se lava del filtro el exceso de solucin que contiene las sondas que no han hibridado. Las molculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en

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el filtro y su visualizacin se realiza por medio de auto-radiografa, tcnica en la cual primero, cada filtro es cubierto con una pelcula fotogrfica y dejado en la oscuridad. Durante el perodo de exposicin, el radioistopo libera energa que impacta la emulsin fotogrfica. Luego del revelado de la pelcula, la posicin del fragmento radiactivo se observa como una marca oscura, producida por un depsito de plata de la emulsin. Las rplicas de las colonias que estn marcadas con la sonda radiactiva despus de este tratamiento, identifican las colonias originales que contenan vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. El DNA plsmido conteniendo el gen de inters es luego purificado de la colonia bacteriana original. Un cido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adicin de fosfato radioactivo (fsforo 32) durante su sntesis. As, si se aade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando est teniendo lugar la sntesis de DNA, el nuevo DNA ser radioactivo.
32 3-

P -------> 32P-nucletido -------> 32P-cido nucleico

Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. El enzima polinucletido quinasa quita especficamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del DNA.
32

P-P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP +

32

P-O-desoxiribosa-

DNA Esta tcnica es extremadamente til y rpida ya que permite el marcaje de molculas de DNA ya preformadas. Las bibliotecas de genes de screening tambin pueden ser determinadas usando un anticuerpo especfico que reconocer y unir a la protena del gen a ser aislado. El anticuerpo puede ser contra la protena entera o dirigida contra un pptido sinttico derivado de la secuencia primaria de la protena. El anticuerpo puede ser marcado radiactiva o enzimticamente y usado para filtrar bancos de clones bacterianos en los que los genes extraos han sido clonados en un plsmido de expresin especial. En este plsmido el gen

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inserto es transcripto a RNAm y traducido a protena por la RNA polimerasa y ribosomas bacterianos. Las colonias bacterianas en el papel de filtro son lisadas, as la protena expresada en una colonia especfica puede ser detectada por el anticuerpo. Se han desarrollado nuevos mtodos de marcaje de cidos nucleicos que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden detectarse por auto radiografa).

Figura 8: Identificacin de un clon con el fragmento de DNA deseado.

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En los ltimos aos, se ha desarrollado una tcnica que promete generar un salto cualitativo en los estudios de la expresin gentica. Se trata de los micro-arreglos o chips de DNA que permiten monitorear la expresin de un genoma en forma integrada y en un tiempo rcord. La base de la tcnica es simplemente la hibridacin de secuencias complementarias de cidos nucleicos a una escala microscpica. Este altsimo nivel de miniaturizacin permite que la cantidad de sonda requerida sea mnima. Con el empleo de diferentes "etiquetas" fluorescentes se pueden comparar los patrones de hibridacin de dos tipos celulares cualesquiera encontrando rpidamente aquellos genes que poseen un patrn de expresin diferencial. De este modo es posible detectar genes especficamente activados en clulas que han sufrido algn tipo de diferenciacin, como clulas de diferentes tejidos, tumorales, sometidas a ciertos tratamientos, etc. Los microchips proveen una revolucionaria herramienta para explorar la expresin gnica y el anlisis de secuencias tanto en la investigacin bsica como aplicada.

4.2. EXPRESION DE GENES EXTRAOS EN SISTEMAS HETEROLOGOS.

La habilidad de expresar genes extraos en bacterias, levadura o clulas mamferas es importante en el screening de productos gnicos deseados y tambin para producir grandes cantidades de protenas recombinadas de importancia mdica. Estas incluyen a la insulina humana, la obtencin de nuevas vacunas, interferones, hormona humana de crecimiento, factores estimulantes de colonias, eritropoyetina, factores de la coagulacin

(estreptoquinasas, activador del plasmingeno de tejido) la clonacin de animales y muchos ms. Como la bacteria no puede procesar el RNA transcripto de genes separados (que contiene intrones) ellos solo pueden expresar cDNA que codifica directamente para una secuencia proteica.

