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Produccin de aromas por fermentacin e n medio d i d o

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0 'l'bpicos de lriuesligucidri J Posgrado 1995 IV (2): 102-1 I O9

Produccin de aromas por fermentacin en medio sblido

Pierre Christen ORSTOM (Instituto Francs de Investigacin CientriCa para el Desturollo erz Cooperacin)
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Resumen
La fermentaci6n de materias primas slidas ha sido usada desde los m s remotos tiempos para mejorar l a calidad organolptica d e los alimentos. Se ejemplifica en los alimentos tradicionales de Asia, E u r o p a y h r i c a . E n estos procesos naturales son involucrados microorganismos tan diversos como las bacterias lcticas (verduras, productos lcteos, came), algunas levaduras (pan) y varios hongos filamentosos (quesos). E n este artculo se propone presentax algunos ejemplos del u s o de microorganismos para la generacin de aromas e n medio slido. Eso incluye la produccin directa en l a materia prima, la biosntesis d e molculas especficas y la bioconversin de precursores en molculas de alto poder aromatizante. U n enfoque especial est dado a las actividades desarrolladas en es te campo, e n el marco de la cooperacin entre el ORSTOM [Francia) y el Laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico).

Palabras clave: aroma, incrooi'garzisino,fenizentaciin en nzedio slido (FMS), alinzerzto

Abstract
The fermentation of solid raw materials h a s been used for a long time to improve the organoleptic quality of food. Some examples come from tradicional fermented food in Asia, Europe and America. Many microorganisms s u c h as lactic bacteria (vegetables, dairy products, meat), some yeasts (bread) a n d various filamentous fungi (cheeses) are involved in these natural processes. In this paper are resented some examples of the use of microorganisms for the generation of aroma in solid medium. This includes t h e direct production in the raw material, the biosynthesis of specific molecules a n d the bioconversion of precursors into molecules of powerful aroma. Special interest is given to the activities developped in this field within the cooperation accords between.ORSTOM (France) a n d the Bioprocess laboratory of the Autonomous Metropolitan University (Mxico).

Key words: flavor, microorganisin, solid state ferineiztation (SSF),food

Introduccin
1 aroliia de un alimento puede ser definido como la rraccrcin voltli percibido por reccptorcs ubicados en lus losos nasalcs, miciilras que el sabor est5 percibido por receptores situados en la lengua; en tanto que hay una multitud de aromas en la naturaleza, slo existen cuatro sabores (cido, dulce, amargo y salado), a los cuales se suele agregar el picante. EI aroma tiene que ser diferenciado del aceite esencial constituido por la fraccin no voltil del alimento y que es compuesto de las molculas ms pesadas (es el caso por ejemplo del zumo de la cscara de los ctricos compuesto en gran parte de alcoholcs tcrpdnicos). Cabe mencionar que esta fraccin puede ser usada tambin como saborizanteen la industria de alimentos.
sntesis bibliogrficade los diferentes aromas observados durante cl cultivo dc microorganismos (bacterias, lcvaduras y hongos filamentosos). En el transcurso de las ltimas tres dkcadas, los enormes avances logrados en el campo de la qumica analtica (cromatografia en fase gaseosa, cromatografa lquida de alta presin y espectrometra de masa principalmente), as como la creciente demanda por parte del pblico de aditivos alimentarios naturales, han hecho resurgir el inters por la biotecnologa y su aplicacin en la produccin de aromas alimentarios. EI nmero importante de estudios bibliogrficos dedicados a este tema reflejadicho inters, por ejemplo: Latrasse etal. (1985), Gatfleld (1988), Sharpell (1988), Welsh et al. (1989), Janssens et al. (1992), Cheetham (1993), Gutirrez y Revah (1993), entre otros.

