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ANLISIS PROSPECTIVO DE ADN MITOCONDRIAL Y ADN NUCLEAR EN MUESTRAS HUMANAS DEL SITIO FORMATIVO CEMENTERIO REGIMIENTO CHORRILLOS DE CALAMA

1 . Mauricio Moraga 2 , Juan Venegas 3 , Catherine Westfall 4 y Carlos Gonzlez 5 RESUMEN Se presentan los resultados de estudios preliminares de biologa molecular, especficamente de ADN Mitocondrial y ADN Nuclear, realizados en dientes y huesos de una acotada muestra de individuos pertenecientes a poblaciones formativas (850-190 AC) del Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama, en la Regin de Antofagasta. Palabras claves: ADN Mitocondrial, ADN Nuclear, sitio funerario, perodo Formativo, regin de Antofagasta. ABSTRACT The results of preliminary molecular biology research specifically Mitochondrial DNA and Nuclear DNA- carried out on small, pre-Columbian bone and teeth samples of individuals pertaining to the Formatives periods Cementerio Regimiento Chorrillos site (800-200 BC) in Calama, are presented. Keys words: Mitochondrial DNA, Nuclear DNA, funerary site, Formative Period, Northern Chile. Introduccin El rescate arqueolgico el ao 2005 del Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama (ver figuras 1 y 2), dentro de un terreno de la Divisin Codelco Norte, permiti recuperar 353 individuos de 256 fosas, implementndose variados registros y estudios (Gonzlez y Westfall 2006, Westfall y Gonzlez 2005); entre los ltimos un anlisis bioantropolgico de los restos esqueletizados (Reyes 2005). Junto con documentar las caractersticas antropolgico-fsicas de los individuos, posibilitando a futuro comparaciones y distinciones respecto a poblaciones cercanas (eg. Chiu-Chiu, San Pedro de Atacama), se efectu un anlisis preliminar de biologa molecular sobre una acotada muestra del universo osteolgico y dental del sitio, ya que este tipo de estudios estn escasamente representados en la Regin de Antofagasta 6 . De esta manera, y con el objeto de conocer las caractersticas filogenticas y posibles relaciones de parentesco entre algunos individuos del cementerio, fechado por C14 AMS entre 850-190 AC, dentro del Perodo Formativo, se procedi al anlisis de DNA mitocondrial y nuclear de muestras seas y piezas dentales de 11 individuos del sitio. Asimismo, otro de los

Proyecto de Rescate Arqueolgico inserto en el Sistema de Evaluacin de Impacto Ambiental (SEIA), financiado por Divisin Codelco Norte, de la Corporacin Nacional del Cobre (Codelco). 2 Doctor en Ciencias, Programa de Gentica, Fac. Medicina, Universidad de Chile, Stgo; mmoraga@med.uchile.cl 3 Doctor en Ciencias, Programa de Biol. Cel. Mol., ICBM, Lab. Parasitologa Bsico-Clnico, Fac. Medicina, Universidad de Chile, Stgo.; jvenega@med.uchile.cl 4 Arqueloga-Taguatagua Consultores, Casilla 234, Correo de Paine, Paine, Regin Metropolitana; catiwestfall@yahoo.es 5 Arquelogo-Taguatagua Consultores, Casilla 234, Correo de Paine, Paine, Regin Metropolitana; inkacarlitos@yahoo.es
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Slo se tiene referencia de trabajos recientes sobre Leishmariasis en poblaciones prehispnicas de San Pedro de Atacama, realizados por M. A. Costa y colaboradores (Barrera com. pers. 2007).