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El cDNA es inserto en un plsmido bacteriano entre seales para la iniciacin correcta (promotor) y la terminacin de la transcripcin por la RNA polimerasa bacteriana. Tambin, una secuencia para la iniciacin de la traduccin (secuencia SHINE DELGARNO) por ribosomas bacterianos es necesaria corriente abajo del promotor. Puede ser importante regular la transcripcin de cDNA extrao en E. coli por ejemplo, usando la regin promotor / operador del opern lac. La protena expresada puede ser tambin trabajada con ingeniera gentica para ser secretada fuera de la clula bacteriana si una secuencia seal es agregada al extremo N de la protena. Un gen para somatostatina sintetizado artificialmente se fusiona con el gen para la beta-galactosidasa de un plsmido bacteriano. Introducido en E. coli, este plsmido dirige la sntesis de una protena hbrida, que comienza como betagalactosidasa, pero termina como somatostatina.

Figura 9: Proyecto de la Somatostatina

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Una protena humana expresada y aislada de bacteria es insulina. Normalmente en clulas pancreticas la insulina es sintetizada como un precursor (preproinsulina que contiene una secuencia lder y otras regiones polipeptdicas que son clivadas dejando las cadenas A B unidas por puente disulfuro. La sntesis de la protena recombinada en E. coli involucra la expresin y purificacin de las cadenas A y B en forma independiente seguido por una reensamblaje de la protena activa A-B. La expresin y el screening gnico pueden tambin ser realizado en clulas mamferas en cultivo. El cDNA eucaritico o DNA genmico puede ser clonado en

plsmidos de expresin que funcionan en clulas eucariotas. Tales plsmidos deben contener transcripcin eucaritica, procesamiento del RNA y regiones reguladoras de la transcripcin. La transferencia de DNA exgeno a clulas eucariotas se denomina transfeccin de DNA.

5.OTRAS TECNICAS IMPORTANTES DE RECOMBINACION DEL DNA.

5.1.SECUENCIAMIENTO DEL DNA.

La habilidad para secuenciar grandes fragmentos de DNA ha evolucionado la biologa. En los Estados Unidos se investigar en los prximos veinte aos para lograr el mapeo y secuenciamiento de las 3 x 109 pb del genoma humano. Existen dos metodologas bsicas para secuenciar el DNA: (1) Mtodo de MaxamGilbert: degradacin qumica de fragmentos de DNA y (2) Mtodo enzimtico de Sanger o dideoxi: reacciones de terminacin de cadenas durante la sntesis de DNA dirigida por moldes. Los fragmentos de DNA a ser secuenciados son clonados en el genoma de bacterifago que

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existe como una molcula de DNA de doble cadena durante la replicacin, sino es una cadena nica. El fago de DNA de cadena nica contiene una de las cadenas del DNA extrao a ser secuenciado, y es sometido a una sntesis de DNA in Vitro usando la DNA polimerasa y un oligonucletido sinttico especfico como molde de hibridacin que une el molde del bacterifago corriente arriba del DNA extrao insertado. La sntesis in Vitro del DNA es realizada en cuatro recipientes separados de reaccin, cada uno conteniendo 4 dNTPS (uno marcado radiactivamente) ms una pequea cantidad de solo un dideoxinucletido (ddGTP ddATP - ddCTP o ddTTP). El deoxinucletido contiene un azcar 2'H y 3'OH y el dideoxinucletido contiene hidrgenos en posiciones 2' y 3'. Una vez que son incorporados a la cadena de DNA en crecimiento durante la sntesis 5' fosfato se agrega a 3' OH, termina la sntesis de la cadena porque bloquean el 3'OH requerido para la adicin del prximo 5' fosfato dNTP. Debido a que los dideoxinucletidos estn presentes en pequeas concentraciones en relacin a los dNTPs en reacciones individuales, la terminacin de la cadena es al azar y resulta en un amplio rango de tamaos de cadenas nuevas sintetizadas (20 a 1.000b). Como la electroforesis en gel de acrilamida es capaz de determinar las cadenas individuales que difieren en una base, las cuatro mezclas de reaccin son sometidas a electroforesis a travs de acrilamida polimerizada en caminos adyacentes. Luego el gel es expuesto a una pelcula de rayos X donde los productos de terminacin de la cadena radiactiva se revelan como bandas de diferente movilidad electrofortica. La secuencia nueva sintetizada es leda en incrementos de una base a travs de cuatro caminos de reaccin (ddG, ddA, ddT, ddC) de arriba a abajo la direccin 5' a 3'. El complemento de esta secuencia ser la secuencia del molde de DNA extrao en direccin 3' a 5'.

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Figura 10: Determinacin de la secuencia exacta de un cido nucleico. Hebra de DNA marcada en su extremo 5` con 32P.