La investigacin relacionadacon la produccin de aromas por va biotecnolgica se inici hace aproximadamente treinta aos en base a observacioncs realizadas a principios de siglo por Omelianski (1922). Este autor fue el primero en realizar una
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En el campo de los aromas alimentarios, se pueden distinguir:

1) La formacin de metabolitos voltiles durante fermentaciones tradicionales como la maduracin del queso, la fermentacin
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2) Ln niodiI'ic;icititi clc diclios procccliriiicntos con cl lin dc obtener estos tnisnios aromas en tiempos ms cortos y en concentraciones mi, clevadas. Es el caso, por ejemplo, de los quesos modificados por va enzimtica.

l i n osic ;irticulo sc Iincc unarcvisi6n ilcl usodc la bivtccnolvgii cn la produccin de aromas en alirncntos a exccpci6n de las bebidas. A lin de presentar el estado del arte y las perspectivas dc cs;is aplicncioncs de In FMS, se presonlan en una primera parte, algunos ejemplos del uso tradicional de la FMS para la aroinatizacicin de los alimentos y en una segunda parte la

produccin ill vitrodecompuestos de aronias, seaporbiosntesis o por bioconversibn.

3)La biosnrcsis porccpaspurascultivadascn mediossintticos adecuados.

4) La bioconvcrsibn de compuestos iniciales (0:precursore.s) en otras molculas con propiedades aromatizantes. La fcrmcntaci6n cn medio slido (FMS), definida como el crccimicnto de niicloorganisiiios sobre medios sblidos o seniislitlos en ausencia de agua libre, ha sido aplicada desde la antigedad en la preparacin de alimentos fermentados. Aidoo er a . (1982) rcconstituyeron la historia de este proceso, desde l sus orgenes en cl Lejano Oricnte (prcparacibn del kojien China y en JapOn, dcl teiupeh en Indonesia, etc.) hasta nuestros das. EI estudio bibliogrrifico de Pandey (1992) y la compilacin de Docllc et al. (1992) prueban que esta antigua tcnica resurgi desde hace aproximadamente treinta alios. En la figura 1 est representado el dispositivo experimental comnmente utilizado para estudios a nivel laboratorio. Las investigaciones en este campo se oricntnn hacia la produccin dc nietabolitos tan diversos conio protcinas, enzimas, antibiticos o cidos orginicos. La generacin de aromas en los alimentos puede asimismo considerarse como una extensibn de la misma, debido a la utilizaci6n de clulas enteras o de enzimas microbianas.
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II. GENERACION DE AROMAS EN LOS ALIMENTOS

La produccin dearomas alimenticios se debe, en lamayora de los ca'sos, a la accin de microorganismos y/o de enzimas. Esto ha sido tenia de diversas compilacioiics (Scharpf et a 1956; ! . , Welsh et al., 1989; Christen y Lpez-Mungua, 1994).

A. Alimentos fermentados tradicionales

EI extenso estudio bibliogrfico realizado por Beuchat (1983) permite darnos cuenta de la diversidad de microorganismos implicados en el desarrollo del aroma en los alimentos fermentados tradicionales (ver tabla 1). Sin embargo, en la mayora de los casos la fermentacin d e dichos alimentos tiene conio objetivo principal facilitar su asimilacin y/o lograr una mejor conservacin de los mismos.
Elkoji, otro alimento fermentado milenario originariode Japn, preparado a base de arroz precocido al vapor en el que se siembra una cepa deAspergillus orq'zae,es igualmente utilizado conio materia prima en la preparacin del sake. Ito et al. (1990)
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Figura 1. Dispositivo experimental de la fermentadn e n medio slido. 1. BOMBA DE AIRE, 2. HUMIDIFICADOR, 3. DISTRIBUIDOR DE FLUJO, 4.TERMOREGULADOR, 5. BAO DE AGUA, 6. COLUMNAS DE FERMENTACION, 7 HUMIDIFICADORES 8. MEDIDOR DE PRESION
Tpicos de Investigacin y Posgrado
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Produccin de aromas por fermentacin en medio slido

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Ketjap (Indonesia) Kimchi (Corea) Miso (Japn, China) Pozole-(Mxico) Sufu (China) Tempeh (Indonesia) Torani (India)

Soya Legumbres Arroz, Soya Maz

Aspergillus oryzae Bacterias Icticas A. niger, lactobacilos --Levaduras y bacte Diluido, alimento base Sustituto de carne

Grano de soya

Arroz Candida, Saccharomyces Sazonador 9 _~ - - rsbia 1. Algunos ejemplos de produccibn de aromas en los alimentos fermentados tradicionales (adaptado de Beuchat, 1983).
demostraron que un gran nmero de voltiles (3 aldehdos, 5 cetonas, 8 alcoholcs y 1 stcr) sc producan durantc la fasc de crecimiento (metabolismo primario) y que la produccin de alcoholes y aldehdos se vea favorecida por una limitacin en oxgcno.