objetivos del anlisis fue comparar el rendimiento obtenido de huesos en excelente estado de conservacin versus muestras de dientes de los individuos. Metodologa Anlisis de DNA mitocondrial (mtDNA). Para llevar a cabo este tipo de estudios, se procedi a la pulverizacin de las muestras mediante un molino especial y posterior extraccin del DNA, de acuerdo a protocolos anteriormente descritos en la literatura (Moraga et al. 2005). Una vez purificado el DNA, se procedi a la amplificacin mediante PCR de distintos segmentos del DNA mitocondrial, usando partidores especficos ya descritos (Moraga et al. op. cit.). Luego de obtenidos los productos de PCR, se procedi a la digestin de cada uno de ellos, mediante enzimas de restriccin. Digestin con la enzima HaeIII define el haplogrupo A. Ausencia de digestin con las enzimas HincII y AluI, definen la pertenencia a los haplogrupos C y D, respectivamente. Por su parte, El haplogrupo B est definido por la presencia de una delecin de 9 pb en la regin intergnica V del mtDNA, la que se detecta directamente mediante PCR (Ibd.). Anlisis de marcadores nucleares (microsatlites) en muestras de DNA antiguo. Los microsatlites son secuencias repetitivas cortas del DNA nuclear, la mayora de ellas ubicadas en regiones no codificantes, cuyos largos pueden oscilar entre 10 y 300 nucletidos, y altamente polimrficos (Weber y May 1989, Bowcook et al. 1994). Dado el alto polimorfismo de los microsatlites, es decir, que para un determinado microsatlite pueden existir un alto nmero de alelos dentro de una misma especie, permite que estos marcadores sean muy tiles para establecer relaciones de parentesco, entre individuos de una misma poblacin. En otras palabras, el estudio de microsatlites permite con una alta probabilidad definir s un determinado individuo es hijo o no de otro individuo. Tambin, por el alto grado de polimorfismo, son muy tiles en estudios filogenticos de poblaciones genticamente muy cercanas, pertenecientes a una misma especie (Bowcook et al. op. cit.). Sin embargo, debido al hecho que estos marcadores son monocopias en el genoma, son menos sensibles que la deteccin de DNA mitocondrial. Otros problemas que presentan los microsatlites son las "stutter bands" o "bandas tartamudas", que se originan por deslizamiento de la DNA polimerasa cuando est produciendo la amplificacin de los DNA en la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Weber y May op. cit., Hagelberg y Clegg 1991). Estas bandas "tartamudas" pueden en ocasiones dificultar la identificacin de una seal verdadera, pues aparecen como varias bandas de un tamao similar a la banda real (Hagelberg y Clegg op. cit.). Por tal motivo, para identificar claramente la seal verdadera es necesario realizar varias repeticiones a distintas temperaturas de "annealing" para optimizar la seal real. Otro problema, que puede originar falsos positivos u ocultar la seal real, es la sntesis de DNA independiente de DNA molde o templado (Clark 1988). Esto tambin se puede superar, realizando varias repeticiones a distintas temperaturas de "annealing". Es importante destacar que la gran mayora de los estudios de DNA antiguo usando microsatlites, se han realizado en poblaciones europeas (Weber y May op. cit.; Bowcook et al. op. cit., Zierdt et al. 1996, Burger et al. 1999, Schemerer et al. 1999). En la actualidad existe muy poca informacin de anlisis de restos arqueolgicos humanos de poblaciones precolombinas, mediante el uso de microsatlites. Segn nuestras informaciones, hasta hoy el nico artculo en el cual se han usado estos