En la secuenciacin por el mtodo enzimtico, se procede en varias etapas. En una primera etapa, el oligonucletido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la sntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. La mezcla en la que se producir la reaccin de sntesis se separa en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene, adems, uno de los nucletidos terminadores (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP). Estos son dideoxinucletidos que carecen del OH- en la posicin 3', por lo que, una vez que son agregados a la cadena que se est sintetizando, no pueden reaccionar con ningn otro nucletido y se transforman, as, en el ltimo nucletido de la cadena. En una segunda etapa, los productos de reaccin son sembrados en la parte superior de un gel, en "calles" separadas. Luego de la corrida electrofortica, se realiza la autorradiografa del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucletidos incgnita de la siguiente manera: por ejemplo, el fragmento de un solo nucletido que se ubica en la primera posicin en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nuclotido de la secuencia contiene, como base nitrogenada, una guanina.

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Figura 11: Mtodo enzimtico de Sanger. Secuenciacin de DNA.

5.2. POLIMORFISMO DE EXTENSION DE FRAGMENTO DE RESTRICCION.

Excepto en gemelos idnticos, existen cantidades significantes de variacin de la secuencia de DNA entre individuos. Genes idnticos en individuos diferentes (no limitado a humanos) pueden diferir en extensin en el mismo sitio de clivaje de la enzima de restriccin. Este fenmeno se llama polimorfismo de extensin de fragmento de restriccin (RFLP). Esto puede deberse a cambios de bases de nucletidos (mutaciones puntuales, adiciones, deleciones) causantes de la prdida de un sitio de restriccin existente o ganancia de uno nuevo o debido a la presencia de un nmero variable de repeticiones en tandem (VNTRs, elementos pequeos repetitivos del DNA) entre dos sitios de restriccin.

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El significado funcional de RFLP no se conoce aunque diferencias en conjunto en la estructura del DNA pueden tener efectos patolgicos (por ejemplo translocaciones de genes). Varios cientos de RFLP humano han sido identificados y existen muchos ms. Debido a que los RFLP autosmicos son heredados en forma mendeliana (un alelo por cada padre), los genes responsables de la mayora de las enfermedades genticas, por ejemplo, fibrosis qustica, pueden ser identificados y ubicados en familias afectadas utilizando el anlisis de RFLP. Este proceso tambin es referido como gentica reversa porque un gen especfico es aislado en ausencia de una protena conocida o funcin. El anlisis de RFLP experimentalmente es realizado por aislamiento de DNA genmico de tejido, digestin del DNA con diferentes enzimas de restriccin y luego electroforesis del DNA a travs de gel de agarosa. Las bandas de DNA son transferidas por accin capilar en papel de nitrocelulosa, preservando el modelo de migracin de gel (los fragmentos pequeos pasan antes que los fragmentos de mayor tamao). Esta transferencia de DNA del gel al papel se conoce como SOUTHERN BLOTTING o SOUTHERN TRANSFER.

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Figura 12: Mtodo de transferencia Southern aplicado a la determinacin de la huella dactilar de DNA.

La transferencia de RNA o protena del gel al papel se denomina NORTHERN o WESTERN BLOTT respectivamente. El DNA en el Southern blott es desnaturalizado y luego hibridizado con diferentes PROBES, conteniendo secuencias de DNA nica o repetitiva. Las PROBES de DNA son marcadas isotpicamente o con un substrato no radioactivo que es identificado posteriormente en forma enzimtica.

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Los fragmentos de longitud variable en diferentes individuos generados por la misma enzima de restriccin se observar si un RFLP est presente. La identificacin del gen responsable de una enfermedad gentica comienza con la deteccin de un fragmento nico de RFLP o fragmentos que tiene el mismo modelo familiar de herencia as como la enfermedad. Este mtodo ha sido usado para identificar positivamente los genes aberrantes responsables de la fibrosis qustica y distrofia muscular entre otras. Tambin se usa RFLP en medicina forense. La evidencia biolgica hallada en la escena del crimen (sangre, piel, cabello) es fuente de DNA que puede ser sometida al anlisis de RFLP. Como dos individuos no tienen modelos de RFLP idnticos (huellas dactilares del DNA) a loci genticos mltiples (excepto en gemelos idnticos), el DNA de la vctima o sospechoso (obtenido de una muestra de sangre) pueden ser identificados y comparados.

5.3.REACCION DE LAS CADENAS DE POLIMERASA.