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equilibrioentrelosdiferentescompuestosdel aroma. Seobtienen de esta manera quesos de sabor y texturas difcrentcs.

Otro ejemplo es el beiju, masa de yuca fermentadanaturalmente originaria de la regin de Maranho en Brasil. Pastore et al. (1994) aislaron de este alimento varias cepas de Neurospora sp. por los agradables olores a fruta que producen los cultivos. Pudieron evidenciar en el headspace del cultivo ms de 10 --compuestos, entre los cualesdestacan al acetato de etilo, el 3metil-l-butanol y el hexanoato de etilo.

B. Quesos
Los quesos constituyen otro campo en el que la FMS fue aplicada con Cxito en la produccin de aromas. La leche, despus de haber sido sometida a los procedimientos de cuajamiento y de desuerado sc transforma en requesn, pasta con caractersticas fisicoqumicas adecuadas (contenido de agua, pH, contcnido de sales, dc lactosa, de grasa, etc.), que permiten que se lleve a cabo la maduracin, etapa en la que interviene un gran nmero de microorganismos y de enzimas. Durante esta ltinia etapa son liberados, por liplisis, los cidos .-grasos precursores de los agentes aromticos: meti1 cetonas, l cidos grasos voltiles, steres, etc. (Lenoir et a . 1985). Los . conocimientos adquiridos en este campo han permitido desarrollar estrategias para la produccin de esos aromas en el queso, gracias al estricto control de las condiciones de maduracin, adicin de enzimas y/o de microorganismos (Fernndez-Garca,1986;Seitz, 1990).Esta tecnologia, utilizada desde hace aproximadamente quince aos para la obtencin de aromas o de concentrados de queso naturales, puese aplicarse de dos maneras:

2) En base a quesos jvenes, y despus de agregar agua y de agitar lamczcla, formando una pastaen la yucsc incorporan las enzimas (proteasas, lipasas) o microorganismos de mancra secuencial. Despus de un tiempo de incubacin adecuado y bajo condiciones de temperatura y pH controlados, las enzimas y los microorganismos se desactivan por calentamiento. La concentracin de aromas del producto final puede llegaraser 20 veces superior ahconcentracin del producto tradicional y esto puede lograrse en perodos reducidos. Este proceso se estudi . de manera particularen relacn con la produccin de aromas tipo Bleu-(King y Clegg, 1979; Revah y Lebeault, 1989).Los avances obtenidos fueron posibles gracias a la elucidacin de las vas de sntesis de dichos compuestos (Kinsella y Hwang, 1976). El papel de los hongos filamentosos en el desarrollo de estos aromas es primordial (ver tabla 2).
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C. Otros alimentos
Lain tervencindemicroorganismosen cl desarrollo o la eliminacin de substancias de aromas no se circunscribe nicamente a los alimentos anibamencionados.Por ejemplo,Bigelis (1992)reporta la utilizacin de cepas de Aspergillus y de Penicilliunl con el propsito de desarrollar el. aroma de ciertos alimentos salados (en . particular jamones y salchichones). Nomura et a . (1987) l demostraron, mediante la utilizacin de bacterias acticas, que era posibleeliminarel n-hexanal (quedaunanotaverdedesagradable) de ciertos alimentos como la leche de soya o la masa para pan. Finalmente, el empleo de una cepa de Aspergilliis niger puede representar una alternativa para la fermentacin de residuos de vainas de vainilla. Durante esta fermentacin, A. niger libera enzimas (principalmente b-glucosidasas) que hidrolizan Ia ghcovanilina y liberan de estamanerala vanilina activa (Pouget et al., 1990).Si tomamos en cuenta el alto costo de lavainillanatural, el inters econmico de este proceso es obvio.
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1) Modificando la tecnologa tradiciqnal agregando a la leche o al requesn enzimas especficas con cl fin de alterar el