marcadores nucleares, para determinar relaciones de parentesco entre una posible madre y un posible hijo en muestras arqueolgicas latinoamericanas, corresponde al trabajo de Lleonart y colaboradores (1999), quienes de los nueve marcadores usados, obtuvieron escasos resultados reproducibles y varios de ellos con productos de pequeo tamao. Lamentablemente, estos investigadores no proporcionan ninguna foto de los resultados. Para la deteccin de microsatlites en muestras de DNA antiguo del sitio Chorrillos, se eligieron los marcadores VWA y LPL, pues de acuerdo a la literatura estos marcadores han presentado un mejor rendimiento (Zierdt et al. op. cit., Takahashi et al. 1997). Se seleccionaron dichos marcadores, pues datos de la literatura han demostrado que existe una buena correlacin entre el largo de los marcadores y la sensibilidad (Hoff-Olsen et al. 2001, Takahashi et al. op. cit.). Es decir, a mayor largo de los marcadores, menor sensibilidad. Por tal motivo, se seleccionaron dos marcadores cuyo producto de amplificacin no superara los 200 pares de bases (pb). La extraccin y purificacin de DNA antiguo total se realiz tal como fue descrito anteriormente para el anlisis de mtDNA (Moraga et al. 2005). Las amplificaciones mediante PCR se realizaron con 2l de cada muestra, usando condiciones similares a las publicadas en la literatura (Takahashi et al. op. cit.), y de acuerdo al siguiente protocolo: a) Pre-PCR 94 oC/5min; b) 32 ciclos a 94 oC/1 min, 60 oC/1min y 72 oC/1 min; y c) post-PCR 72 oC/10 min. Lo nico que se modific en estos protocolos, fue la temperatura de hibridizacin de los partidores, "temperatura de annealing", indicada en la Tabla 2. Una vez amplificadas las muestras, fueron analizadas en geles de poliacrilamida al 15%, teidos con nitrato de plata, de acuerdo a condiciones descritas (Takahashi et al. op. cit). Resultados Anlisis de DNA mitocondrial (mtDNA) Como se observa en la Tabla 1, de los 11 individuos analizados, slo en 4 de ellos se pudo obtener amplificacin de las muestras y realizar una posible clasificacin a partir de los cuatro grupos descritos para las poblaciones indoamericanas (Horai et al. 1993, Torroni et al. 1993, Easton et al. 1996, Santos et al. 1996, Moraga et al. op. cit.). Debido a la deficiente calidad y cantidad de las muestras de DNA aislados, slo uno de estos individuos fue claramente identificado como perteneciente al haplogrupo B (muestra 0503). A pesar que las otras tres muestras no pudieron ser totalmente clasificadas, los anlisis permitieron establecer que: una de ellas no pertenece al haplogrupo B ni D (muestra 0203); otra no pertenece al haplogrupo B (muestra 1101); y la tercera no pertenece al haplogrupo D (muestra 0301). Aunque la no pertenencia sugiere la probabilidad que el individuo de la muestra 0203 podra corresponder al haplogrupo A o C, no se puede descartar que este individuo pudiera pertenecer a otros grupos minoritarios, tambin descritos en poblaciones indoamericanas antiguas (Torroni et al. op. cit., Baillet et al. 1994, Easton et al. op. cit.); aunque en la mayora de los casos, estos otros grupos corresponderan a poblaciones aborgenes de Norteamrica (Smith et al. 1999). De acuerdo a los datos de antigedad de los restos arqueolgicos aqu analizados, 850190 aos antes de Cristo, sumado a su ubicacin geogrfica, se estima que un porcentaje superior al 30% de la poblacin pertenecera al haplogrupo B, sobre la base de lo descrito anteriormente en la literatura (Santos et al. op. cit., Moraga et al. 2000, Moraga et al. 2005). Por lo tanto, resulta extremadamente interesante que nuestros resultados

preliminares muestran un individuo de cuatro perteneciente al haplogrupo B (25%), pudiendo ser mayor en el caso que el individuo 0301 fuese B. Debe destacarse que el rendimiento en la extraccin y amplificacin de DNA desde muestras antiguas es extremadamente variable, dependiendo entre otros factores de las condiciones de temperatura y humedad del lugar de las inhumaciones, as como de la salinidad, acidez y permeabilidad del suelo. De todas formas, los restos conservados por desecacin, como es el caso de estas muestras, generalmente tienen rendimientos cercanos al 20% para DNA mitocondrial y raras veces rinden amplificados para secuencias nucleares. Por lo mismo, para haber accedido en mayor detalle al conocimiento de las relaciones filogenticas de esta poblacin, habra sido necesario analizar un mayor nmero de muestras, aumentado la probabilidad de obtener extractos de DNA amplificables. Sin embargo, a pesar de dichas limitaciones, es significativo que este Proyecto permiti una fructfera interaccin multidisciplinara, avanzando desde una perspectiva cientfica integrativa en un mayor conocimiento de estas poblaciones prehispnicas. Anlisis de marcadores nucleares (microsatlites) en muestras de DNA antiguo La Tabla 2 muestra el resumen de todos los anlisis del marcador microsatlite VWA de los restos de los once individuos procedentes del rescate arqueolgico del Cementerio Chorrillos de Calama. Como se puede observar en dicha Tabla, slo una muestra fue consistentemente amplificada en los cinco experimentos realizados (0701). Esta muestra procede de un molar, que no arroj amplificacin de mtDNA. No obstante, la amplificacin por PCR origin un conjunto de productos, los cuales no son fcilmente adjudicables a alguno de los alelos previamente descritos en la literatura (ver Fig. 3, carril 5), cuyos tamaos oscilaron entre 126 y 170 pares de bases (Zierdt et al. 1996, Goodwin et al. 1999), y como se aprecia para el DNA moderno en esta misma figura (carril 9). Este hecho, y la situacin que se hayan originado varios productos de amplificacin, no permiten descartar que dichos perfiles sean productos de amplificaciones artefactuales, siendo muy comn en este tipo de muestras originadas por una extensiva degradacin y modificacin qumica del DNA durante el tiempo que los restos permanecieron enterrados, tal como ha sido descrito para otros casos (Hss et al. 1996, Lindahl 1997, Burger et al. 1999). Sin embargo, el hecho que sostenidamente esta muestra haya originado productos de amplificacin, sugiere fuertemente que existen trazas de DNA nuclear antiguo susceptibles de ser amplificados en forma especfica. Empero, para cumplir este objetivo, se requerira buscar nuevas condiciones de amplificacin que lograran aumentar los productos especficos por sobre los productos artefactuales, situacin que demandara una mayor cantidad de muestra disponible actualmente 7 . Los productos de pequeo tamao observado en todos los ensayos, incluso en la reaccin sin DNA (carril 2), corresponderan a oligomeros generados por los mismos partidores. Las otras muestras que presentaron dos o ms amplificaciones (ver Tabla 2), provienen tanto de tejido seo como de piezas dentales (0401, 0501, 0503, 0601, 0801,0803 y 1101). Esto sugiere que dichos productos de amplificacin seran artefactuales, debido a causas anteriormente mencionadas (Hss et al. op. cit., Burger et al. op. cit.).