La reaccin de las cadenas de polimerasa (PCR) se desarroll a mediados de los aos 80 para amplificar concentraciones de cido nucleico. Tiene especial significado en clonacin de genes y diagnstico mdico. La clonacin acelular o amplificacin del ADN es un tipo de clonacin de molculas de ADN o ARN sin la intervencin de una clula. Mediante esta tcnica se amplifica un gen o fragmento de ADN, es decir, que se produce un gran nmero de copias. Tambin puede realizarse una amplificacin de ARN utilizando un ADN complementario de ARN. Para este proceso se necesita la accin de la enzima transcriptasa inversa. La amplificacin se hace por la tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR (Polimerase Chaine Reaction). Las aplicaciones de esta tcnica son, por ejemplo, la

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clonacin de ADN, la deteccin de secuencias sin purificar, la bsqueda de mutaciones, el diagnstico de enfermedades, estudios evolutivos, resolucin de problemas forenses, etc. El mtodo es sencillo, fiable y rpido. Para que se produzca la amplificacin, en la mezcla de reaccin deben encontrarse los siguientes componentes: Fragmento de ADN que se desea amplificar. Puede provenir de distintos rganos, o de extracto de tejidos, o de sangre, o de mezcla de distintos fragmentos de ADN, etc. Los cuatro tipos de desoxirribonucletidos. Dos oligonucletidos de cadena sencilla que actuarn como cebadores. Una ADN-polimerasa termoestable, ya que debe actuar a altas temperaturas (unos 75 C) y debe mantener su estructura estable a temperaturas de 95 C. La amplificacin dura unas dos horas y es un proceso cclico ( de 20 a 40 ciclos). Cada ciclo dura entre un minuto y medio y cinco minutos. Cuantos ms ciclos se realicen, ms se amplificar el ADN. Cada ciclo consta de tres etapas que son: Desnaturalizacin: consiste en separar las dos hebras de ADN. Para ello, esta etapa se realiza a una temperatura superior a la temperatura de fusin. Es una fase corta, que dura entre 30 y 120 segundos. Hibridacin o templado: se induce a un enfriamiento brusco de la mezcla, lo que genera la unin de los cebadores con las hebras de ADN. Esta fase dura entre 10 y 120 segundos y se realiza a una temperatura entre 37 y 65 C. Los extremos 3'-OH de los oligonucletidos hbridos sirven como moldes para la sntesis de DNA por una DNA polimerasa termoestable, resultando la sntesis de dos fragmentos hijos. Replicacin o elongacin o polimerizacin: es la fase en la que el ADN se amplifica. Dura entre uno y tres segundos, a una temperatura de unos 75 C. La replicacin de esa secuencia se realiza en sentido 5' 3'. Termina cuando lee toda la hebra molde, o hasta que empieza el siguiente ciclo. Por ejemplo, 20 ciclos resultarn en una amplificacin de un milln de veces. Y 30 ciclos resultarn en una amplificacin de un billn.

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El PCR puede amplificar e identificar el virus de SIDA simple en un mililitro de sangre. Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposicin se encuentran la deteccin precoz o prenatal de enfermedades genticas, la deteccin de infecciones virales latentes o la produccin de grandes cantidades de fragmentos de DNA humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros mtodos. Esta tcnica tambin se aplica para estudios de identidad y filiacin.

Figura 13: a). La mezcla de reaccin contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucletidos sintticos (P1 y P2) que servirn como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucletidos trifosfato -dATP, dGTP, dCTP y dTTP-. b). b. La mezcla de reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalizacin, una de hibridacin y una de elongacin-. c). La hibridacin-. d). La elongacin.

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6.OTRAS TECNICAS RELEVANTES DE LA BIOLOGIA MOLECULAR.