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III. SINTESIS DE NOVO DE AROMAS POR FMS

La investigacidn realizada en este campo es relativamente reciente y se han publicado hasta la fecha pocos trabajos. Existe sin embargo un intcrds real por la ulilizacidn de la FMS en la
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Hongos Filatnentosos
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Compuestos

Quesos

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Peizicellium roqueforti Aspergillus oiyzae Peniclllrrrn caseicolwn

Mctil cetoilus 2-pentanol, l-octano-3-01 H2S, metil mercaptan, dimetil sulfito Nucletidos cidos

Bleu Bleu Camembert Queso blanco

Ciertos microorganisinos (tales como los hongos filamentosos) rcgistran un mayorcrccimicnto, ascoino una mayor produccin de metabolitos en FMS (Doclle et al., 1992). Larecuperacin de los voltiles en el gas de aeracin a la salida del reactor resulta ms fcil que en la fermentacin en medio lquido (FML). Estos compuestos, extrados ms fcilmente del medio de cultivo, no se acumulan en el reactor y por lo tanto la inhibicin que pueden provocar en FML desaparece.

ORSTOM (Christen et al., 1994a; Christen eral., 1995a). En la figura 2 se presentan dos cromatogramas obtenidos cultivando esta cepa en un matraz Erlenmeyer con y sin limitaciones de oxgeno. Se puede ver que la aeracin influye principalmente sobre las cantidades relativas de cada compuesto. En la figura 3 est ilustrada la evolucin de algunos compuestos voltiles cn cl cspacio dc cabcza o hcadspacc dc u n cultivo dcl mismo hongo cultivado en un matrazErlenrncyer sobre bagazo de yuca. Se observ que la produccin de estos compuestos est directamente ligada al crecimiento y est rellejada en el intenso aroma a pltano observado al momcnto de mayor produccin (alrededor del cuarto da). Este aroma se debe en gran parte a la presencia del acetato de amilo, derivado del metabolismo de la leucina previamente agregada al medio.
Existen otros ejemplos de la misma indole. Yamauchi er al. (1989) lograron producir con xito un aroma afrutado intenso mediante el cultivo de una cepa de Neurospora sobre arroz pregelatinizado. El arroz fermentadode esta manera, enriquecido en substancias de aromas (principalmente en etil caproato y alcohol isoamlico) y liberado de la biomasa puede ser posteriormente utilizado como basc para la elaboracin de u n sake ms afrutado.

A. Biosintesis en el sentido estricto

La produccidn dc aromas cn medio shlido dcpendc dc varios factores, entre los cuales dcstacan, por su importancia, la actividad del agua y el cstado fisiolgico del cultivo (o su edad). Gervais et a .( 1988)y postcriormente Gcrvais y Sarrette (1990) l lo dcmostraron cn cl caso dc la elaboracidn dc 2-hcptanona (cetona que interviene en la composicin del aroma a queso) producida por Triehodenna viride sobre agar-agar. Otro factor importantees lacomposicin del mediodecultivo y en particular las fuentes de nitr6geno y de carbono. Sastry et al. (1985) demostraron que la produccin de un aroma con un olor a coco (6-pentil-a-pirona) se vca estimulada cuando se cultivaba Trichoderrun viride sobre agar-agar agrcgando cxtrocto dc zanahoria o de papa. Christcn y Raimbault (1991) scalaron la importancia dc las proporciones de cada compuesto en la produccidn de aronias afrutados por Ceratocystis fitubriara, cultivadoen medio lquido. Lainfluenciadirectade la naturaleza de la fuente de carbono o de nitrgeno en los diferentes aromas producidos por este hongo fue demostrada en diversos trabajos realizados en el Laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Autnoma Metropolitana, Iztapalapa, en colaboracidn con el
Tpicos de Investigacin y Posgrado