La replicacin sostenida del proceso de amplificacin va gastando la muestra original, haciendo necesario contar con nuevas porciones de la misma para cada ensayo realizado.

Finalmente, para dilucidar todas estas interrogantes, y determinar si realmente podemos amplificar alguno de estos marcadores nucleares en esta poblacin prehispnica, indoamericana, de Calama, sera necesario analizar un mayor nmero de muestras, especialmente derivadas de piezas dentales, debido a que tanto nuestros resultados como estudios anteriores, comprueban que el DNA antiguo se preserva en mejores condiciones en dichos tejidos (Zierdt et al. op. cit) 8 . Todas las muestras descritas en la Tabla 1, fueron tambin analizadas con el marcador LPL (Takahashi et al. 1997), aunque los resultados fueron muy poco reproducibles, no utilizndose en el posterior anlisis de las muestras. Conclusiones En trminos arqueolgicos y sobre la base de los anlisis realizados, podemos sealar que, a pesar del reducido nmero de muestras, se obtuvieron interesantes resultados para ADN mitocondrial, que permitirn en el futuro realizar comparaciones con reas cercanas. Posiblemente, la baja frecuencia del haplogrupo B est vinculado a lo que Rothhammer y colaboradores (1989: 405; Rothhammer y Silva 1989, 1992, Rothhammer et al. 2002, citados en Moraga et al 2005), llaman una tercera corriente migracional, proveniente del altiplano meridional (Bolivia), la que habra tenido lugar entre 1000 y 500 aos AC. Por el momento, existe una carencia de estudios de ADN mitocondrial en otros sitios funerarios formativos de la localidad de Calama (Topater, Villa Chuquicamata), Loa Medio (Chiu-Chiu), Loa Inferior (Quillagua) y oasis circumpuneos (San Pedro de Atacama), lo que impide contar con contextos comparativos provenientes de la biologa molecular. Asimismo, la mayora de los estudios antropolgico-fsicos de la Regin de Antofagasta, estn referidos a contextos cronolgico-culturales anteriores, del Perodo Arcaico (Cocilovo et al. 2005), como posteriores de los perodos Medio e Intermedio Tardo (Costa 1988, Costa y Llagostera 1994, Torres-Rouff et al. 2005). Por lo tanto, nuestro trabajo representa un primer esfuerzo para conocer la constitucin gentica y el modo de vida de las poblaciones formativas del Loa Medio, usando este tipo de metodologas, siendo adems el segundo intento a nivel sudamericano de anlisis de ADN nuclear antiguo, despus del trabajo de Lleonart y colaboradores (1999) en Cuba. Por otra parte, los resultados preliminares del anlisis de ADN nuclear son extremadamente importantes, debido a la probabilidad que la muestra 0701, proveniente de un infante encontrado con dos colgantes laminares de oro, realmente posea ADN nuclear amplificable. Esto permitira conocer algunos marcadores de microsatlites, con el objetivo de establecer posibles relaciones de parentesco entre distintos individuos del sitio arqueolgico y, de esta manera, conocer ms sobre su origen. En esta direccin, se requerirn ms estudios de las mismas muestras y de otros individuos del sitio arqueolgico, sobre todo de piezas dentales, que preservan mejor el ADN antiguo. Justamente, la escasez de estudios de ADN nuclear en muestras arqueolgicas y la dificultad en poder obtener ADN nuclear amplificable, por la multiplicidad de factores que degradan a esta molcula durante el largo tiempo que permanece en el ambiente, reviste al estudio realizado en el presente Proyecto de una gran relevancia, marcando un precedente gentico y arqueolgico. En consecuencia, y an siendo pequea la muestra del Cementerio Regimiento Chorrillos, permite vislumbrar interesantes resultados en el
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Sin embargo, no tenemos explicacin del por qu se conserv mejor el material gentico en un diente de leche, de menor tamao, que en uno permanente de un individuo adulto.