En la tcnica del Southern blott el DNA es sometido a electroforesis y luego transferido al papel o nylon. RNA y protenas pueden ser analizados en forma similar. La electroforesis del RNA por agarosa o acrilamida seguida de transferencia al papel o nylon se llama NORTHERN TRANSFER. El RNA transferido puede ser detectado por hibridacin con una PROBE radioactiva. El NORTHERN BLOTT revela el modelo de expresin gnica a nivel de RNA en clulas o tejidos. La electroforesis de protenas desnaturalizadas por acrilamida seguida por transferencia al papel se llama WESTERN BLOTTING. La protena transferida puede ser detectada ms fcilmente por mtodos inmunolgicos. Por ejemplo, un anticuerpo de conejo especfico puede unirse a su antgeno proteico en el papel. Otro anticuerpo (anti-conejo) conjugado con una enzima (fosfatasa alcalina) luego pueden unirse al anticuerpo original del conejo en el papel. Cuando el papel es humedecido en una coloracin un precipitado oscuro se depositar sobre la banda del antgeno. El Western Blott se usa para detectar la presencia de antgenos HIV o anticuerpos para HIV en suero humano as como otros agentes virales. La hibridacin in situ es un proceso por el cual las PROBES de cidos nucleicos se hibridan a cidos nucleicos complementarios dentro de clulas fijas y cortes de tejidos (in situ). Esto permite localizar secuencias especficas de DNA o RNA en clulas y tejidos mediante el uso de sondas de cidos nucleicos. Por ejemplo, localizar una determinada secuencia en un cromosoma. Las sondas, que tambin pueden ser marcadas con un colorante fluorescente, son hibridizadas a los cromosomas, expuestos previamente a un alto pH que rompe las uniones puentes de hidrgeno y separa las dos cadenas de DNA.

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El mtodo de hibridacin in situ tambin puede ser usado para detectar la presencia de molculas de RNA especficas en clulas de distintos tejidos e indicar, de esta manera la expresin diferencial de genes en esos tejidos. En la hibridacin in situ, las sondas estn marcadas con colorantes fluorescentes. Cada color indica la localizacin de una secuencia de DNA diferente: rojo, localizacin en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil mas comn; verde, regin del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Sndrome de Down; blanco, un oncogen en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica una protena de membrana de los glbulos blancos; amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. Este mtodo puede usarse con propsitos diagnsticos usando cidos nucleicos virales, genes alterados u oncogenes.

Figura 14: Hibridacin de cidos nucleicos.

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7.ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS.

Los organismos genticamente modificados se crean introduciendo uno o ms genes, pertenecientes a otros seres, o quitando uno o ms genes, pertenecientes al organismo. Estos organismos son conocidos vulgarmente con el sobrenombre de transgnicos. Sin embargo, organismo transgnico es una clase especfica de organismo genticamente modificado. Los organismos transgnicos estn genticamente modificados, pero con genes pertenecientes a otros organismos muy distintos a ellos (distinta especie). Por ejemplo, un organismo genticamente modificado podra ser una rata con genes de otra rata. Un organismo transgnico sera una merluza modificada con genes de un salmn. Los organismos genticamente modificados han sido desarrollados para facilitar la mejora animal y vegetal, ya que acortan los tiempos de espera en la depuracin de la especie por seleccin de individuos. Tambin, se ha investigado en su desarrollo con otro fin distinto, el de crear organismos que, de otro modo no se formaran en la Naturaleza, como por ejemplo permitir la incorporacin de ADN de otra especie. Las aplicaciones de los organismos genticamente modificados son muy variadas. Se pueden destacar las siguientes: En investigacin: para el estudio de la expresin de genes y la creacin de genotecas. En medicina: para la obtencin de frmacos o protenas cuya sntesis es difcil conseguir "in Vitro". Tambin, para la obtencin de tejidos u rganos, o la reparacin de anomalas genticas en humanos. En agricultura y ganadera: para la mejora (no de forma tradicional) de plantas y animales. En la industria alimenticia: para la mejora de procesos biotecnolgicos de elaboracin de alimentos (pan, vino, cerveza, yogur, etc.) y para la creacin de alimentos nuevos.

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La creacin y utilizacin de organismos genticamente modificados tiene muchas trabas legales, debido al rechazo social existente. Los alimentos manufacturados a partir de este tipo de organismos slo se aceptan para el consumo humano si no queda protena o ADN del organismo genticamente modificado. Si esto no se cumple, debe ponerlo en la etiqueta. Por ejemplo, en la fabricacin del pan utilizamos levadura. Cuando el pan se cuece la levadura queda destruida. Esa levadura destruida puede ser natural o genticamente modificada, pero nunca lo sabremos.