Hadar y Dosoretz (1991), en un cstudio bibliogrrifico reciente, informan acerca de las potencialidades del cultivo de hongos filamentosos y de hongos superiores para la produccindel aroma caracterstico a hongo, el l-octeno-3-01. Asimismo, establecen que, en este caso, el cultivo sumergido es ms atractivo por ser ms rpido y ms econmico. En relacin a la FMS, es posible considerar que sta se asemeja a la tcnica que emplea clulas inmovilizadas. Existcn algunos ejcmplos de producci611 dc aromas mediante este procedimicnto. Cavin er a. (1985) producen en proceso continuo aromas de queso tipo Emmenthal a partir de clulas d e Propionibacteriu)n sp. inmovilizadas en un gel de alginato; tambin obtienen concentraciones de cidos grasos voltiles de Zg/l y p r d u c e n 4.lo9 clulas/l gel-h. Asimismo, Larroche et al. (1989) y Creuly et al. (1990) aplicaron esta tcnica para la produccin de metil cctonas a partir de esporas de

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Produccin de gomas por fermentacih en medio sdlido 1. .........._.............................................................................................................................................................*..................................... ......

B. Bioconversin
Otra alternativa es la bioconversi.n, es decir, la produccin dc .substnncins de aromas a partir de precursores transformadosporva+zimtica o microbiana; En lo que se rcficrc a los aromas, compuestos voltiles por naturaleza, existe un inters evidente por llevar a cabo las reacciones en medio gaseoso, en particular con el fin de,evitar la inhibicin que resulta de la acumulacin del producto sn el reactor. Este es el caso de la oxidacin enzimka del etanol en fase gaseosa (Barzana ht al., 1989).Lareaccin secatalizapor unalcohol-9xidasa inmovilizado sobreun soporte polimrico y cl acetaldehdo que se forma es recuperado a la,salida.

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Otro ejemplo eslaconversin del etanol en acetaldehdo y en acetato de etil0: dos substancias ut,ilizadas como agentes aromatizantes en la industria alimentaria. ,Esta tcnica, Figura 2. Croniatogramas del headspacel de un cultivo de 48 horas aereado actualmente estudiada en el (A) y terreado (B) de Ceratocystis Jfinibriata crecido sobre bagazo de caa Laboratorio de Bioprocesos de la complementado con un medio nutritivo (glucose=200) g/l). UAM en colaboracin con el Los picos corresponden a li acetaldehdo, 2: etanol, 3: 2-propano& 4: ;ORSTOM, utiliza la levadura propanol, 5: acetato de etilo, 6: 1-butanol, i: propionato de etilo, 8: alcohol Candida utilis cultivada sobre isoamlico, 9: desconocido, 10: acetato de isobutilo. ll: desconocido, 12: bagazo de caa de azcar al que acetato deisoamilo, 13: desconocido, 14: acetato de n-amilo. se agrega una solucin de sales Fuente: Christen P., J. C. Meza y S. Revah, 1995. ikfemorias de 20. Congreso minerales. Las primeras pruebas Internacional de Fermentacin en Medio Slido, 27-28 de febrero, Montpellier, demostraron Ia capacidad de a Francia levadura de crecer sobre diferentes soportes (Christen et ~enicilliunz roqueforti. Estos tres artculos concluyen al., 1993), utilizando el etanol como nica fuente de carbono que los resultados obtenidos son alentadores para una (Christen et al., 1994b, Christen et al. 1995b). LOS voltiles aplicacin industrial. producidos son condensados alasalidadel reactor. Otro proceso, inspirado en laF!MS clsica, que utiliia bacterias inmovilizadas Por su parte, Omata er al. (1981) llevaron a cabo, mediante en un biofiltro puede ser aplicado aladescontaminacin del aire clulas de Rkodotorula minuta inmovilizadas, la produccin (Auria et al., 1993). continua de L-mentol a partir de una mezcla racmica natural de succinato DL-mentol con rendimientos de conversin del Humphrey et al. (1990) demostraron la factibilidad a escala 100%. industrial de la bioconversin de grasade coco en metil cetonas. En este caso, el substrato es fijado por absorcin en las fibras de Existe por otra parte un gran nmero de patentes registradas celulosa e inoculado con esporas de Aspergi&rs rriger. La por empresas japonesas, relacionadas con la separacin %ezcla .de metil cetonas es. posteriormente .recuperada por purificacin de L-mentol por microorganismos o enzimas destilacin de la matriz. Sode et al: (1989) proporcionan otro (Schindier y Schmid, 1982). ejemplo. Dichos,autores estudiaronla conversin de la B-ionona, .<