marco de futuros estudios genticos de ADN mitocondrial y nuclear en diversas poblaciones prehispnicas formativas de la Regin de Antofagasta. Bibliografa Bailliet, G., F. Rothhammer, F. Carnese, C. Bravi y N.O. Bianchi 1994. Founder mitochondrial haplogroups in Amerindian populations. American Journal of Human Genetics 55: 27 33. Bowcook, A.M., A. Ruiz-Linares, J. Tomfohrde, E. Minch, J. R. Kidd y L. L. CavalliSforza 1994. High resolution of human evolutionary trees with polymorphic microsatellites, Nature 368: 455457. Burger, J., S. Hummel, B. Herrmann y W. Henke 1999. DNA preservation: a microsatellite-DNA study on ancient skeletal remains. Electrophoresis 20: 1722-1728. Clark, J. M. 1988. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Research 16: 9677-9686. Cocilovo, J., H. Varela, M. A. Costa-Junqueira y S. Quevedo 2005. Los Pescadores Arcaicos de la Desembocadura del Ro Loa (Norte de Chile): El Sitio Caleta Hueln 42. Chungara 37 (1): 5-20. Costa, M. A. 1988. Reconstitucin fsica y cultural de la poblacin tarda del cementerio de Quitor 6 (San Pedro de Atacama). Estudios Atacameos 9: 99-126. Costa, M. A. y A. Llagostera 1994. Coyo 3: Momentos finales del Perodo Medio en San Pedro de Atacama. Estudios Atacameos 11: 73-107. Easton, R., D. A. Merriwether, D. Crews y R. Ferrell 1996. MtDNA variation in the Yanomami: evidence for aditional New World founding lineages. American Journal of Human Genetics 59: 213225. Gonzlez, C. y C. Westfall 2006 En prensa. Cementerio Regimiento Chorrillos de Calama: Testimonios Funerarios Formativos en el Loa Medio, Regin de Antofagasta. Actas del XVII Congreso Nacional de Arqueologa Chilena, Valdivia. Goodwin, W., A. Linacre y P. Vanezis 1999. The use of mitochondrial DNA and short tandem repeat typing in the identification of air crash victims. Electrophoresis 20: 1707-1711. Hagelberg, E. y J.B. Clegg 1991. Isolation and characterization of DNA from archaeological bone. Proc. R. Soc. Lond. B. 244: 45-50. Hoff-Olsen, P., S. Jacobsen, B. Mevag y B. Olaisen 2001. Microsatellite stability in human post-mortem tissues. Forensic Sci. Inter. 119: 273278 Horai, S., R. Kondo, Y. Nakagawa-Hattori, S. Hayashi, S. Sonoda y K. Tajima 1993. Peopling of the Americas, founded by four major lineages of mitochondrial DNA. Molecular Biological Evolution 10: 23 47. Hss, M., P. Jaruga, T. H. Zastawny, M. Dizdaroglu y S. Pbo 1996. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Research 24: 1304-1307. Lindahl, T.

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Figura 1. Calama en la Regin de Antofagasta. Figura 2. Ubicacin en Calama

Tabla 1

Tabla 2

Figura 3 (fotografa de bandas de ADN mitocondriales).

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