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8.GLOSARIO:

ANTICODON: triplete de nucletidos en el RNAt que interacciona por apareamiento de bases complementarias al codn del RNAm durante la traduccin. ANTIPARALELAS: cadenas del DNA en las que el sentido de cada una de ellas es opuesto al de la otra (5'-3' 3'-5'). CAP: estructura en el extremo 5' del RNAm que consiste en la 7' metilguanosina-pppX, donde X es el primer nucletido codificado en el DNA. cDNA: DNA copia de una RNA por transcripcin inversa. CISTRON: fragmento de un gen que codifica un determinado polipptido. CLON: poblacin celular proveniente de una sola clula. CLONADO: procedimiento por el cual se obtiene una poblacin celular (clon) a partir de una clula). Cuando esta clula es portadora de un plsmido hbrido se define como clonado molecular a la obtencin del gen amplificado del que es portador ese plsmido. CODON: secuencia de tres nucletidos que codifica un aminocido o seal de terminacin. CODON DE INICIACION: codn AUG (o GUG) que codifica el primer aminocido en una secuencia proteica: la formilmetionina en bacterias y metionina en eucariotas. CODON DE TERMINACION: codn de secuencia UAA, UAG o UGA que codifica para la conclusin de una cadena polipeptdica. El codn UAG se denomina mbar y el codn UAA: ocre. CSMIDO: son vectores sintticos que combinan caractersticas del fago lambda (que tienen los extremos cohesivos o regiones COS) con propiedades de los plsmidos. CROSSING-OVER: proceso por el cual dos cromosomas se aparean a travs de zonas de homologa e intercambian material gentico por recombinacin.

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EXON: porcin de un gen intercalada entre intrones que codifica secuencias del RNAm maduro. EXTREMOS COHESIVOS: extremos de las molculas de DNA de doble cadena constituidos por cadenas nicas complementarias y que por ello pueden aparearse y producir molculas circulares. GEN: secuencia en el DNA que codifica un producto determinado, RNA o protenas. GEN ESTRUCTURAL: gen que codifica la estructura primaria de un polipptido o la secuencia de bases de un RNA. GEN REGULADOR: gen cuyo producto regula la expresin de otros genes. GENOMA: conjunto de genes de un organismo. HIBRIDACION: procedimiento por el cual dos muestras de DNA desnaturalizadas de distinto origen y una de ellas radioactiva, son re naturalizadas para formar molculas hbridas con cadenas de ambos orgenes. INTRON: segmento de un gen intercalado entre exones que no participa en la codificacin de secuencias de RNA maduro. LINKER: segmento corto de DNA de doble cadena portador de la secuencia de reconocimiento de una nucleasa de restriccin. NTP: nuclesido trifosfato. OPERON: unidad gentica que especifica uno o varios polipptidos. Consta de un operador que regula la transcripcin del opern, de un promotor donde se inicia la transcripcin del gen o los genes estructurales que codifican al polipptido o los polipptidos, y de un terminador donde concluye la transcripcin. PALINDROME: parte de la cadena de DNA que presenta auto homologa por la presencia de dos secuencias repetidas e invertidas. POLI A: secuencia de poliadenilato en el extremo 3' de los RNAm eucariontes.

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PRIBNOW BOX: caja TATA. PRIMER: molde. Molcula de DNA o RNA que sirve como inicio en el proceso de sntesis de cidos nucleicos. PROBE: terminologa que designa a una molcula especfica de DNA, RNA, marcada radio activamente y que se utiliza para determinar la presencia de secuencias homlogas en muestras de DNA, RNA separados por electroforesis en gel o presentes en colonias bacterianas. PROMOTOR: zona al comienzo de un gen donde se inicia la transcripcin. QUIMERA: es el ADN recombinante obtenido artificialmente mediante tcnicas de manipulacin de cidos nucleicos, el cual se incluye en una cadena de ADN cromosmico o ADN plasmdico, uno o varios genes de inters. RECOMBINACION: transferencia de segmentos entre dos molculas de DNA que se han apareado por homologa de bases. REPLICACION: sntesis de DNA que utiliza un primer (molde) de DNA. RESTRICCION: corte de una molcula de DNA por enzimas denominadas endonucleasas de restriccin que reconocen secuencias especficas. RNA: cido ribonucleico. RNAm: cido ribonucleico mensajero. RNAr: cido ribonucleico ribosomal. RNAt: cido ribonucleico de transferencia. SEUDOGEN: repeticin no funcional de un gen y carente de intrones. SPLICING: terminologa que significa eliminacin de intrones en una molcula de RNA. TRADUCCION: proceso por el que el cdigo gentico contenido en una secuencia de nucletidos del RNAm es expresada en la secuencia de aminocidos de un polipptido.

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9.Bibliografa:

Bioqumica de Harper. Murray .Mayes. Granner. Rodwell. 15 Edicin. 1.999.9.1.Links

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