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13. Bioconversi611
Otra alternativa es la bioconversi6n, es decir, la produccihn dc substancias dc aromas a partir de precursores transformados por va enzimtica o microhicina. En lo quc sc rcf'icrc a los aromas, compuestos voltiles por naturaleza, existe un inters evidente por llevar a cabo las reacciones en medio gaseoso, en particular con el fin de evitar la inhibicin que resulta de la acumulacin del producto en el reactor. Este es el caso de la oxidacin enzimitica del etanol en fase gaseosa (Barzana et al., 1989).Lareaccin secataliza por un alcohol-oxidasa inmovilizado sobre un soporte polinidrico y cl acetaldehdo que se forma es recuperado a la salida. Otro ejcmplocs laconversin del etanol en acetaldehdo y en acetato de etilo, dos substancias utilizadas como agentes aromatizantes en la industria ....................................................................................................................................................................................................................... alimentaria. Esta tcnica, Figura 2 Cromatogramas del "headspace" de un cultivo de 48 horas aereado actualmente estudiada en el . (A) y cerreado (B) de Ceratocystisfimbriata crecido sobre bagazo de caa Laboratorio de Bioprocesos de la complementado con un medio nutritivo (glucose=200)g/l). UAM en colaboracin con el Los picos corresponden a 1: acetaldehdo, 2: etanol, 3: 2-propanol, 4: 1- ORSTOM, utiliza la levadura propanol, 5: acetato de etilo, 6: l-butanol, 7: propionato de etilo, 8: alcohol Catidida utilis cultivada sobre isoamlico, 9: desconocido, 10: acetato de isobutilo, 11: desconocido, 12: bagazo dc caria dc azcar al que acetato de'isoamilo, 13: desconocido, 14: acetato de n-amilo. sc agrega una solucin de sales Fuente: Christen P., J. C. Meza y S. Revah, 1995. Memorias d e 20. Congreso mineralcs. Las primeras pruebas Internacional de Fermentacin en Medio Slido, 27-28 de febrero, Montpellier, demostraron la capacidad de la Francia levadura de crecer sobre diferentes soportes (Christen e l al., 1993), utilizando el etanol como nica fuente de carbono Peri ici11iiirit roquefo rti. Est os tres art c u1os conclu y en (Christen et al., 1994b, Christen et al. 19956). Los voltiles que los resultados obtenidos son alentadores para una producidossoncondensados a lasalidadel reactor. Otro proceso, aplicacin industrial. inspiradoen IaFMS clsica, que utiliza bacterias inmovilizadas en un biofiltro puede ser aplicado a la descontaminacin del aire Por su parte, Omata et al. (1981) llevaron a cabo, mediante l, (Auria et a. 1993). clulas de Rkodotorula niirtuta inmovilizadas, la produccin continua de L-mentol a partir de una mezcla racimica natural Humphrey et al. (1990) demostraron la I'actibilidad a escala de succinato DL-mentol con rendimientos de conversin del industrial dela bioconversin de grasa de coco en metil cetonas. 100%. En este caso, el substrat0 es fijado por absorcin en las fibras de celulosa e inoculado con esporas de Aspergillus niger. La Existe por otra parte un gran nmero de patentes rcgistradas por empresas japonesas, relacionadas con la separacin ' mezcla de metil cetonas es posteriormente recuperada por destilacin de la matriz. Sode et al. (1989) proporcionan otro purificacin de L-mentol por microorganismos o enzimas ejemplo. Dichos autores estudiaron la conversin de la -ionona, (Schindler y Schmid, 1982).
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O Tpicos de Investigacin y Posgrado, junio de 1995 Vol. IV No. 2pp:102-109

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